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Fra-1在胃癌中的表达与意义
目的:检测Fra-1在人胃癌、癌旁组织中的表达情况以及与临床病理参数之间的关系,以探讨Fra-1在胃癌发生、发展中的作用.方法:采用免疫印记技术检测50例人胃癌组织和30例相应癌旁组织中Fra-1的表达情况.并结合临床病理资料,分析其临床意义.结果:50例胃癌组织标本中40例Fra-1阳性表达,阳性率80%;而30例癌旁组织中17例Fra-1阳性表达,阳性率56.67%.利用免疫印记技术测得胃癌、癌旁组织中Fra-1相对表达量分别为(0.735±0.374)和(0.099±0.092),Fra-1在胃癌组织中的相对表达量较癌旁组织高(P＜0.01).胃癌组织Fra-1的相对表达量与有无淋巴结转移、TNM分期相关(P＜0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤大小及病理分级无关(P＞0.05).结论:Fra-1可能参与胃癌的形成,并在胃癌的发展、侵袭及转移中起重要作用.但其具体作用机制仍有待进一步深入研究.
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蛋清中食物不耐受组分分析
目的 分析引起患者鸡蛋不耐受的主要蛋白组分.方法 用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)分析蛋清粗提取物中的蛋白组分.以鸡蛋不耐受患者血清特异性IgG作为识别抗体,经Western blotting和间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析与患者血清特异性IgG结合的蛋白成分.结果 蛋清粗提物SDS-PAGE电泳结果主要有4个条带,相对分子质量分别为:14×103、34×103、45×103和76×103,根据相对分子质量推测分别为溶菌酶、卵类黏蛋白、卵清白蛋白和卵转铁蛋白.患者血清的免疫印迹结果主要呈现4个条带,分别对应溶菌酶、卵类黏蛋白、卵清白蛋白和卵转铁蛋白,间接ELISA法结果显示四种纯化抗原均与患者血清有反应.结论 引起患者鸡蛋不耐受的蛋白主要有两种,分别为卵类黏蛋白和卵清白蛋白,其相对分子质量分别为34×103和45×103.
关键词： 鸡蛋 食物不耐受 特异性IgG 免疫印记 间接酶联免疫吸附试验 -
引起牛奶不耐受的蛋白成分分析
目的 分析引起牛奶不耐受的蛋白成分.方法 脱脂奶经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)分离蛋白,干法转至PVDF 膜并作为分析对象,以牛奶不耐受患者血清特异性IgG(specific IgG,sIgG)作为识别抗体,以酶标记兔抗人IgG作为标记抗体,经免疫印记技术分析与sIgG结合的蛋白成分.结果 脱脂奶经SDS-PAGE分析,主要成分酪蛋白(casein,CN)、β乳球蛋白、α乳白蛋白、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)条带清晰.阳性血清的免疫印记图谱显示3条明显区带,对应的蛋白组分为:免疫球蛋白、BSA和CN.结论 免疫球蛋白、BSA和CN是引起牛奶不耐受的主要成分,且个体之间未见明显差别.
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锌-热休克蛋白诱导剂对鼠肝低温保存作用的实验研究
1.材料与方法:雄性Wistar大鼠(体重250±20 g)根据术前预处理因素及剂量不同随机分为五组:对照组(C 组):无预处理;锌组-1(Zn-1组)、锌组-2(Zn-2组)、锌组-3(Zn-3组),均于术前24 h腹腔注射0.5% ZnSO4注射液,剂量分别为Zn2+ 5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg;热休克组(H组):术前24 h接受热休克(42.5℃×15 min).采用单纯低温保存模型,每组按不同保存时限分3个亚组,即6 h、12 h、24 h,每亚组6只大鼠.检测移植肝脏灌注液中AST、LDH值.利用免疫印记(Western Blot)方法检测预处理24 h后肝脏组织中HSP含量,并利用凝胶成像及半定量分析系统进行半定量分析.光镜HE染色观察组织形态学的变化.统计学处理采用方差分析,q检验,结果采用盨表示.
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小鼠胃和阑尾组织中h-CD降解规律与死亡时间的相关性研究
目的:观察小鼠死亡后不同时间胃和阑尾组织中h-CD含量的变化,探讨不同温度条件下h-cD的降解规律与死亡时间的关系及其组织差异性.方法:选取72只健康成年昆明小鼠,采用机械性窒息致死后,随机分为两组,分别置于4℃冰箱和25℃人工气候箱中,并于死后0、24、48、72、96、120h提取胃及阑尾组织,采用免疫印记及计算机图像分析技术检测上述组织中h-CD的含量,应用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析.结果:①h-CD的含量随死亡时间的延长而降低,与死亡时间具有相关性;②不同温度条件下,胃和阑尾组织中h-CD的降解速度均存在明显差异(P<0.05),h-CD在25℃组降解速度快于4℃组(P<0.05);③h-CD的降解速度在胃和阑尾组织中存在组织差异性,在阑尾组织中的降解速度较快(P<0.05).结论:h-CD的含量随死亡时间延长而降低,其降解速度受环境温度影响,温度升高,降解速度加快,且胃和阑尾组织中h-CD的降解速度具有组织差异性,其在阑尾组织中的降解速度快于胃组织中的降解速度.
关键词： 法医病理学 重型钙调蛋白结合蛋白 死亡时间 免疫印记 -
TWEAK蛋白在出血后大鼠脑组织中的表达及在脑水肿中的作用研究
目的： TWEAK（TNF-like weak inducer of apoptosis）肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂是肿瘤坏死因子家族成员之一，近研究表明TWEAK在脑缺血后的脑水肿形成中起重要作用，但在脑出血中的作用却缺乏研究证据。本研究观察TWEAK在大鼠脑出血后脑组织中的表达及抗TWEAK单克隆抗体对出血后脑水肿形成的影响。方法免疫印记定量检测对照组及出血后3 h、4.5 h、6 h及1 d、2 d、7 d大鼠脑组织TWEAK蛋白。颅内注射抗TWEAK单克隆抗体观察TWEAK在大鼠出血后24 h对脑水肿形成的影响。结果免疫印记表明TWEAK在对照组有基本表达，从出血后3~6 h表达明显增加，在6 h达到高峰。接着在第1、2和7天开始向正常水平回落。此外，与PBS对照组相比，抗TWEAK单克隆抗体能明显降低大鼠脑出血后24 h脑水肿的形成[从（81.8±0.5）%到（78.3±0.3）%，P＜0.01]。然而在对侧基底节，TWEAK对脑水含量没有影响。结论 TWEAK在脑出血后的3 h、4.5 h、6 h、24 h表达上调，并在6 h达到高峰，1 d开始表达向正常回落。此外，TWEAK抑制剂在大鼠脑出血后第二天能明显降低脑水肿的形成。
关键词： 肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂 免疫印记 脑出血 脑水肿 -
Fas/FasL基因在退变腰椎间盘组织中的表达及诱导凋亡作用
研究发现,细胞凋亡是退变椎间盘组织中细胞减少的主要因素,椎间盘退变与细胞凋亡及由凋亡引起的基质代谢障碍有关[1].在腰椎间盘突出症患者椎间盘组织内发现Fas和FasL的表达[2],但没有对其进行相关功能的深入研究.本研究应用逆转录PCR(RT-PCR)和免疫印记方法检测退变腰椎间盘组织中Fas及FasL基因的表达,并通过抗Fas抗体诱导椎间盘细胞凋亡,以了解Fas系统在腰椎间盘退变中的作用.
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人血液血管细胞生成素的胎肝免疫印记检测
目的:制备一种新蛋白--人血液血管细胞生成素(hemangiopietin,HAPO)的单克隆抗体,检测其在胎肝中的表达.方法:杂交瘤方法制备抗HAPO的单克隆抗体;非竞争酶联免疫吸附实验测定抗体的相对亲和力;蛋白G亲和层析纯化腹水中的抗体,免疫印记方法检测胎肝中天然HAPo的表达.结果:所获单抗分别为lgG1及IgM,其轻链均为K0三株IgG1亚类单抗的相对亲和力分别为3.06×109mol/L,6.07×108mol/L和1.71×1010mol/L.亲和纯化后抗体的纯度达99%以上.胎肝中在蛋白水平上可以检测到HAPO的表达,天然HAPO的分子量接近于重组HAPO的分子量.结论:人胚胎肝组织中在蛋白水平上可以检测到HAPO的表达.
关键词： 人血液血管细胞生成素 单克隆抗体 免疫印记 -
移植肾急性抗体介导排斥反应中半乳糖凝集素7的表达
背景：半乳糖凝集素家族蛋白在移植免疫调节中的作用已被提出，目前尚未有半乳糖凝集素7检测对于肾移植后围手术期移植肾功能不全的辅助诊断，对肾移植受者而言，监测半乳糖凝集素7可能及早发现移植后肾功能异常，为临床治疗争取时间。
目的：检测半乳糖凝集素7在移植肾急性抗体介导性排斥反应中的表达。
方法：选取同种异体肾移植后行移植肾穿刺活检诊断为急性抗体介导性排斥反应的患者27例，同时选取同期移植后肾病理穿刺经诊断为正常的患者10例做对照。应用免疫组织化学染色法检测半乳糖凝集素7在组织中的表达情况、应用Western Blot法检测各组血清半乳糖凝集素7蛋白表达水平差异。
结果与结论：免疫组织化学正常组光镜下半乳糖凝集素7表达于近曲小管上皮细胞表面微绒毛，肾小球、远曲小管、集合管和静脉未见其表达；急性抗体介导的体液性排斥反应组光镜下肾小动脉内膜水肿，管壁纤维素样坏死，肾小球肾小管淋巴细胞和单核细胞浸润，半乳糖凝集素7仅见于近曲小管上皮细胞表面微绒毛，同时动脉平滑肌也有表达，阳性度较高。急性抗体介导的体液性排斥反应组半乳糖凝集素7阳性细胞计数显著高于正常对照组(P<0.01)。Western Blot检测结果，急性抗体介导的体液性排斥反应组血清半乳糖凝集素7的表达高于正常对照组(P<0.05)。结果说明，移植肾穿刺病理活检安全可靠，对患者及移植肾无不良影响，半乳糖凝集素7检测对于肾移植后围手术期移植肾功能不全的辅助诊断具有重要的指导意义。 -
高龄对散发性大肠癌错配修复基因表达的影响
目的通过对散发性大肠癌中错配修复基因hMLH1蛋白表达的检测,探讨错配修复基因与大肠癌发生和演进的相关关系.方法采用蛋白提取技术提取肿瘤组织蛋白;利用免疫印迹技术对hMLH1蛋白表达情况进行检测.结果 hMLH1蛋白表达水平≥70岁组显著低于<70岁两组;在不同分化各组间差异显著;在右半结肠癌表达显著低于除直肠以外其它部位的肿瘤;在无转移肿瘤中的表达显著低于有转移肿瘤;其表达与性别无明显相关关系.结论高龄所造成的hMLH1基因蛋白表达降低可能是导致散发性大肠癌的原因之一;hMLH1基因表达降低与右半结肠癌的发生关系密切并影响其分化;hMLH1基因表达较高的肿瘤可能易出现转移.
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人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在转基因烟草中的表达
实验室构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)植物表达载体并转化入根瘤农杆菌GV3101.该农杆菌以叶盘法转化烟草,建立表达t-PA的转基因烟草体系.通过对转化植株进行Southern blotting,RT-PCR,Western blotting和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测,结果显示,在转基因烟草中成功地表达出有活性的人t-PA.
关键词： 人组织型纤溶酶原激活剂 转基因烟草 纤维蛋白琼脂糖平板法 免疫印记 -
ADAM9基因真核表达质粒的构建及表达
目的:构建人源性去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)基因真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞).方法:利用包含ADAM9全长编码核酸序列的质粒PCR4-TOPO作为模板,用PCR扩增其核心编码区,将其克隆至PMD18-T Vector中构建PMD18-T-ADAM9质粒,同时双酶切PMD18-T-ADAM9及PXJ40-HA后构建PXJ40-HA-ADAM9真核表达载体,经酶切鉴定及测序后将载体转染至293T细胞中,通过免疫印记法检测ADAM9蛋白的表达.结果:经过双酶切和测序结果鉴定PXJ40-HA-ADAM9载体构建成功,经过Western blot法证实ADAM9基因表达.结论:成功克隆ADAM9基因并构建其真核表达载体,该载体的构建为后期建立稳定表达ADAM9细胞模型,并稳定表达ADAM9蛋白,为进行ADAM9功能研究提供可能.
关键词： 去整合素金属蛋白酶9 真核表达载体 293T 免疫印记 -
屋尘螨重组变应原Der p 2的表达、纯化及免疫学活性鉴定
目的 大量诱导表达含pET24a-Der p 2质粒的BL 21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,经包涵体洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用梯度复性方法 进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Western blot方法 分析Der p 2重组蛋白的免疫学特性.纯化后的融合蛋白Der p 2具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子.
关键词： 屋尘螨 重组变应原Der p 2 蛋白表达 亲和层析 免疫印记 -
细粒棘球蚴谷胱甘肽s-转移酶重组抗原的高效融合表达、纯化及免疫特性的研究
目的 构建细粒棘球蚴重组蛋白谷胱甘肽s-转移酶(EgGST)的表达载体,获得纯化的重组蛋白,并对其免疫学特性进行初步鉴定,为重组疫苗研制的后续工作提供依据.方法 从本室已构建的重组质粒GST/pGEM-T中酶切下GST目的 片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌BL21plys进行融合表达,经His-bind树脂纯化系统小量纯化,得到纯化的重组融合蛋白作为抗原.免疫ICR小鼠,获得抗血清.通过蛋白免疫印迹试验(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组抗原的免疫学特性.结果 成功构建具有高效表达能力的基因工程菌株,并纯化了重组蛋白,纯化的重组抗原免疫小鼠的抗血清可识别天然与重组抗原,实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.
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人内皮抑素重组腺病毒的构建及其在人视网膜色素上皮细胞的表达
目的 观察构建的含人内皮抑素(human endostatn,hES)基因腺病毒载体对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epitheliaum,hRPE)细胞的感染及其基因表达情况,为眼内新生血管性疾病治疗提供一定的实验依据.方法 原代培养hRPE细胞,行角蛋白免疫组织化学进行鉴定.从真核表达载体pEGFP-N1-ASP-hES将ASP-hES扩增,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒中,与pAdEasy 1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体,线性化后转染293细胞进行包装扩增.用该腺病毒感染hRPE细胞,应用荧光显微镜和Western blot检测病毒感染及外源基因的表达情况.结果 角蛋白免疫组织化学显示所培养的细胞为hRPE细胞,感染24 h后荧光显微镜下可见RPE细胞中有大量的绿色荧光蛋白表达,Western blot结果显示hES蛋白高表达.结论 构建的hES腺病毒对hRPE具有极高的感染效率,可作为一种良好的基因导入载体,为ES基因治疗眼内新生血管性疾病的进一步研究奠定了基础.
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悬铃木属花粉的纯化及免疫活性分析
目的对悬铃木属花粉变应原进行初步纯化并对其主要成分进行免疫学活性分析.方法悬铃木属花粉变应原粗制浸液经过凝胶过滤层析,收集主要蛋白质,SDS-PAGE检测各段蛋白质分子量,并用免疫印记法分析7例悬铃木属花粉过敏的支气管哮喘患者血清.结果悬铃木属花粉变应原粗制液经层析柱洗脱得两个洗脱峰,第一峰及第二峰升段富含蛋白,而第二峰降段蛋白含量甚微,收集各段进行SDS-PAGE,出现6条蛋白区带,分子量分别为7、50、35、39、22和16kd.第一峰主要含22～71 kd蛋白质,峰2升段以14～16kd之蛋白质为主.对7例花粉过敏的支气管哮喘患者血清免疫印记分析可见4条sIgG反应带,蛋白分子量为50、39、22和16kd,病人血清结合百分比分别为100%、28.57%、57.14%和14.29%.结论悬铃木属花粉变应原含有6种主要蛋白成分,第一峰的50、39和22 kd的蛋白质为主要致敏组分,第二峰升段的16kd蛋白质为次要致原.
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PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位
目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果 hPAK2全长基因序列克隆到了真核表达载体pcDNA3.1A中,酶切鉴定片段为2 000 bp.Western blot检测到重组质粒蛋白表达,分子量约为75 kDa.免疫荧光检测pcDNA3.1A-PAK2在胃癌细胞内的定位以细胞浆为主,细胞核内少许.结论 成功构建hPAK2全长基因真核表达载体,重组质粒主要定位于胃癌细胞浆.
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pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达
目的将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达.方法采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴定并筛选出正向连接重组体,并采用脂质体转染法将其导入原代培养的骨骼肌细胞,免疫印记检测该基因的表达.结果酶切证实基因片断正向连接于PCDNA3上,并在原代骨骼肌细胞中获得表达.结论含人类神经元AADC基因的真核表达重组体可在原代培养的骨骼肌细胞中有效的表达.
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肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究
目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.
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原发性慢性肾小球肾炎与尿白蛋白片段的关系
[目的]分析肾活检诊断明确的原发性慢性肾小球肾炎患者尿中修饰型白蛋白可能的病理生理和临床意义.[方法] 46例经肾活检诊断明确,并除外狼疮性肾炎、糖尿病肾病、原发性高血压、心脑血管损害的原发性慢性肾小球肾炎患者尿标本,用免疫印记法检测尿白蛋白片断 (uAF)的阳性率.[结果] 病理损害 I级患者 uAF阳性率 25%,Ⅱ级 29%,Ⅲ级 60%,Ⅳ级 88% (P< 0.01);具有肾病综合征的患者,uAF阳性率 100% ;无肾病综合征的患者阳性率 42%,差异有显著性 (P< 0.01).[结论]尿中修饰型白蛋白与原发性慢性肾小球肾炎的发展及预后密切相关,uAF可以作为判断肾脏损害程度及疾病预后的参考标准.
