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生育与不育男性精子顶体反应释放的顶体酶活性比较
目的 比较生育与不育男性精子顶体反应释放的顶体酶活性,以此来评价精子顶体反应.方法 30例不育男性和10例健康生育男性精液,用Percoll密度梯度分离法优选精子,FITC-PSA荧光染色法分析AR;用分光光度比色法测定顶体酶活性.结果 少精子症组、弱精子症组和畸形精子症组精子顶体反应率和顶体反应释放的顶体酶活性均明显低于生育组(P＜0.05),前3组中顶体反应率和顶体反应释放的顶体酶活性以畸形精子症组低,但不育各组间比较均没有明显差异.将顶体反应释放的顶体酶活性与其相应的顶体反应率进行相关分析,两者存在明显正相关关系(P＜0.001).结论 用顶体反应释放的顶体酶活性可以评价精子顶体反应功能.
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人精子甘露糖受体表达与顶体反应的关系
目的研究人精子的甘露糖受体(MR)表达与顶体反应的关系,以探讨体外获能培养精子的MR表达是否为人精子获能的标志.方法将上游法收获的活精子在获能培养基BWW中进行体外获能培养后,加入小鼠透明带溶解液(mZPS)诱导人精子顶体反应,精子悬液用异硫氰酸荧光素标记的甘露糖基化牛血清白蛋白(FITC-DMA)为探针标记MR,用豌豆凝集素(PSA)法检测顶体反应.结果体外获能培养人精子的MR表达率与mZPS诱导的顶体反应率无相关性.结论体外获能培养精子的MR表达可能不是人精子获能的标志.
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卵丘细胞及胞外基质诱发中国仓鼠精子顶体反应
为了探讨中国仓鼠(CHA)卵丘细胞及其胞外基质(COM)和细胞外基质(ECM)对精子获能、顶体反应(AR)和受精能力的作用,以及COM中何种因子影响上述受精环节,分别采用阿利新蓝8 GX法和放射免疫法(RIA)测定COM中糖胺多糖(GAG)总量和孕酮(P4)含量,并以精子穿卵试验(SPA)评价精子的受精能力.结果表明:CHA精子在COM中AR率随获能培养时间的延长而增加,呈时间依赖关系.ECM是诱发CHA精子AR的主要部位.它含P4、透明质酸(HA)和肝素(HE)等.它们均可引起CHA体外获能精子发生AR,AR率随P4和GAG剂量而增加,并存在着明显的量效关系.P4不能引起未获能精子发生AR,据此,它可以作为一种评价精子是否获能的探针.此外,P4还可明显地提高CHA精子穿卵能力.由此可得出结论,ECM中P4和GAG是引起CHA精子获能、AR和受精的因子.
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不同功能状态精子表面复型的透射电镜观察
目的建立实用的实验程序,观察不同功能状态下的精子表面超微结构特点. 方法用BWW上游法分离活动的人精子:BWW体外获能、诱导顶体反应和低渗膨胀试验处理后,将精子贴附于阳离子膜玻片上,叔丁醇冷却干燥后真空铂-碳喷镀复型.复型膜经3%氢氟酸剥脱,次氯酸钠腐蚀,透射电镜观察. 结果人精子表面复型图像清晰,立体感强,细节较丰富、清晰,获能精子顶体区呈网络状,顶体反应时可见顶体区大量互相吻合的小泡,经低渗处理的精子顶体区出现类似获能和顶体反应的现象. 结论表面复型-透射电镜技术可用于观察精子的不同生理状态引起的表面形貌变化,方法简便,可重复性好,具有良好的应用价值.
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精子正常形态率、顶体完整率、顶体反应率与卵子体外受精率的相关性研究
目的:通过检测常规体外受精中(in vitro fertilization IVF)精液常规分析正常男性的精子正常形态率、顶体完整率、顶体反应率并分析其与卵子的体外受精率之间的关系,旨在为辅助生殖技术提供几种可靠的判断精子生育力的参数与指标.方法:选择2008年7月1日到2009年12月30日间在广西医科大学第三附属医院生殖医疗中心进行控制性长方案超排卵下行常规IVF-ET的100对夫妻,共100个周期的资料做前瞻性分析,男方精液常规分析属正常范围,分析100份标本精子正常形态率、精子顶体完整率以及精子顶体反应率;观察并记录获卵个数、成熟卵个数、受精卵个数、未受精卵个数,计算其受精率.然后应用计量资料t检验,F检验以及线性相关等统计学方法对精子各项参数与卵子受精率之间的相关性进行分析.结果:实验组1,精液标本按其正常精子形态百分率分为3组,A组:≥5%而<10%、B组:≥10%而<15%、C组:≥15%,卵子体外受精率分别为67.05%、74.51%、82.49%,各组间两两相比差异有统计学意义(P<0.05).实验组2,按顶体完整率分为两组,A组:≤85%组、B组:>85%组,卵子体外受精率分别为74.25%和82.14%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05).实验组3,按顶体反应率分为三组,A组:<14%、B组:≥14%而≤25%、C组:>25%,其卵子体外受精率分别为73.45%、77.19%、82.74%,各组间的差异有统计学意义(P<0.05).实验组4,按精子正常形态百分率分为两组<15%和>15%组,所对应的顶体完整率分别为79.51%、87.27%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05).实验组5,用多重线性回归分析,精子正常形态率、顶体完整率、顶体反应率的标准化系数和P值分别为0.352、0.497、0.271;0.045、0.005、0.017,各个系数均有统计学意义.其中又以顶体完整率的标准化系数大.结论:1.对于精液常规分析正常的男性,约有50%存在着不同程度的精子形态异常.卵子的受精率随正常形态精子所占百分率的升高而增高;其正常精子形态率≥5%,仍可得到一个较好的体外受精率,因此可行常规体外受精助孕.2.对于精液常规分析正常的男性,约有65 %男性的精子顶体完整率＞85%,随着精子顶体完整率的增加,卵子的受精率也明显增高;3.对于精液常规分析正常的男性,其78%男性精子顶体反应率≥14%,在体外受精中卵子的受精率随着精子顶体反应率所占百分比的增加而增高;4.上述三者都是影响卵子受精的重要因素,卵子体外受精率与以上三项指标间存在较强的相关关系,而其中又以顶体完整率对卵子体外受精率的影响程度大.5.对于精液常规分析正常的男性,若正常精子形态率≥5%,在体外受精助孕前,精子顶体完整率和精子顶体反应率的检测,可不作为常规检查项目.
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受精调控机制的研究进展
人类和哺乳动物的受精机制是近年来的研究热点.通过生物化学、转基因和基因敲除等研究得出的受精机制主要分为4个部分:①精子获能;②精子结合至卵子透明带;③精子与透明带结合诱发顶体反应(AR);④精子与卵子的结合和膜融合.笔者拟就近期研究阐明的精子获能、AR及精、卵融合的新信息、新观点,进行综述如下.
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异氟烷对人精子运动功能和顶体反应影响研究
目的:观察异氟烷对人精子运动功能、体外获能以及精子顶体反应的影响,对有生育要求的男性提供临床用药依据.方法:收集我院男科门诊就诊的男性精子标本,从中筛选出18份活力正常精子的精液作为标本,每例精液均分成3份,分别放置于3个试管中,分别给予1.1％异氟烷(ISO1组)、2.2％异氟烷(IS02组)和空气作为对照组,把所有的有机玻璃箱放置于孵箱培养5h,对精子的运动、获能、顶体反应进行评价.结果:1.1％和2.2％浓度的异氟烷作用于精子5h以后,与对照组相比,精子的运动活力、直线速度、曲线速度、平均速度均明显下降,P＜0.05,差异有统计学意义,IS01组和IS02组比较,IS02组的下降更为明显,呈现剂量依赖关系,即随着浓度的升高,精子的运动功能抑制越明显.对于精子获能的影响,与对照组比较,两种浓度的异氟烷均明显地抑制精子的体外获能,P均＜0.05,差异均有统计学意义,IS01组和ISO2组比较无明显差异,P＞0.05.两组精子发生顶体反应的百分率均较处理前明显增加,P＜0.05,差异有统计学意义.但是处理后两组间比较无明显差异.结论:异氟烷能够抑制精子的运动和获能,并且随着浓度的增加,抑制作用增强;异氟烷对精子顶体反应影响不明显.
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BAY及DMSO在体外对小鼠精子顶体反应的影响
目的 探究BAY(激素敏感脂酶抑制剂)及DMSO(二甲基亚砜)对小鼠精子顶体反应(AR)的直接影响.方法 分别通过5个和6个不同的浓度梯度的BAY及DMSO在体外探究其对小鼠精子AR的影响,在不同孵育时间段采用FITC-PSA和考马斯亮蓝染色法对小鼠精子的顶体反应进行鉴定.结果 在所选浓度范围内BAY未能直接影响精子的顶体反应及存活率(P＞0.05),而DMSO在一定浓度和时间内可直接影响精子顶体反应及精子存活率.结论 DMSO和BAY对小鼠精子发生的作用是通过不同途径来实现的,前者可直接影响精子顶体反应和精子的存活率,而后者则与顶体反应及存活率无关.提示在AR的研究中使用DMSO时需控制好作用浓度及作用时间.
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哺乳动物精卵融合相关的精子膜蛋白研究进展
哺乳动物的受精是由一系列精卵质膜的相互作用而触发的,这些相互作用的基本过程包括:精卵识别、精卵结合和精卵质膜融合[1].其中精卵质膜融合是受精过程为关键的步骤.精卵质膜融合是一个高度程序化的过程,完成顶体反应是精子发生质膜融合的必要前提.精子膜的不均一性导致融合的起始位点局限于特定的区域.现阶段普遍认为精卵融合开始于精子赤道区,探索精卵质膜融合相关的精子膜蛋白是研究精卵融合过程中一个极为重要的环节.
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uPAR在维持人精子正常功能方面的体外实验研究
目的:探讨uPAR在维持精子活力、活率以及参与顶体反应过程中的作用.方法:将不同浓度的抗uPAR抗体与精子共同孵育.同时设立对照组,于10、30、60 min行精液常规分析.先加入获能液诱导精子获能,而后将不同浓度的抗uPAR抗体与精子共同孵育60 min.同时设立对照组,诱发精子发生顶体反应,通过流式细胞仪检测顶体的完整性.结果:随着抗uPAR抗体浓度的升高和孵育时间的延长,精子运动能力呈现不断下降趋势.高浓度的抗uPAR抗体可降低精子顶体反应率.结论:uPAR与其配体结合后可以影响精子的运动、获能和顶体反应.
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精子受精功能
精子在与卵细胞受精融合之前,须经历一系列的生理和生化改变,包括成熟、获能、顶体反应、膨化、融合等一系列过程.近的研究观察到一些精子改变的细微表现,并探讨其影响因素.
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糖原合成酶激酶3在精子成熟、获能和顶体反应中的作用
糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一种广泛表达于各组织细胞的激酶,参与调节多种生物活动.在精子细胞中,其两种亚型(GSK-3α和GSK-3β)均有表达,参与调控精子在附睾中的成熟、女性生殖道中的获能和顶体反应等过程.GSK-3通过磷酸化隔膜蛋白、蛋白磷酸酶1一y2(PP1一y2)等靶蛋白影响精子获能与顶体反应.同时,作为参与了精子细胞中的Wnt信号通路、Toll样受体信号通路以及环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)介导的蛋白质磷酸化通路等多条通路的激酶,GSK-3的活性也受到严格的控制.因此,研究GSK-3在精子成熟、获能和顶体反应中的作用对进一步阐明精子在附睾和女性生殖道中发生的各种生理过程和男性不育的发生机制具有重要的意义.
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醋酸乌利司他体外对人精子参数与功能影响的研究
目的:醋酸乌利司他(ulipristal acetate,UPA)是一种孕激素受体调节剂,目前作为紧急避孕药物广泛应用于临床.本研究探索在体外UPA对人精子参数与功能的影响.方法:选择15例精液参数正常的标本,液化后以G-IVF调节精子浓度为2×106/mL.每例标本再分为6份,每份0.5 mL,共6组(n=15).密度梯度离心后,其中4组分别在含0.04、0.4、4、40 μmol/L UPA的培养液中孵育1h;另2组为空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)对照组.检测各组精子活力、存活率、形态、DNA完整性、顶体反应、精子超活化、精子内游离钙离子浓度.结果:不同浓度的UPA体外处理精子,精子存活率、活力、形态与对照组(空白+DMSO)比较差异无统计学意义(P＞0.05).UPA浓度达到0.4 μmol/L时处理精子,精子损伤的比例和彗尾长度显著增加,精子超活化的比例降低(P＜0.01);顶体反应被抑制,精子内钙离子浓度也显著降低(P＜0.01).结论:UPA在体外可抑制精子的顶体反应和超活化,降低精子内钙离子浓度,可能与UPA致精子损伤有关.
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哺乳动物精子顶体反应相关的蛋白及信号传导
哺乳动物精子顶体反应是自然受精起始过程中的重要环节,有多种精子膜蛋白和卵子透明带糖蛋白参与.这些蛋白一方面通过精子膜跨膜信号传导引起精子的顶体反应,另一方面,也为精子穿过透明带及精卵融合等提供必要的条件.精子顶体反应过程中涉及多种细胞信号传导的过程.如G蛋白耦联的信号传导、受体酪氨酸激酶(RTK)途径等.研究精子顶体反应过程中相关分子作用的信号传导通路,对进一步深入了解受精的分子机制具有重要的影响.
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不同浓度帕瑞昔布钠对大鼠离体精子运动功能、体外获能和顶体反应的影响
目的 评价不同浓度帕瑞昔布钠对大鼠离体精子运动功能、体外获能和顶体反应的影响.方法 通过扩散法收集SD大鼠附睾精子,采用随机数字表法分为4组(n=18):对照组(C组)、100、500和1 000μmol/L帕瑞昔布钠组(P1-3组).在37℃孵箱中培养5h后,采用计算机辅助精子分析系统评价精子运动功能,记录精子运动活力[(a+b)％]、平均速度(VAP)、直线速度(VSL)、曲线速度(VCL)和侧摆幅度(ALH),采用金霉素荧光染色技术评价精子体外获能情况,采用考马斯亮蓝染色法评价精子顶体反应情况.结果 C组、P1-3组精子VAP、VSL、VCL和精子获能率依次降低(P＜0.05).与C组比较,P2.3组(a+b)％和P2组ALH降低(P＜0.05).各组精子顶体反应率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 帕瑞昔布钠呈浓度依赖性抑制大鼠离体精子运动功能和体外获能,对顶体反应无明显影响.
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显微授精技术研究进展
自1978年Stptoe和Edwards报道了世界第一例IVF-ET婴儿诞生以来,在以后的20多年里,人类助孕技术(assisted reproductive technology,ART)得到了飞速发展,在当今所有助孕技术中, 引人瞩目的当数显微授精(micro-insemination)技术,主要包括透明带部分切除(partial zonal dissection,PZD),透明带授精法(subzonal insemination,SUZI)及细胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)等.PZD授精率高于常规IVF,但需足够量的精子.SUZI易引起多精授精,其单精授率17.7%,与前两种方法相比,ICSI正常授精率高(60%～70%),多精授精率低,授精率不受精子浓度形态的影响,无需发生顶体反应,无顶体的圆头精子也可使用.从而使妊娠率提高(30%～37%).
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男性不育患者解脲脲原体的检测
目的:了解解脲脲原体(UU)感染男性生殖系统可引起不育的致病机制.方法:比较正常生育组与不育组UU感染情况,同时检测UU感染不育组和正常生育组的精浆果糖含量、一氧化氮(NO)浓度、顶体反应.结果:不育组UU感染率与正常生育组差异有显著性(P＜0.01),UU感染不育组与正常生育组相比NO浓度、顶体反应有显著差异(P＜0.01),而果糖含量变化不显著.结论:UU感染男性生殖系统导致患者精浆果糖含量偏低、NO浓度升高、顶体反应大大降低,从而影响精子的质量.有效治疗生殖系统的UU感染对治愈男性不育有重要意义.
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精子蛋白17的研究进展
精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)是一种高度保守的睾丸组织特异性蛋白,与在卵细胞透明带上的乙酰肝素糖基进行结合,参与顶体反应,促进受精过程[1].近年来,Sp17作为一癌瘤一睾丸(CT)抗原,其作为肿瘤疫苗的前景被广泛研究和关注.
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3,4-二氯苯胺对雄性大鼠精子顶体酶活性和顶体反应的影响
为观察3,4-二氯苯胺(DCA)对雄性大鼠精子顶体酶活性和顶体反应的影响,探讨DCA生殖毒性的可能机制,选取健康性成熟Wistar雄性大鼠48只,随机分为6组,即正常对照组、溶剂对照组和3,4-二氯苯胺39、81、170、357 mg/kg4个剂量组.经口灌胃染毒,1次/d,连续35 d.分别采集精液,采用改良Kennedy法测定不同剂量组精子顶体酶活性,考马斯亮蓝染色法体外检测不同浓度二氯苯胺(5、10、20、40 μg/ml)对精子顶体反应率的影响.结果显示,与对照组比较,81～357mg/kg剂量组大鼠精子顶体酶活性明显降低(P<0.05,P<0.01),精子顶体反应率显著下降(P<0.01),且降低幅度与3,4-二氯苯胺的作用浓度有关.提示3,4-二氯苯胺对大鼠精子顶体酶活性具有明显的抑制作用,并可能由此影响精子发生顶体反应.
关键词： 3 4-二氯苯胺(DCA) 精子顶体酶 顶体反应 -
荧光染色法分析17β-雌二醇对获能人精子细胞顶体反应及细胞外Ca2+和蛋白激酶C抑制剂的影响
目的:精子细胞功能受雌激素的调节,雌激素能促进精子蛋白酪氨酸磷酸化、获能和顶体反应,从而增强精子的受精能力.但有关雌激素诱导精子细胞发生顶体反应的信号途径尚未阐明.本实验于体外观察雌激素对人精子细胞顶体反应的影响,并初步探讨其可能的作用途径.方法:实验于2006-07/2007-04在成都医学院科研中心实验室完成.实验材料:实验所用49份精液标本来自年龄25～45岁、有正常生育史、身体健康的成年男性志愿者,其精液常规各项指标符合WHO制定的正常精液常规标准.实验方法:①应用FITC-PSA荧光染色法分析精子顶体反应率,以分光光度比色法测定顶体酶活性,观察雌激素类活性物质17β-雌二醇对获能人精子细胞顶体反应和顶体酶活性的影响.②取9份上游后精子细胞悬液,每份均分为2份,分别用含钙获能液(1 mmol/LCa2+)和无钙获能液(0 mmol/L Ca2+)调整密度.再将2份精子悬液均分为17β-雌二醇作用组和对照组,观察胞外钙离子对17β-雌二醇诱导顶体反应的影响.③取9份获能精子细胞悬液,每份均分为17β-雌二醇作用组、蛋白激酶C抑制剂作用组、17β-雌二醇+蛋白激酶C抑制剂作用组和空白对照组,观察蛋白激酶C抑制剂对17β-雌二醇诱导顶体反应的影响.④取10份获能精子细胞悬液,每份均分为17β-雌二醇作用组、雌二醇-牛血清白蛋白交联作用组和空白对照组.观察非透膜性大分子物质雌二醇-牛血清白蛋白交联物对人精子细胞顶体反应的影响.⑤采用流式细胞术检测精子膜雌激素受体,以初步探讨雌激素对人精子细胞顶体反应影响的作用途径.结果:①17β-雌二醇可促进精子细胞顶体反应,并增强精子细胞顶体酶的活性.②去除培养液中的Ca2+后,17β-雌二醇不能诱导精子细胞发生顶体反应.③蛋白激酶C抑制剂能明显降低17β-雌二醇所诱导的顶体反应.④雌二醇-牛血清白蛋白交联物亦能够促进精子细胞发生顶体反应,其作用与游离雌二醇无明显差异.⑤流式细胞仪检测显示,E2-BSA-FITC(异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白-雌二醇复合物)处理组和BSA-FITC(异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白)对照组间荧光强度均值差异有统计学意义.结论:雌激素对人精子细胞顶体反应有一定的促进作用,其作用途径之一可能是通过增强精子顶体酶活性来实现,此过程涉及了胞外Ca2+、蛋白激酶C及精子膜上的雌激素受体或雌激素结合位点的参与.
