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兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清对8-细胞胚胎发育的影响
目的 制备兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清,观察其对小鼠胚胎发育的影响.方法 用小鼠胚胎培养基稀释兔抗血清,分别稀释至50倍、100倍、200倍,用其对小鼠8-细胞胚胎进行培养,通过胚胎致密化、囊胚率、胚胎体外贴壁生长、细胞计数、胚胎移植和免疫荧光染色观察胚胎发育状况.结果 形态学上50倍稀释的抗血清能够抑制8-细胞胚胎的发育甚至使其死亡;100倍稀释的抗血清能够延迟8-细胞胚胎的致密化,并使得胚胎在囊胚化过程中出现空泡化的现象;200倍稀释的抗血清作用不明显.未作免疫处理的兔血清与空白对照组差异不显著.100倍稀释的抗血清能够显著抑制囊胚内细胞团(ICM)的发育、囊胚细胞分布紊乱、胚胎细胞数目减少以及囊胚畸形率增加.虽然囊胚的碱性磷酸酶和Oct4均呈阳性,但经胚胎移植后都不能正常发育.结论 兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清能够抑制小鼠胚胎致密化过程和囊胚内细胞团的发育,使囊胚出现空泡化,细胞分布紊乱,抑制胚胎着床.
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结核分枝杆菌ClpC2蛋白的纯化、抗血清的制备及抗原性分析
目的：分别探索结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis ，MTB） ClpC2蛋白和兔抗ClpC2多克隆抗体作为肺结核检测抗原或抗体的可行性。方法：诱导表达重组蛋白ClpC2（rClpC2）；SDS-PAGE与Western blot 鉴定rClpC2后利用亲和层析法进行纯化；纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔，Western blot检测兔抗血清的特异性；双向免疫扩散法与酶联免疫吸附法（ ELISA）测定兔抗血清效价；rClpC2通过间接ELISA进行抗原性的初步检测，兔抗ClpC2多克隆抗体通过间接ELISA检测肺结核病人血清中ClpC2抗原。结果：rClpC2经SDS-PAGE分析，在相对分子质量46 kD处可见特异性条带；Western blot分析rClpC2可与MTB H37 Rv株感染的小鼠血清发生抗原抗体反应；经Bandscan分析rClpC2约占菌体总蛋白的58.7％，纯化后rClpC2的纯度为88.5％；Western blot验证兔抗血清可与卡介苗（Bacillus calmette-guerin，BCG）的ClpC2蛋白发生抗原抗体反应；双向免疫扩散法测定兔抗血清效价为1∶32，ELISA法测定兔抗血清效价为1∶320000；rClpC2在检测肺结核病人中的检出率为46％，检测敏感性为46％，特异性为90％；兔抗ClpC2多克隆抗体在检测肺结核病人中的检出率为40％，检测的敏感性为40％，特异性为90％。结论：成功纯化结核分枝杆菌ClpC2蛋白，制备特异性兔抗ClpC2多克隆抗体，为进一步研究ClpC2蛋白的生物功能、ClpC2作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性及兔抗ClpC2多克隆抗体生物学功能提供实验基础。
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A群脑膜炎球菌兔抗血清的制备及鉴定
目的 制备A群脑膜炎球菌兔抗血清内部参考品,并进行鉴定.方法 用新鲜培养的A群脑膜炎球菌昆悬液按确定的免疫方案免疫日本大耳白兔,免疫完成后,按确定的采血时间点,经颈动脉采血,分离血清,进行凝集试验,观察兔抗血清凝集反应情况;采用免疫双扩散和ELISA法检测兔抗血清效价,同时利用火箭免疫电泳和ELISA法鉴定兔抗血清的血清学特异性.结果 确定免疫方案为基础免疫4周后,加强免疫2周;免疫完成后第6天为佳采血时间点.6份自制A群脑膜炎球菌兔抗血清的凝集试验效价均达到1∶160,与相应的多糖能够产生沉淀线的大稀释倍数均不低于1∶8,与A群脑膜炎球菌荚膜多糖反应的抗体滴度均在106及以上,与C、Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖之间无交叉反应.结论 自制的A群脑膜炎球菌兔抗血清可作为A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的定性和定量检测的内部参考品,同时也为其他多糖类疫苗血清抗体的制备提供了参考.
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NSSR-1蛋白抗血清的制备和研究应用
神经细胞显著的丝氨酸/精氨酸富集蛋白-1(NSSR-1)是近期发现的可能的神经细胞特异的前体mRNA剪接蛋白.为了进一步对此基因进行研究,制备其特异的抗血清是必需环节.本文在通过电脑软件分析找出其特异片段序列的基础上进行多肽片段合成,和匙孔血蓝蛋白结合后作为抗原免疫家兔,使之产生特异性的抗血清.运用所获抗血清,对小鼠多种组织中NSSR-1的表达分布进行了Western blot分析.并且,对小鼠脑组织切片也进行了免疫组织化学分析,观察NSSR-1在神经系统细胞内的表达分布.Wester blot分析检测到的蛋白条带的分子量大小与推测的NSSR-1蛋白分子量相似,表明是NSSR-1的特异条带.NSSR-1蛋白的表达只存在于大脑和小脑,而不存在于肝、肺和肾中.免疫组织化学分析的结果表明NSSR-1蛋白的表达主要分布于神经细胞的细胞核,而在细胞质中表达水平较低.
关键词： 神经细胞显著的丝氨酸/精氨酸富集蛋白-1 兔抗血清 -
重组寻常型天疱疮抗原抗血清的制备与纯化
寻常型天疱疮抗原(pemphigus vulgaris antigen,PVA)是桥粒中相对分子质量为130 000的糖蛋白,其分子由细胞外区(extracellular domain,EC)、跨膜区和细胞内区三部分组成,主要发挥作用的区域在细胞外区.为了了解PVA细胞外区的致病性位点及其相应抗体的致病作用,制备抗血清是必需环节.本文在已重组表达的PVA EC1-2融合蛋白的基础上进行蛋白纯化,并免疫家兔,使之产生针对融合蛋白的特异性抗血清,经双向免疫扩散实验,其效价为1:16～1:32.采用辛酸沉淀法和DEAE-52-纤维素阴离子交换层析进行抗血清IgG抗体成分的提纯,总量为125～220 mg,经间接免疫荧光检测,其滴度为1:40.从而获得高滴度、高特异性的兔抗PVA EC1-2融合蛋白抗血清IgG抗体成分.
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PCR微板杂交对金黄色葡萄球菌凝血酶血清型进行分子分型
在临床微生物检验和污染食物的葡萄球菌流行病学调查中,常常需要对分离的金黄色葡萄球菌的凝固酶进行血清分型.尽管凝固酶被分成10个血清型[1],但目前商品化抗血清只能鉴定Ⅰ～Ⅷ型.每个血清型用兔抗血清的中和抑制试验确定, 即金黄色葡萄球菌菌株产生的凝固酶与血清型特异的抗血清在试管里混合后,再加兔血浆, 如果凝固酶的型别与抗血清对应,就不会形成凝块.如果没有抗血清(Ⅰ～Ⅷ型)能够中和凝固酶,则成为不能分型的菌株(nontypeable, NT), 这种常规的鉴定方法强烈依赖凝固酶的活性,因此,低凝固酶活性的菌株可能需要延迟观察时间,等待血浆凝块的发生,而那些具有极高活性的菌株可能引起假结果,因为抗血清不能中和凝固酶的活性.同样的道理,对于NT菌株来说,其凝固酶的活性不能被抗血清中和,凝块是否形成需要用所有八种抗血清证实.因此,为了鉴定NT和高活性的凝固酶的菌株,需要训练有素的工作人员的认真观察.此外,鉴定过程费时费力,且结果的判读常常主观.后来用微板的方法[2] 对常规的方法进行了改进,但与常规方法一样,结果受凝固酶活性的影响较大.本文旨在建立用PCR结合微板杂交技术对凝固酶血清型进行鉴定.
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VZV糖蛋白E基因胞外域的原核表达及其兔抗血清的制备
目的 采用原核表达系统表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)基因的胞外域,将纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔,制备该蛋白特异性抗血清.方法 构建原核表达质粒gE-pET-32a(+),测序后将其转化至E.coliBL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,获得VZVgE融合蛋白.采用SDS-PAGE电泳、Western blot法鉴定其特异性,利用Ni2+-NTA柱对gE蛋白进行纯化,复性后免疫新西兰家兔,获得兔抗VZV gE血清;采用间接免疫荧光、Western blot法和ELISA法检测该血清的特异性和效价.结果 成功诱导表达出VZV gE融合蛋白,SDS-PAGE鉴定提示其主要为包涵体表达,浓度约为3.01mg/ml.蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,纯度约为90％.Western blot法显示,经变性、复性后的该融合蛋白有良好的免疫反应性.用该蛋白免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV gE血清.ELISA分析显示,该兔抗血清的效价为1∶6400.结论 成功构建了高效表达VZV gE蛋白的原核表达系统,获得较高纯度的gE蛋白,可以作为VZV亚单位疫苗的候选抗原,制备了特异性及效价均较高的兔抗VZV gE多克隆抗体,为VZV感染的临床诊断及治疗提供了重要的实验工具.
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神经生长因子受体家族trkA、 trkB、trkC在成年猫脊髓的表达
目的:trkA、 trkB、trkC是神经生长因子受体家族的三个成员,大量的研究已证实,神经生长因子家族成员作用的发挥是通过与其相应受体结合来实现的,了解这些受体在组织细胞的分布,有助于间接了解各神经生长因子家族成员的生理功能.尽管已有文献报道这些受体在成年大鼠脊髓分布,但我们未见在成年猫脊髓分布的资料.方法:用成年雄猫的L3脊髓制作20 μm厚的冰冻切片,分别用trkA(效价:1∶100,Santa Cruz)、 trkB(效价1∶500, Santa Cruz)和trkC(效价1∶1000, Santa Cruz)兔抗血清以免疫组化ABC法染片,观察3种生长因子受体样免疫反应物在成年猫脊髓的分布.结果:在成年猫脊髓均见3种生长因子受体的免疫阳性反应物,trkA者主要分布于脊髓背角Ⅱ板层的神经膨体,灰质一些神经元的胞浆和白质轴索内.TrkB者则主要是灰质各板层神经元染色,阳性反应物定位于细胞浆.TrkC在脊髓的分布与trkB者类似,亦主要是神经元胞浆染色,但有所不同之处是trkC阳性神经元主要分布于腹角及背角深部,而背角浅层特别是Ⅱ板层阳性神经元少见,但Ⅱ板层可见均质状阳性反应物.结论:在成年猫脊髓含有trkA、 trkB、trkC.但其分布并不完全一致.这些受体在脊髓分布为神经生长因子家族成员包括神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF),神经营养因子3(NT3),神经营养因子4(NT4)等提供了必要的结合位点,提示NGF、BDNF、NT3、NT4等神经生长因子家族成员可能与成年猫脊髓的生理过程有关.
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脊髓中间外侧神经元NOS与FAS和NT3共存
目的:研究表明,脊髓中间外侧神经元含有NOS.但是,这些神经元是否含有Fas和NT3并不清楚.方法:取成年猫脊髓L3节段制作20 μm厚冰冻切片并分两组,两组切片均先以NADPH-d酶组化法染片,NBT兰色反应显色显示脊髓中间外侧NOS阳性神经元,而后各组切片分别再用Fas和NT3(1∶1500, Santa Cruz)兔抗血清以免疫组化ABC法染片,DAB棕色反应呈色,观察NOS与Fas和NT3在脊髓中间外侧神经元是否共存.结果:在脊髓中间外侧神经元观察到双标反应物,Fas主要位于细胞核,胞浆弱阳性反应,NOS的阳性反应物则主要位于细胞核,胞浆弱阳性反应,NOS的阳性反应物则主要位于细胞浆.相对之,NOS和NT3的阳性反应物则均位于细胞浆.神经突起内均见双标染色.结论:脊髓中间外侧神经元内NOS、Fas和NT3共存.由于NOS、Fas和NT3分属酶、凋亡基因和神经营养因子家族成员,提示脊髓中间外侧神经元至少可能含有上述三个家族的某一成员,进而也提示这些成员可能与脊髓中间外侧神经元的某些生理功能有关.
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利用ELISA技术评估尘螨变应原的稳定性
目的检测尘螨变应原的稳定性.方法利用ELISA技术检测在37℃处理后尘螨变应原的稳定性.结果尘螨变应原溶液在37℃处理6 d后,利用人抗血清可以检测到其活性下降,而使用兔抗血清时尘螨抗原生物活性的变化在37℃处理45d后仍未检测到.结论尘螨变应原的稳定性应利用IgE抗体来检测,表明尘螨变应原的生物活性在37℃处理45d的过程中逐渐下降.
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拟步甲科昆虫不同抗冻蛋白的免疫交叉性分析
目的 利用甲虫小胸鳖甲的抗冻蛋白MpAFP698制备抗血清,分析拟步甲科不同种类昆虫抗冻蛋白的免疫同源性.方法 通过DNA疫苗初次免疫-蛋白质加强的策略免疫新西兰大白兔,先以重组质粒pcDNA3-Mpafp698作为DNA疫苗免疫接种2次,再以融合蛋白His-MpAFP698进行蛋白质加强免疫2次.采用ELISA检测MpAFP698抗体的效价,Western blot法检测抗体的特异性及不同昆虫抗冻蛋白与MpAFP698抗体的免疫交叉反应.结果 兔抗血清的效价可达1∶40万,Western blot结果显示抗血清分别与His-MpAFP698及GST-MpAFP698蛋白有特异性结合,与小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP149、MpAFPS77以及来自不同昆虫的抗冻蛋白ApAPAFP914、OcAFP4有特异性结合.结论 荒漠地区不同甲虫的抗冻蛋白具有相同的抗原表位,可以发生免疫交叉反应.
