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Notch3诱导人小细胞肺癌H446细胞G0/G1期阻滞及其机制
目的 探究Notch3对人小细胞肺癌H446细胞增殖和细胞周期的影响及其分子机制.方法 将人Notch3真核表达质粒、人HES1真核表达质粒、人鼠双微基因2(MDM2)基因沉默表达质粒及其空质粒分别转染H446细胞,采用流式细胞术检测细胞周期,采用RT-PCR法检测Notch3和MDM2的mRNA水平,采用Westernblotting方法检测Notch3、HES1、MDM2、Rb和P21蛋白表达水平.结果 Notch3可抑制H446细胞增殖并导致Go/G1期阻滞(P＜0.05),上调HES1蛋白表达水平和下调MDM2蛋白表达水平(P ＜0.05);HES1高表达也能使MDM2蛋白表达水平下降(P＜0.05),但对其mRNA水平无影响;沉默MDM2基因可抑制H446细胞增殖(P＜0.05),并使H446细胞中Rb和P21蛋白表达水平升高(P＜0.05).结论 Notch3可通过HES1抑制MDM2蛋白表达,进而上调Rb和P21蛋白表达水平,抑制H446细胞增殖并阻滞H446细胞于G0/G1期.
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葛根素对人小细胞肺癌H446细胞周期和相关周期蛋白表达的影响
目的 观察葛根素诱导人小细胞肺癌H446细胞周期的阻滞作用,进一步探讨其作用机制.方法 采用MTT法测定葛根素对H446细胞生长的影响;采用流式细胞术检测处理后H446细胞周期分布和周期蛋白cyclinD1、CDK.和P27表达水平.结果 MTT法表明葛根素对H446细胞生长有较强的抑制作用;流式细胞仪检测结果发现细胞周期阻滞在Go/G1期,量效关系良好,并检测到细胞周期蛋白cyclin D1、CDK4表达减弱,P27表达增强.结论 葛根素可通过诱导细胞周期阻滞而发挥体外抗肺癌作用.其机制可能涉及细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK.和P27表达的调控.
关键词： 葛根素 H446细胞 Cyclin D1蛋白 CDK4蛋白 p27蛋白 -
去甲斑蝥素对H446细胞Id1mRNA表达的影响
目的:观察去甲斑蝥素对小细胞肺癌H446细胞Id1mRNA表达的影响.方法:分别利用MTT法检测细胞生长活性；用划痕实验分析细胞迁移能力；采用Hoechst染色观察细胞凋亡；用实时荧光RT-PCR法测定H446中Id1mRNA的表达.结果:去甲斑蝥素对H446细胞的生长有明显的抑制作用,细胞的生长抑制率和凋亡率明显增加,细胞迁移距离明显缩短.去甲斑蝥素可抑制细胞内Id1mRNA的表达,其相对定量随去甲斑蝥素的浓度增大而减少.结论:在H446细胞中,去甲斑蝥素能抑制Id1mRNA的表达,这可能是去甲斑蝥素抑制细胞生长,迁移和诱导细胞凋亡的重要机制之一.
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槲皮素对人小细胞肺癌H446细胞增殖和凋亡的影响
目的:观察槲皮素(Quercetin)对人小细胞肺癌H446细胞凋亡的影响,并初步探讨其可能的作用机制.方法:MTT法检测20、40、80、160、200 μmol/L槲皮素对H446细胞增殖的抑制作用,共聚焦显微镜观察100、200 μmol/L槲皮素处理48 h对H446细胞增殖的影响,流式细胞术检测槲皮素对H446细胞凋亡和细胞周期的影响,Western blotting检测槲皮素对H446细胞内P53、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.结果:槲皮素对H446细胞的增殖抑制具有显著的剂量和时间依赖性(P＜0.05),在12、24、48及72 h四个时间点,槲皮素作用于H446细胞的IC50值分别为(172.2±2.6)、(102.4±5.3)、(68.6±2.7)及(48.8±1.9)μmol/L.槲皮素处理后,随着H446细胞密度的降低,细胞核部分皱缩并裂解为凋亡小体,其对H446细胞的促凋亡作用呈现出显著的剂量依赖性,40 μmol/L组H446细胞的凋亡率即显著高于对照组[(8.3±0.4)％vs(4.0±0.5)％;P＜0.01],当药物浓度达到200μmol/L时凋亡率达到高.槲皮素能将H446细胞周期特异性地阻滞于G2/M期.与对照组相比,200μmol/L槲皮素处理组P53[(4.98±0.91) vs(0.68±0.26),P＜0.01]和Bax蛋白[(4.26 ±0.23)vs(0.89±0.29),P＜0.01]表达显著升高,Bcl-2蛋白表达[(0.36 ±0.06) vs(8.23±1.65),P＜0.01]显著下降.结论:槲皮素能够抑制H446细胞的增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控Bax、p53和Bcl-2等细胞凋亡相关蛋白有关.
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JNK通路及HSP70在热化疗抑制人小细胞肺癌细胞生长中的作用
目的:研究热化疗对小细胞肺癌生长的影响及其可能的机制.方法:参考临床常用剂量,采用43℃加热联合120μg/L紫杉醇(热化联合组)、43℃加热联合120 μg/L紫杉醇及20μmol/L JNK特异抑制剂SP600125(热化联合+SP600125组)、单纯43℃加热(单纯热疗组)、单纯使用120μg/L紫杉醇(单纯化疗组)处理H446细胞,以未处理的H446细胞作对照.应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测各处理方式下细胞增殖率的变化,通过Western印迹法检测JNK、磷酸化JNK(pJNK)和HSP70的表达并对数据进行统计学分析.结果:热化联合组细胞增殖率低于对照组、单纯化疗、单纯热疗及热化联合+SP600125组(P＜0.05);p-JNK表达水平在热化联合组中表达明显增高(P＜0.05),但SP600125可抑制其表达,使热化联合+SP600125组细胞的增殖率相应增高(P ＜0.05);HSP70在热化联合组的表达低于单纯热疗组(P<0.05),细胞增殖率也发生了相应变化.结论:热疗可以明显增加紫杉醇对H446细胞生长的抑制作用,且这种作用可能是通过激活JNK信号转导通路或抑制HSP70的表达完成的.
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Ghrelin在小细胞肺癌组织及H446细胞中的表达及其沉默对癌细胞凋亡的影响
目的:探讨小细胞肺癌(SCLC)组织和H446细胞中生长激素释放肽(Ghrelin)的表达及Ghrelin沉默对细胞凋亡的影响及作用机制.方法:Ghrelin水平在SCLC和癌旁正常组织中以免疫组织化学法检测,在H446细胞中以RT-PCR和Western blot法检测,在细胞培养上清液中以ELISA法检测.Ghrelin以siRNA干扰法沉默,沉默效果以RT-PCR法验证;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测active-caspase-3及Bcl-2水平;RT-PCR检测miR-21水平;MTT法测定细胞活力;脂质体转染法实现miR-21过表达.结果:Ghrelin在SCLC组织中表达明显高于癌旁正常组织,在H446细胞及其培养上清中表达显著高于BEAS-2B细胞.Ghrelin沉默后,H446细胞凋亡率显著高于其他组,伴随active-caspase-3水平增高及Bcl-2水平下降,同时细胞活力下降,且miR-21水平显著低于其它组;H446细胞经GHS-R拮抗剂或抗体处理后,miR-21水平在Ghrelin基因/GHS-R共抑制细胞中达到低,表明Ghrelin是通过识别GHS-R受体来调控miR-21水平的;此外,miR-21过表达能够逆转Ghrelin沉默诱导的细胞凋亡率增加及凋亡相关蛋白表达的变化.结论:Ghrelin在SCLC中表达显著升高,且Ghrelin沉默能够通过抑制miR-21表达促进SCLC细胞凋亡.
关键词： Ghrelin 小细胞肺癌 H446细胞 细胞凋亡 MicroRNA-21 -
葛根粗提物、葛根素对肺癌H446细胞增殖的抑制作用及其机制
目的 观察葛根粗提物(CP)和葛根素纯品(SP)对小细胞肺癌H446细胞增殖的影响,并探讨其机制.方法 用含不同浓度的SP和CP培养H446细胞,用MTT法检测细胞生长抑制率.用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率、细胞免疫化学技术检测Bel-2和Bax蛋白.另设空白对照组和溶剂对照组.结果 CP作用72 h的半数抑制浓度(ICSO)为435μg/ml,SP为1 403μg/ml.此浓度作用72 h,细胞凋亡率分别为14.71%和2.61%,两组相比P<0.05;G0/G1期细胞构成比分别为79.20%和72.20%,G2/M期细胞构成比分别为8.94%和10.50%,与对照组相比P均<0.05;CP作用于H446细胞后,细胞内Bel-2蛋白表达量降低,Bax的蛋白表达量增加,与对照组相比P均<0.05.结论 SP和CP对小细胞肺癌H446细胞具有增殖抑制作用,呈浓度相关性;SP和CP可诱导细胞凋亡且CP强于SP,其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期、上调Bax表达、下调Bel-2表达有关.
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热化疗对H446细胞增殖的影响
目的:研究热化疗对人小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其可能机制.方法:H446细胞分为单纯化疗组(单纯使用120 μg/L紫杉醇处理细胞)、热化联合组(采用43 ℃加热联合120 μg/L紫杉醇处理细胞)、抑制荊组(采用43 ℃加热联合120μg/L紫杉醇及1 μmol/L Akt特异抑制剂wortmannin处理细胞),以未处理的H446细胞作对照.应用MTT法检测各组细胞增殖率的变化,采用Western Blot检测各组细胞磷酸化Akt水平.结果:对照组、单纯化疗组、热化联合组和抑制剂组细胞增殖率分别为(100.00 ± 0.00)%、(69.16 ± 2.95)%,(59.83 ±3.36)%和(40.65 ± 0.14)%,磷酸化AKt水平分别为(1.52 ± 0.01),(1.04 ± 0.42),(0.69 ± 0.03)和(0.00 ±0.00),4组细胞增殖率及磷酸化Akt水平相比,差异均有统计学意义(F=68.231和6.232,P均<0.05).与对照组和单纯化疗组相比,热化联合组细胞增殖率及磷酸化Akt水平均降低(P<0.05),wortmannin可进一步抑制H446细胞的磷酸化,且降低细胞的增殖串(P<0.05).结论:热化疗联合应用可抑制H446细胞增殖,其作用可能是通过抑制Akt信号转导通路实现的.
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热疗与紫杉醇联合应用对H446细胞生长和MMP-2 mRNA表达的影响
目的:探讨单纯热疗、单纯化疗以及热化疗联合应用对H446细胞生长及MMP-2 mRNA表达的影响.方法:以不同温度(39℃、40℃、41℃、42 oC、43℃和44℃)、不同剂量紫杉醇(30μg/L、60μg/L、120μg/L、240μg/L和480μg/L)及热化疗联合的方法处理H446细胞.同时设对照组(0μg/L紫杉醇,37℃),每组又分为3个热疗时间(30 min、60 min和90 min),观察热疗、化疗和热化疗联合对H446细胞生长抑制率的影响;另取H446细胞.分为单纯热疗组(43℃,90 min),单纯紫杉醇化疗组(60μg/L、120μg/L和240 μs/L),43℃热疗90 min联合紫杉醇组(60μg/L、120μg/L和240μg/L),对照组(0μg/L、37℃),采用RT-PCR检测各组细胞MMP-2 mRNA的表达.结果与结论:单纯热疗与紫杉醇均可抑制H446细胞的生长,热疗不同程度地增强r紫杉醇对H446细胞的增殖抑制率,热化疗联合对H446细胞生长抑制的优组合是43℃热疗90 min联合120μg/L紫杉醇化疗,在此条件下,H446细胞MMP-2 mRNA的表达明显降低,提示热化疗联合对H446细胞增殖的抑制作用可能是通过降低MMP-2 mRNA的表达,从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移而实现.
关键词： 热疗 紫杉醇 细胞生长抑制率 MMP-2 mRNA H446细胞 -
姜黄素对PC3和H446细胞中Id1mRNA表达的影响
目的 观察姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌PC3和小细胞肺癌H446细胞Id1mRNA表达的影响.方法 分别采用MTT法检测细胞生长活性；划痕实验检测细胞迁移能力；Hoechst染色检测细胞凋亡；实时荧光RT-PCR法检测PC3和H446中Id1mRNA的表达.结果 姜黄素明显抑制PC3和H446细胞中Id1mRNA的表达,其相对定量随姜黄素浓度增大而减少；同时PC3和H446细胞的生长抑制率和凋亡率增加,细胞迁移距离减少.结论 在PC3和H446细胞中,姜黄素可能通过抑制Id1基因表达发挥其抑制细胞生长、迁移和诱导细胞凋亡的作用.
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Akt通路在热化疗联合诱导人小细胞肺癌细胞凋亡中的作用
背景与目的:Akt通路是细胞内一条重要的信号通路,与细胞生长、凋亡密切相关,本研究旨在探讨Akt通路在热化疗诱导人小细胞肺癌细胞凋亡中的作用,进而探讨热疗抑制肺部肿瘤细胞增殖可能的机制.方法:参考临床常用剂量,采用43℃加热联合120μg/L紫杉醇(热化联合组)、43℃加热联合120μg/L紫杉醇并加入1 μmol/L Akt特异抑制剂Wortmannin(Wortmannin组)、43%加热联合120μg/L紫杉醇并加入30 μmol/L活性氧(reactive oxygen species,ROS)特异抑制剂NAC(NAC组)、单纯使用120μg/L紫杉醇(单纯化疗组)处理H446细胞,以未处理的H446细胞作为对照组,应用噻唑蓝比色法(MTT法)检测各处理方式下细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,荧光法检测细胞内ROS,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Akt磷酸化水平和caspase-3的表达,采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析.结果:热化联合组细胞增殖率(59.83±3.36)%低于对照组(100.00±0.00)%和单纯化疗组(69.16±2.95)%(P<0.05);热化联合组的细胞凋亡率高(27.59±5.47)%(P<0.05);热化联合组的ROS表达增高(102.14±18.34)(P<0.05),NAC可抑制其表达(28.01±1.19),Wortmannin对其无影响(99.87±8.35);Akt磷酸化水平在热化联合组降低(0.69±0.03)(P<0.05),Wortmannin可抑制其磷酸化(0.00±0.00),NAC使其磷酸化水平升高(1.05±0.29)(P<0.05);热化联合组的caspase-3表达(1.07±0.08)高于其他各组(P<0.05).结论:热化疗联合应用可以明显抑制H446细胞的生长,这种抑制作用可能是通过诱导ROS的产生,继而抑制Akt通路活化,并通过caspase途径导致细胞凋亡.
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MDR相关新基因CA916798真核表达载体的构建及其对H446细胞增殖的影响
目的 构建新基因CA916798真核表达载体,并观察其对H446增殖的影响.方法 以人A549细胞总RNA为模板,用RT-PCR技术扩增获得CA916798开放阅读框序列,连接入pBluescriptⅡSK克隆载体上,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,酶切与DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将CA916798开放阅读框序列定向连接到真核表达载体pQE-Trisystem中,构成pQE-Tri-CA916798,将pQE-Tri-CA916798转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,脂质体转染人小细胞肺癌细胞系H446细胞,选取稳定转染不同质粒的H446细胞,采用MTT绘制细胞增殖曲线,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率.结果 扩增出CA916798开放阅读框序列,大小约为350 bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致,测序结果完全正确.转染了pQE-Tri-CA916798的H446细胞顺铂作用后增殖速度加快,凋亡率下降.结论 成功构建了pQE-Tri-CA916798真核表达质粒,并初步证实了其与顺铂诱导的肺癌多药耐药相关.
关键词： 肺癌多药耐药相关基因 CA916798基因 H446细胞 表达载体
