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干扰能及联合化疗药物对人肺腺癌细胞A549生长的影响
1997年6月～1998年6月我院采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法,首次体外观察了干扰能及联合化疗药物对人肺腺癌细胞A549生长的影响,旨在为肺癌的治疗提供有价值的实验依据.
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诺维本联合放射对人肺腺癌细胞的杀伤作用
[目的]研究诺维本联合放射对人肺腺癌细胞(PAA)的杀伤作用.[方法]应用四唑盐比色试验(MTT)检测诺维本对PAA细胞生长的抑制率和时间效应;流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况.[结果]不同浓度(20、40、60、80、100μmol/L)的诺维本作用24h后对细胞生长的抑制率分别为6.12%、18.80%、53.91%、77.10%和90.20%,ID50为59.10μmol/L;诺维本对细胞生长的抑制作用在高浓度时具有明显的时间依赖性;从流式细胞术的细胞周期分析结果发现,经诺维本作用后G2/M期细胞的比例明显增加;单纯药物组的凋亡在24h出现,单纯放射组在放射后12h出现明显的凋亡小峰,药物放射联合组出现凋亡的时间更早,凋亡峰亦更明显,各组细胞在不同时间内的平均凋亡百分数分别为:对照组5.362±4.123,单纯放射组6.523±6.214,单纯药物组9.985±9.023,药物联合放射组18.100±8.965,药物联合放射组与其它3组相比,P均＜0.05.[结论]诺维本联合放射对人肺腺癌细胞有协同杀伤作用.
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新藤黄酸干预肺腺癌血管生成的细胞学研究
目的 通过对人脐静脉内皮细胞HUVEC和人肺腺癌A549的培养,检测含新藤黄酸(GNA)条件培养基对血管内皮细胞存活率、成管和生长的影响.方法 采用甲基噻唑基四唑(MTT)法和平板克隆实验法研究GNA对HUVEC存活率和克隆形成率的影响;应用薄层胶原建立血管内皮细胞的二维培养模型,观察GN A对于血管内皮细胞成管现象的影响;采用细胞划痕愈合和小室迁移实验考察GNA对HUVEC的迁移能力影响;Westernblot检测血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子(HIF-1α)蛋白的表达.结果 MTT检测结果显示,HUVEC细胞存活率和克隆形成率随GNA剂量增加而降低.GNA可抑制HUVEC细胞的迁移.还可抑制HUVEC管腔样结构形成.此外,GNA可下调HUVEC中VEGF和HIF-1α蛋白的表达.结论GNA可在体外抑制血管生成,其作用机制可能与抑制肿瘤细胞分泌的HIF-1α和VEGF有关.
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RNAi技术对人肺腺癌细胞A549内源Survivin基因表达的影响
重组质粒可明显抑制A549细胞内源Survivin的表达和mRNA转录,其在肿瘤基因沉寂疗法中可能起重要作用.
关键词： RNA干扰 Survivin基因 人肺腺癌细胞 -
H7N9流感病毒在4种细胞中培养情况的研究
目的 了解H7N9流感病毒在不同细胞中增殖的感染动力学差异.方法 将H7N9流感病毒分别接种于鸡成纤维细胞(DF-1)、狗肾细胞(MDCK)、入支气管上皮细胞(BEAS-2B)、人肺腺癌细胞(A549),观察病毒在各细胞阿增殖后细胞病变效应(CPE)、血凝实验滴度及50％组织培养细胞感染剂量.结果 H7N9流感病毒在A549细胞中培养36 h可达到血凝效价高,同时可见明显CPE,在DF-1及MDCK细胞中培养72 h后血凝效价达到高;在BEAS-2B细胞中增殖不明显,培养液对豚鼠血无明显凝集,且培养超过96 h尚无明显CPE.DF-1细胞、MDCK细胞、A549细胞对病毒的TCID50实验结果分别为10-434、10-513、10-3.84.结论 本实验使用的H7N9流感病毒不能有效感染BEAS-2B细胞并在其中增殖,但是可以在DF-1、MDCK及A549细胞中有效增殖.增殖能力以MDCK细胞强,DF-1细胞略弱,A549细胞次之.A549细胞对病毒的吸附能力较强,可快速达到增殖的高峰.
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白喉毒素A基因转染对人肺腺癌细胞体内外生长的影响
目的:探讨白喉毒素A(DTA)基因在肺腺癌基因治疗中的作用.方法:①体外细胞毒试验:对转染DTA基因的人肺腺癌细胞A549(A549/DTA)、转染空载体的人肺腺癌细胞A549(A549/DTA-)和野生型A549,采用MTT法测定四环素作用72 h后的细胞存活率.②动物实验:将1.2×107的A549细胞接种于裸鼠皮下,当肿瘤长至约350 mg时,随机分组:转DTA基因治疗组,荷瘤裸鼠每次给予含DTA基因的病毒上清0.4 ml瘤体注射;空载体组给予0.4 ml含空载体的病毒上清;对照组给予0.4 ml生理盐水,均2 d 1次,连续3周;从开始注射病毒上清之日起,每周2次测量肿瘤大小,按公式计算肿瘤相对质量.3周后处死动物,瘤组织作病理分析.结果:①细胞存活率:转空载体的A549与野生型A549形态无明显改变,而转染DTA基因的A549细胞体积明显缩小,并有细胞碎片.②瘤体注射DTA基因的病毒上清可使皮下肿瘤显著缩小,从注射之日起至21 d,肿瘤体积缩小,而空载体组、对照组在相同时间内肿瘤体积增加.转DTA基因治疗的瘤组织出现了细胞坏死和凋亡,而空载体组及对照组瘤组织无坏死及细胞凋亡征象.结论:四环素调控白喉毒素A基因对肺腺癌有一定的治疗作用.
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放射线诱导肺腺癌细胞增殖凋亡
目的 观察人肺腺癌细胞和肺纤维母细胞照射后死亡的特征.方法 HE染色观察照射后死亡细胞的形态学改变,Comet检测凋亡细胞内DNA双链断裂,流式细胞仪检测照射后细胞周期的改变及凋亡发生时机.结果 肺腺癌细胞照射后出现凋亡,凋亡发生于细胞渡过照射诱导的G2停滞后的G1停滞期;肺纤维母细胞照射后仅见到坏死改变.结论 凋亡是肺腺癌细胞照射后增殖死亡的表现形式之一,增殖凋亡的发生具有剂量和时间依赖关系.而增殖坏死可能是肺纤维母细胞照射死亡的主要形式,揭示了不同种类细胞增殖死亡的复杂性和多样性.
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TLR基因在人肺腺癌细胞和支气管上皮细胞中的表达
目的 探讨Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs)基因在人肺腺癌细胞(A549细胞)和人支气管上皮细胞(HBE细胞)中的表达及意义.方法 通过GenBank网站查找基因全序列,根据引物设计原则应用软件Primer 5.0设计TLR2、TLR3、TLR9和内参β-actin引物.体外培养A549细胞和HBE细胞,提取细胞总RNA并逆转录得到cDNA,采用实时定量荧光PCR检测TLRs基因mRNA在这2种细胞中的表达.琼脂糖凝胶电泳检测各扩增产物片段大小.采用Western blot检测TLR2、TLR3、TLR9蛋白的表达.结果 TLR2、TLR3、TLR9基因在A549细胞中的表达丰度均比在HBE细胞中高(P<0.01).琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物符合预期片段大小.TLR2、TLR3、TLR9蛋白在A549细胞中的表达相对值分别为(0.472 8±0.010 3)、(0.319 3±0.011 2)和(0.856 9±0.007 9),而在HBE细胞中的表达相对值分别为(0.258 5±0.005 7)、(0.160 7±0.003 0)和(0.699 1±0.010 0),A549细胞中TLR2、TLR3、TLR9表达的相对值均高于HBE细胞(均P<0.01).结论 TLR2、TLR3、TLR9基因在A549细胞中的表达高于HBE细胞,提示TLRs基因可能参与人肺腺癌的发生发展.
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转染白喉毒素基因对人肺腺癌细胞的影响
目的探讨白喉毒素A基因对人肺腺癌细胞(A549)的影响.方法对转染白喉毒素A基因的人肺腺癌细胞(A549/DTA),转空载体的人肺腺癌细胞(A549/DTA-)野生型A549细胞,采用MTT法测定四环素作用72h后的细胞存活率.动物实验:12只裸鼠随机分为转基因组、空载体组和对照组,每组4只,将1.2×107A549/DTA细胞,A549/DTA-细胞及野生型A549细胞分别接种于相应的裸鼠皮下,给裸鼠饮含四环素(1μg/ml)的水,成瘤后,每周2次测量瘤体大小,计算瘤体重量.结果 A549/DTA细胞存活率较A549/DTA-细胞,A549细胞存活率明显下降(P＜0.01),而A549/DTA-细胞与A549细胞存活率无差别(P＞ 0.05).空载体组与对照组的裸鼠全部长出肿瘤,且肿瘤生长迅速,而转基因组有1只裸鼠未长出肿瘤,肿瘤生长缓慢,前者瘤体的重量是后者的3倍.结论体外转染白喉毒素A基因可杀伤人肺腺癌细胞并降低人肺腺癌细胞的致瘤性.
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一种改良的间歇性低氧细胞模型方法
目的:研制细胞氧舱,建立间歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)细胞模型并进行验证.方法:定制细胞实验舱和空气模拟对照舱,根据氧分压-时间曲线设计间歇低氧模式.将人肺腺癌细胞A549随机分为正常对照(C on)组、间歇低氧6 h(6IH)组、间歇低氧9 h(9IH)组、空气模拟对照6 h(6AC)组、空气模拟对照9 h(9AC)组、持续低氧4 h(4SH)组、持续低氧6 h(6SH)组.暴露结束后光镜下观察细胞形态改变,real-time PCR、免疫组化法检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的mRNA和蛋白表达变化.结果:该模型间歇低氧模式为5％ O2 60 min-20％O2 30 min,6个循环.与Con组比较,6AC、9AC组为原本细胞形态,6IH、9IH和6SH组部分细胞出现突起、变圆,胞质中出现较多黑色颗粒,细胞边界模糊,而4SH组未见明显异常.与6IH组比较,9IH组HIF-1α的mRNA和蛋白表达量明显增加(P＜0.05);6IH和9IH组HIF-1α的mRNA和蛋白分别高于4SH和6SH组(P＜0.05);6AC、9AC组与Con组比较差异不显著.结论:5％O260 min-20％ O2 30 min的间歇性低氧-复氧细胞模式能模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征病理生理过程,是研究该疾病较理想的细胞模型.
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p73基因对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响
背景与目的:实验证明野生型p53基因能增强大多数非小细胞肺癌的化疗敏感性.p53基因的同源体p73与其在结构和功能上都具有高度的相似性.本研究拟探讨p73基因对人肺腺癌细胞株H1299化疗敏感性的影响.方法:通过脂质体介导将p73α基因导入人肺腺癌细胞株H1299,G418筛选获得稳定表达P73α的阳性细胞克隆.Western blot检测转染细胞中P73α蛋白的表达;MTT法检测细胞存活率,观察转染细胞对阿霉素、顺铂的敏感性变化;采用流式细胞仪和TUNEL法检测化疗药诱导前后转染细胞凋亡的变化;克隆形成实验观察细胞生物学性状的变化.结果:转染p73 α基因的H1299细胞可以稳定高表达P73α蛋白.MTT实验提示顺铂和阿霉素的IC 50值分别减少了86.2%和99.2%,转染细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度(1.25 μmol/L的顺铂或0.05μmol/L的阿霉素)作用下生长明显受到抑制.流式细胞术显示p73 α基因转染后顺铂诱导的细胞凋亡率从10.1%升高到38.4%(P＜0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率从12.1%升高到49.3%(P＜0 01).克隆形成实验显示p73α基因转染能明显降低化疗后H1299细胞的克隆形成数(P＜0.01),对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为1.8和2.6倍.结论:转染p73基因可以提高H1299细胞对阿霉素、顺铂等化疗药的敏感性.该作用可能与p73基因能不依赖于p53基因诱导细胞凋亡有关.本研究为化疗和基因治疗联合应用治疗恶性肿瘤提供了实验依据.
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肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因的克隆与鉴定
目的：克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因。方法：将肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）作为实验方，肺腺癌细胞（SPC-A-1）作为对照方，应用抑制消减杂交技术，构建实验方特异表达cDNA消减文库；用斑点杂交法初步筛选cDNA消减文库后，将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析（Genbank），对新的cDNA序列进行Northern blot杂交验证。结果：建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）特异表达cDNA消减文库，斑点杂交法初步筛选显示23个克隆中有SPC-A-1/CDDP特异表达cDNA片断，测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列，其余cDNA片断与已知基因有93％～100％的同源性，Northern blot杂交结果表明2个新的cDNA片断来自SPC-A-1/CDDP细胞。结论：2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列；抑制消减杂交法是克隆特异表达基因的有效方法。
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模拟肺癌外周血微转移癌细胞富集检测方法的建立
目的 制备特异的纳米免疫磁性微球,结合免疫细胞化学技术研制肺癌细胞富集检测试剂盒,探讨在肺癌患者外周血中微转移癌细胞检测的可行性及灵敏度.方法 用反相微乳法制备纳米磁性微球,然后以碳二亚胺为交联剂将抗体与微球连接,制备纳米免疫磁性微球;将人肺腺癌细胞(A549)与PBMC及全血混匀建立癌细胞微转移模型,经纳米免疫磁性微球吸附和磁性分离后进行肺癌细胞的免疫细胞化学鉴定,检测此方法的特异性及灵敏度,建立癌细胞富集检测方法.结果 制备的纳米免疫磁性微球能够特异地与A549细胞结合并能将细胞磁性分离,当PBMC与A549比为5×106:1时可检测到癌细胞,并且能检测出1 ml外周血中1个癌细胞,未有假阳性.结论 制备的肺癌细胞富集检测试剂能有效的从外周血中分离和鉴定出微转移的癌细胞,具有较高的灵敏度,为临床提供了一种简便、快速、敏感的肿瘤微转移病灶检测技术,可提高肺癌转移及复发的诊断率.
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人肺腺癌A549细胞系干细胞样细胞的培养检测及其抗顺铂能力的研究
目的:从人肺腺癌A549细胞系中培养获得含干细胞样细胞的球细胞(Sphere细胞),检测相关标志物表达及其对顺铂的耐药性.方法:采用含特定生长因子的无血清培养基诱导A549细胞的Sphere细胞形成,用亲脂荧光染料标记技术和免疫荧光法检测Sphere细胞中干细胞的存在,用流式细胞术检测干性标志物CD133,OCT4,CD56,CD117在Sphere细胞中的表达,用CCK8法检测顺铂处理后A549细胞及Sphere细胞的耐药性,并计算IC50.结果:A549细胞的Sphere细胞中含不对称分裂的干性标志物阳性细胞,且多种干性标志物表达比例升高,对顺铂耐药性也显著提高(P<0.05).结论:人肺腺癌细胞系A549细胞在特定培养条件下可形成富集了干细胞样细胞的Sphere细胞,并对顺铂的抵抗能力增强.
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应用抑制消减杂交（SSH）克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因
目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）作为实验组，肺腺癌细胞（SPC-A-1）作为对照组，应用抑制消减杂交技术，构建实验组特异表达cDNA消减文库；用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后，将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析（Genebank）。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）特异表达cDNA消减文库，斑点杂交初步筛选显示23个克隆中有SPC-A-1/CDDP特异表达cDNA片断，测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列，其余cDNA片断与已知基因有96%～100%的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列；抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。
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人肺腺癌多药耐药细胞系的建立及其生物学特征
目的 建立人肺腺癌多药耐药细胞系。方法 以顺铂为诱导药物，人肺腺癌细胞系SPC-A-1为诱导对象，采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法，诱导建立人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP；MTT法测定药物敏感性， 透射和扫描电镜观察形态变化，常规染色体检测分析染色体变化。结果 用192 d建成人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP，它对顺铂的耐药指数为11.2，对顺铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱和足叶乙甙等药物有不同程度的耐药性，但对羟基喜树碱无耐药性，电镜观察可见SPC-A-1/CDDP细胞胞核不规则，较大，有丰富的微绒毛。结论 本研究建立了稳定的人肺腺癌多药耐药细胞系（SPC-A-1/CDDP），可应用于下游实验。
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激活蛋白2α在人肺腺癌细胞环氧合酶2表达中的作用
前列腺素(PGs)是一类脂性介质,参与多种生理和病理生理过程.环氧合酶(COX)是花生四烯酸(AA)合成前列腺素的限速酶,有两种同工酶:COX-1和COX-2.COX-1主要为基础表达,与正常生理过程的维持有关;COX-2主要为诱导表达,在炎症因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、生长因子及细菌脂多糖(LPS)等刺激下表达增加,与炎症、肿瘤的发生发展有关[1].
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水通道蛋白在人肺腺癌细胞株中的表达和意义
目的探讨水通道蛋白在人肺腺癌细胞株SPC-A-1中的表达及其意义.方法利用半定量逆转录PCR和免疫组织化学染色分析水通道蛋白1、3、4、5在SPC-A-1细胞中的表达.结果免疫组化染色显示水通道蛋白3和水通道蛋白5在SPC-A-1细胞膜上呈阳性染色,而水通道蛋白1和水通道蛋白4未见阳性染色.半定量逆转录PCR结果显示SPC-A-1细胞水通道蛋白3和水通道蛋白5 mRNA表达阳性,后者表达水平显著高于前者(P＜0.01);水通道蛋白1和水通道蛋白4 mRNA未见表达.结论人肺腺癌细胞株SPC-A-1中有水通道蛋白3和水通道蛋白5表达,二者在肺腺癌细胞株水转运中的作用有待进一步探讨.
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小剂量顺铂诱导人肺腺癌细胞存活素基因的表达研究
肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率正逐年上升.对肺癌实施的以顺铂(cisplatin,DDP)为主的联合化疗方案的多学科综合治疗,已经取得了显著的疗效.然而,由于耐药的发生,常常导致肺癌化疗的失败,并限制了铂类药物的广泛应用.存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis proteins,IAPs)家族的新成员,它可以通过直接或间接抑制caspase-3和-7的活化而抑制细胞凋亡.研究发现,顺铂诱导肿瘤细胞凋亡的主要机制之一是通过活化细胞凋亡下游效应子caspase-3,因此,推测survivin可能介导了肺癌顺铂耐药的形成.本研究通过体外细胞培养的方法,探讨小剂量顺铂对人肺腺癌细胞中survivin表达的诱导作用,以期为肺癌顺铂耐药治疗寻找新的作用靶点.
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重组人白细胞介素-4对人肺腺癌细胞SPC-A1/TAX化疗增敏研究
近年来肺癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势,严重威胁着人民的健康.在肺癌的综合治疗中,化疗起着不可替代的作用,然而,肺癌细胞多药耐药性(MDR)的产生,严重制约了肺癌化疗的效果,是引起肺癌化疗失败的关键因素.肺癌细胞多药耐药性是目前临床难以克服的课题之一,研究其产生机制并进一步寻求逆转方法,从而选择有针对性的化疗药物是临床迫切需要的.近年研究表明,rhIL-4能诱导癌细胞分化,增加某些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从而降低MDR.我们应用已建立的人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A1/TAX为研究对象,假设rhIL-4能增加多药耐药细胞系SPC-A1/TAX对化疗药物的敏感性,检测并探讨rhIL-4对SPC-A1/TAX的MDR的影响,为临床克服肺腺癌多药耐药提供理论依据.
