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光学显微镜及透射电子显微镜下观察内界膜分析
特发性黄斑裂孔发病率较低，但却是进行性恶化的病变，一旦形成黄斑裂孔自愈及保持视力稳定的可能性不大，大部分病例黄斑裂孔逐渐扩大、视力减退，手术是主要治疗方式。黄斑裂孔的内界膜表面的细胞增殖成分可能向肌纤维母细胞样分化；它们的收缩造成了黄斑裂孔扩大。病理状态下的内界膜可以成为视网膜色素上皮细胞（RPE ）、M üller细胞和星形细胞增生的支架，说明ILM 参与了黄斑裂孔的发展扩大过程。本研究用光学显微镜及透射电子显微镜观察手术中从黄斑裂孔边界剥离膜状组织的组织结构。
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2450MHz微波诱导猪视网膜色素上皮细胞脂质过氧化损伤及锌的防护效应
为观察微波对体外培养的猪视网膜色素上皮细胞的脂质过氧化损伤作用及锌的生物防护作用,体外培养猪视网膜色素上皮细胞,微波按强度分为3组(10、20、30mW·cm-2)辐照1h.30mW·cm-2为防护组,在培养液中加入不同浓度的硫酸锌.辐照后立即测定SOD活性、MDA含量,检测细胞存活率.结果显示微波辐照后,SOD活性下降,MDA含量升高,细胞存活率明显下降,加入锌后,可减轻这种损伤.在本实验条件下,微波可引起体外培养的猪视网膜色素上皮细胞的脂质过氧化损伤,锌可提高细胞的抗氧化能力,减轻细胞的损伤.
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枸杞子含药血清对兔视网膜色素上皮细胞光损伤保护的实验研究
目的:观察枸杞子含药血清对受损兔色素上皮细胞(RPE)中超氧化物歧化酶(SOD)活性及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响.方法:常规细胞培养,建立兔RPE细胞光损伤模型,设正常对照组、模型组、低剂量组和高剂量组,分别于光照结束后24、48、72h进行指标的检测.结果:模型组各时间点兔RPE细胞中SOD活性及Bcl-2/Bax蛋白的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；低剂量组及高剂量组各时间点兔RPE细胞中SOD活性及Bcl-2/Bax蛋白表达与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),且随时间的延长,SOD活性逐渐增高,Bcl-2蛋白表达逐渐增高,Bax蛋白表达依次降低,同时高、低剂量组之间存在量效关系.结论:枸杞子对兔RPE细胞具有一定的保护作用,这与其具有抗氧化性且能提高受损兔RPE细胞中SOD的活性有关.
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杞灵颗粒对小鼠视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的影响
目的 探讨杞灵颗粒治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的可能作用机制.方法 小鼠予0.8％氢醌饮食饲养5个月建立小鼠AMD模型,随机分为模型组、杞灵低剂量组、杞灵中剂量组、杞灵高剂量组和叶黄素组(分别给予等体积蒸馏水,杞灵颗粒干浸膏3.75、7.5和15 g/kg,叶黄素片水溶液0.18 g/kg灌胃),每组17只.予灌胃治疗,同时18只小鼠常规饲养作为正常组.观察各组小鼠视网膜病理形态,视网膜色素上皮细胞(RPE)-Bruch膜-脉络膜超微结构,RPE细胞凋亡率和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的表达,以及血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量. 结果 与模型组比较,治疗14天时,杞灵高、中、低剂量组和叶黄素组对RPE细胞数量有保护作用(P＜0.05或P＜0.01);28天时,杞灵低、中剂量组和叶黄素组对RPE细胞数量有明显保护作用(P＜0.01).透射电子显微镜观察,模型组和叶黄素组RPE细胞内出现空泡样改变,玻璃膜(Bruch膜)比正常组厚,外胶原层见层状沉积物.杞灵中剂量组超微结构基本正常.TUNEL检测示,与模型组比较,14天时杞灵低、中剂量组和叶黄素组及28天时杞灵中剂量组和叶黄素组对RPE细胞凋亡有抑制作用(P＜0.05或P＜0.01).8-OHdG免疫荧光法发现,与模型组比较,14天时,杞灵低、中剂量组和叶黄素组对RPE细胞DNA有显著保护作用(P ＜0.05或P＜0.01);28天时,杞灵低、中剂量组有保护作用(P＜0.05或P＜0.01).造模后14天和28天,杞灵中剂量组T-SOD活性均高于模型组(P＜0.05),而在保护GSH-PX活性方面,仅28天时叶黄素组GSH-PX活性高于模型组(P＜0.05). 结论 杞灵颗粒可减轻AMD模型小鼠RPE-Bruch膜-脉络膜的损伤,降低RPE细胞的凋亡率,可能是其治疗AMD作用机制之一.
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参与视网膜色素上皮细胞抗氧化应激的重要分子
慢性氧化应激与许多视网膜病变相关疾病发生相关.氧化应激引起视网膜色素上皮(RPE)胞内蛋白质、脂质、DNA以及细胞器损伤,导致RPE功能紊乱.目前,RPE氧化应激的分子机制及其调控过程尚不清楚.近研究发现,一些重要的分子伴侣、转录因子以及micmRNAs参与了RPE抗氧化应激过程的调控,这些发现为视网膜病变相关疾病治疗策略的制定提供了新思路.
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视网膜色素上皮细胞脱离体外培养条件后细胞保存液的研究
目的 研究人视网膜色素上皮细胞(hRPE细胞)离体或脱离体外培养条件后,维持细胞活性、且延长细胞存活时间适宜的液体.方法 将5代以上hRPE细胞(本实验室保存)按常规冷冻、复苏培养于DMEM/F12培养基添加10%胎牛血清, EGF 20μg/L 和 bFGF 20μg/L条件下,至80%以上汇合,经胰蛋白酶消化,收集细胞、计数,置于6种不同保存液中(平衡盐液、Quinn's advantage medium、生理盐水、18氨基酸液、5%葡萄糖液和人工脑脊液),用Annexin V/FITC Kit染色,利用流式细胞术(FACS)检测细胞死亡或凋亡.采用2h至8h之间3个时间点,检测hRPE细胞在6种不同细胞保存液中的细胞状态.结果 室温状态下,hRPE细胞30min内均发生坏死.4℃状态下,2h平衡盐液组凋亡率低(0.9%);各组分别与平衡盐液组相比,显示人工脑脊液组与平衡盐液组之间存在显著差异;4h至8h,hRPE细胞凋亡率从26.74%上升至41.36%.各组总死亡率与凋亡率基本一致.结论 4℃状态下,6种溶液中,平衡盐液是维持hRPE细胞脱离培养条件后保持细胞活性,且延长细胞存活时间适宜的溶液.
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人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤模型的建立以及维生素C保护作用的观察研究
目的 研究氧化应激状态下维生素C作为抗氧化剂对视网膜色素上皮细胞的保护作用.方法 外源性过氧化氢(H2O2)梯度浓度为0、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L作用于ARPE-19细胞,观察细胞形态变化.MTr方法检测细胞活力,27'-二氯荧光乙酰乙酸钠(DCFH-DA)荧光探针检测12 h或24h细胞内活性氧(ROS)的生成,确定H2O2的适合作用浓度(100 μmol/L).梯度浓度(0、20 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L)的维生素C作用于氧化应激下的ARPE-19细胞,检测细胞存活率、细胞凋亡和细胞内ROS的改变.结果 外源性H2O2作用下,ARPE-19细胞生存力下降且呈剂量依赖性及时间依赖性,同时ARPE-19细胞内ROS水平上升,提示H2O2处理后可诱导ARPE-19细胞的氧化应激损伤.考虑到人体自然状态下,RPE所受到的氧化应激损伤是低强度、长时间的累积效应,所以H2O2的适合作用浓度确定为100μmol/L.维生素C处理后,中等浓度(100 μmol/L)的维生素C显著提高了ARPE-19细胞氧化应激下的生存率,同时显著降低细胞内ROS水平以及细胞凋亡率.而低浓度和高浓度的维生素C无此作用.结论 外源性H2O2可诱导人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞发生氧化应激反应,导致细胞损伤.适当浓度的维生素C可降低细胞内氧化应激水平,减少ARPE-19细胞损伤及凋亡,起到抗氧化损伤的保护作用.
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下调miR-25对高糖诱导视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞Smad7和VEGF表达的影响
目的 研究miR-25在高糖条件下人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞中表达情况,及下调miR-25对ARPE-19细胞中Smad7和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 体外培养ARPE-19细胞,采用葡萄糖(30 mmol/L)处理细胞模拟高糖状态,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中miR-25表达水平;采用Lipo-fectamineTM3000试剂盒进行转染,将ARPE-19细胞分为miR-25低表达(antagomir)组、阴性对照(NC)组、高糖(HG)组及正常葡萄糖(NG)组.转染后48 h,光学显微镜观察细胞形态,CKK-8法检测细胞增殖情况,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ARPE-19细胞E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)mR-NA表达;蛋白免疫印记(WB)检测E-cad、α-SMA、COL-Ⅰ、VEGF、Smad7蛋白表达情况.结果 与NG组比较,HG组ARPE-1细胞miR-25表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);转染miR-25 antagomir后,与HG组和NC组比较,ARPE-19细胞miR-25表达显著下调(P<0.05).与NG组比较,HG组、NC组ARPE-19细胞变长呈纺锤形细胞,细胞中 α-SMA、COL-Ⅰ、VEGF表达上调(P<0.05),E-cad、Smad7表达下调(P<0.05);与HG组、NC组比较,antagomir组纺锤形ARPE-19细胞数量减少,细胞中 α-SMA、COL-Ⅰ、VEGF表达下调(P<0.05),E-cad、Smad7表达上调(P<0.05).结论 高糖条件下,下调miR-25可抑制VEGF表达,促进Smad7表达,抑制人视网膜色素上皮细胞纤维化.
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碱性成纤维细胞生长因子对体外培养新生牛视网膜色素上皮细胞生长周期的影响
目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养新生牛视网膜色素上皮(RPE)细胞生长周期的影响.方法采用流式细胞仪测定bFGF 4 ng/ml作用下,不同时间RPE细胞的细胞周期情况.结果 bFGF组与对照组比较,两组细胞各周期比例随时间变化趋势相同且同步,但bFGF组的变化幅度均大于对照组.结论 bFGF可以促进新生牛RPE细胞自G1期进入S期,从而促进细胞增殖.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 视网膜色素上皮细胞 细胞周期 增殖 -
超声辐照微泡介导脂质体小干扰RNA转染视网膜色素上皮细胞
目的 探讨超声靶向破坏超声微泡介导脂质体小干扰RNA(siRNA)转染视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值. 方法将人及大鼠RPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×10~5/孔、1×10~5/孔),分5组处理:siRNA+超声(US)、siRNA+微泡(MBs)+US、siRNA+脂质体(L)、siRNA+L+US、siRNA+L+MBs+US.12小时后,荧光显微镜观察并应用流式细胞仪测定阳性细胞比例. 结果在无脂质体的条件下,超声或超声联合微泡不能促进siRNA转染人及大鼠RPE细胞.siRNA+L+US组siRNA转染人RPE细胞效率高.siRNA+L+US+MB组siRNA转染人及大鼠RPE细胞的效率显著低于siRNA+L+US组. 结论超声辐照可促进脂质体介导的siRNA转染人RPE细胞.
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超声辐照人血白蛋白微球与腺相关病毒感染人视网膜色素上皮细胞
目的 探讨超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球促进携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染人视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值.方法 HRPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×105/孔),加入微球与rAAV2-EGFP的混合液,在不同条件下进行超声辐照.48 h后,应用流式细胞仪测定阳性细胞比例,并且评估不同辐照条件对细胞增殖有无影响.结果 在声强1.0 W/cm2,辐照持续时间60 s,微泡细胞比值60∶1的条件下,全氟丙烷人血白蛋白微球组EGFP阳性细胞比例较对照组显著提高(P<0.001),MTS染色细胞生存率大于90%.结论 超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球能够安全地提高rAAV2-EGFP对人RPE细胞的感染效率.
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信号通路在近视发病机制研究中的进展
近视是指当眼静止时，平行光线进入眼后聚焦于视网膜感觉细胞层之前，无法在视网膜上形成清楚的物像，是一种常见的屈光不正现象。近视在人群中具有很高的发病率［1-2］，现代社会随着电视、电脑等家用电器的广泛应用其患病率也越来越高。目前近视的发病机制尚不明确。近年来研究发现局部视网膜调控、巩膜重塑等过程在近视的发病中起到了非常重要的作用［3］：近视发生过程中视网膜产生一级信号，其作用于视网膜色素上皮细胞（ RPE）和葡萄膜细胞，使之产生下一级的生化物质（称为二级信使），再作用于巩膜，导致巩膜变薄、细胞外基质（ ECM ）减少、巩膜胶原纤维直径变小等病理性改变，从而引起眼轴延长和近视性屈光改变，而许多信号通路参与了以上过程的调节。本文就实验研究中发现参与近视发生发展的几种信号通路作一综述。
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具争议的眼科产品:蓝光滤过型人工晶状体
自Ham等[1]发现可透过紫外线(波长300～400 nm)的人工晶状体会导致严重的视网膜病变后,20世纪80年代以后生产的人工晶状体大部分均添加了吸收紫外线的成分.其后Ham等[2]又通过体外动物实验证实,短波长可见光(波长400～500 nm)照射体外培养的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)之后,RPE之内的脂褐质增多,而脂褐质的成分之一A2E可以诱导视网膜色素上皮细胞凋亡,导致视网膜损伤.
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视网膜病（1）
视网膜（retina）：位于眼球壁的内层，是一层透明的薄膜。正常眼底呈橘红色，是脉络膜和视网膜色素上皮细胞的颜色。视网膜后界位于视乳头周围，前界位于锯齿缘，其外面紧邻脉络膜，内面紧贴玻璃体。组织学上视网膜分为10层，由外向内分别为：色素上皮层，视锥、视杆细胞层，外界膜，外颗粒层，外丛状层，内颗粒层，内丛状层，神经节细胞层，神经纤维层，内界膜。视网膜结构精细，功能复杂，易受自身血管性疾病和全身血管性疾病的影响。视网膜后极部有一直径约2 mm的浅漏斗状小凹陷区，称为黄斑，这是由于该区含有丰富的叶黄素而得名。其中央有一小凹为黄斑中心凹，黄斑区无血管，但因色素上皮细胞中含有较多色素，因此在检眼镜下颜色较暗，中心凹处可见反光点，称为中心凹反射，因此处只有大量的视锥细胞，故它是视网膜上视觉敏锐的部位。视网膜病是一类眼部疾病，其症状主要为出现不同程度的视力障碍，如黄斑区病变可致中心暗点，中心视力减退和色觉障碍等，该区如有出血、渗出物或水肿，可出现视物变形等。
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蓝光与视功能关系的研究进展
光线是人眼形成视觉的重要条件之一.研究发现蓝光与眼的关系密切,蓝光通过视网膜感光神经节细胞对人类调节昼夜节律有作用,蓝光也可造成视网膜光损伤.本文就蓝光与眼病的关系及为避免蓝光对眼的损害在人工晶状体设计等方面的进展作一综述.
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上皮-间充质转化在增生性玻璃体视网膜病变发病机制中的作用
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是孔源性视网膜脱离及玻璃体视网膜手术后的常见并发症,其主要特征是在视网膜前形成无血管的纤维细胞膜.超微结构和免疫病理研究表明,多种细胞参与PVR的发生与发展,如视网膜色素上皮细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞、玻璃体细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞等.其中,肌成纤维细胞是引起PVR增生膜收缩导致视网膜复位手术失败的主要细胞,主要来自于视网膜色素上皮细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),在PVR的发生发展中具有重要作用.因此,阻断视网膜色素上皮细胞转分化为肌成纤维细胞可能成为预防和治疗PVR的一种有效的方法.
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丛生蛋白(Clusterin)与眼病的关系
丛生蛋白(clusterin)作为一种多功能分泌糖蛋白,存在于人体的不同组织中,有多种生理功能.Clusterin在眼组织及细胞中的重要作用,表现在可保护视网膜血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞,减少细胞凋亡,而且能增加闭锁小带合成,促进角膜上皮细胞增生和诱导星形胶质细胞、神经元细胞分化,因此一定浓度的clusterin是维持视网膜及角结膜上皮细胞稳定所需要的.鉴于clus-terin在维持血-视网膜屏障和眼表组织结构稳定中的作用,clusterin被认为是糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等眼底疾病的潜在药物治疗靶点,同时也为治疗假性剥脱性青光眼、Stevens综合征等多种眼前节疾病提供了新思路和新方法.
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高级糖基化终末产物与糖尿病视网膜病变的关系
高级糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)的堆积是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)主要的致病因素,其可促进视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞AGE受体(receptor of AGE,RAGE)的表达、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌及细胞凋亡损伤.RPE细胞参与构成视网膜的外屏障,具有屏障、滤过、吞噬和分泌等作用,在维持视网膜正常生理功能方面具有重要作用,RPE细胞的功能损害会导致多种视网膜疾病.通过研究AGE对RPE细胞的损伤,探讨AGE在DR发生发展中的作用,有利于寻找有效防治DR的新途径.
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生长因子与视网膜色素上皮细胞免疫调节
眼后节的免疫炎症反应是由多种趋化因子、炎前因子和抗炎因子相互作用的复杂过程.RPE(retinal pigment epithelium)细胞是眼后节细胞因子的主要来源,并在炎症中作为细胞因子的靶目标.通过调节RPE细胞分泌的细胞因子有望调节眼后节的免疫炎症反应,维持视网膜结构功能的完整及内环境的稳定,清除入侵病原体和异体抗原,维持良好的视功能.本文就参与RPE细胞免疫调节的细胞因子和细胞因子对眼后节免疫炎症反应的影响综述如下.
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微小RNA与年龄相关性黄斑变性发病的关系
微小RNA (miRNA)是指一种小的内源性非编码RNA分子,其异常表达与年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)发生发展密切相关.miRNA在AMD的炎性反应、氧化应激损伤、淀粉样蛋白及脉络膜新生血管形成等病变过程中贯穿始终.这些发现可能为AMD的早期诊断、治疗及预后判断提供新的可能性.
