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EB病毒潜伏膜蛋白1羧基端活化区域2蛋白特异性结合短肽的筛选
目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒潜伏膜蛋白1(LMPl)羧基端活化区域(CTAR)2蛋白特异性结合的短肽.方法 用纯化的CTAR2蛋白筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA方法分析噬菌体克隆与CTAR2蛋白的亲和力.利用硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 CTAR2蛋白对噬菌体12肽库进行3轮筛选,第3轮的产率是第1轮的143倍[(3.0×10-6)/(2.1×10-8)],噬菌体克隆得到较好的富集.ELISA方法提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR2蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％.测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列:GLKHHSPGLLLY.结论 筛选出与CTAR2蛋白特异性结合的短肽序列GLKHHSPGLLLY,为研究LMP1致瘤机制和开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物提供实验依据.
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日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性
目的筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果. 方法用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机12肽库进行3轮亲和筛选,随机挑取18个噬菌体克隆用Dot-ELISA检测其特异性,并对其中的4个阳性克隆进行测序.分别在0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠3次,第6周每鼠经腹部感染40条日本血吸虫尾蚴,42 d后剖杀冲虫,计数虫数和每克肝卵数. 结果经3轮筛选,特异性噬菌体富集了200多倍, 随机挑取的18个克隆经Dot-ELISA鉴定有17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应.DNA自动测序的4个序列与GenBank的已知序列均无同源性.与对照组相比,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为26.57%,减卵率为65.34%. 结论采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫.
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金黄色葡萄球菌肠毒素SEC3抑制剂的筛选及活性鉴定
目的 从噬菌体随机12肽库中筛选出金黄色葡萄球菌SEC3抑制剂并鉴定其活性. 方法 用纯化的重组的金黄色葡萄球菌SEC3包被酶标板,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程对噬菌体随机12肽库进行3轮筛选;用竞争ELISA法观察单个噬菌体克隆的竞争抑制效应,评价其活性. 结果 噬菌体3轮筛选的投入产出比逐轮升高,回收率从4.5×101升高至6.3×10-4,升高140倍,提示具有良好的富集效果;与阴性对照(未加噬菌体)相比,随机挑选的8个噬菌体克隆(A1～A8)竞争抑制率为10.6％～38.3％,差异有统计学意义(t值为9.0～23.5,P＜0.05),其中A1平均竞争抑制率高,为(30.5±7.4)％,A5的平均竞争抑制率小,为(16.4±4.7)％.以噬菌体滴度对数值为x轴,以克隆噬菌体各滴度对应的平均竞争抑制率为y轴,绘制竞争抑制曲线,其回归方程为Y=2.7943X-4.7733,相关系数r=0.935,决定系数R2 =0.8727.在噬菌体滴度在108～1012 pfu范围内,随着噬菌体滴度的增高,其抑制率也增高,且克隆噬菌体滴度在1011 pf或1012 pfu的竞争抑制率高. 结论 用纯化的SEC3从噬菌体随机12肽库中筛选的SEC3抑制剂具有一定的竞争抑制活性,而且竞争抑制活性随着噬菌体滴度的增高而增强.
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与幽门螺杆菌HpaA定植相关的功能性亲和肽的筛选
目的 HpaA是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的主要粘附因子,参与幽门螺杆菌在人胃黏膜上的定植过程.特异性阻断HpaA与人胃上皮细胞的粘附,可能成为阻断Hp感染的新方法,从而弥补常规治疗中出现的毒副作用大、耐药性等问题.方法 以人工合成的HpaA主要结构域KRTIQKKRTIQK多肽为靶标,应用噬菌体随机十二肽库进行筛选,经过3轮淘选,提取阳性噬菌体克隆ssDNA,测序并进行序列分析.通过相应的分析软件对亲和肽进行分析比对.结果 通过多次筛选与富集,获得了与HpaA相互作用的功能分子ASPH、EGR2.运用软件模拟发现ASPH、EGR2均能与HpaA分子高度吻合.结论 通过噬菌体肽库技术筛选出与幽门螺杆菌主要粘附分子HpaA相互作用的2个功能分子,可能参与幽门螺杆菌的定植与致病过程,为进一步研究幽门螺杆菌在人胃内致病的机制和多肽治疗方法提供了依据.
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从噬菌体随机肽库筛选CD137结合肽
目的应用噬菌体随机七肽库筛选与人CD137特异结合的肽序列.方法以重组人CD137作为筛选分子,对噬菌体展示随机七肽库进行亲和淘选.经过5轮淘选后,共随机挑选23个噬菌斑并对其进行了扩增和测序,据此推导随机多肽的氨基酸序列.经夹心ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与CD137的结合力.3H-TdR法检测了噬菌体展示多肽对抗CD137Ab刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应影响.结果5轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果.通过对阳性克隆的测序和序列比较分析,得到RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF的相似序列和与CD137L具有同源SRS序列的SRSRVRY、HRRPSRS肽序列,ELISA结果显示这5个克隆都有良好的与CD137的结合力.RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF和SRSRVRY 4个噬菌体展示肽均能在体外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴细胞增殖反应.结论通过对噬菌体随机肽库的淘选,得到与CD137结合的相关多肽,为进一步研究CD137与配体结合的特异性位点及其拮抗性多肽药物设计提供了实验依据和结构基础.
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VEGF受体结合抑制肽的重组表达与活性分析
通过阻断肿瘤血管新生的相关因子与受体的结合抑制肿瘤血管的形成,已成为近年肿瘤治疗的重要研究策略.VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是促进血管内皮细胞生长重要的因子.本研究前期工作中已通过筛选噬菌体随机肽库,获得阳性克隆之一7P419(所带肽序列为GWYYDAX,X代表一特定氨基酸),该短肽具有明显的抑制VEGF的活性.本文将7P419与硫氧还蛋白Trx融合表达,检测该融合蛋白的抑制效果,并与人工合成肽7P419比较.
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结核分枝杆菌抗原模拟肽的筛选和鉴定
目的 应用噬菌体随机12肽库免疫淘筛结核分枝杆菌抗原模拟肽.方法 以结核患者血清IgG为靶分子,3轮淘筛噬菌体随机12肽库,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆,并进行测序分析.选择高频出现的阳性克隆用ELISA法初步分析其诊断能力.结果 经3轮免疫筛选,噬菌体得到有效富集,12个阳性噬菌体克隆经测序分析获得6种短肽序列.高频出现的两个阳性克隆诊断结核病的敏感性分别为71.4％ (A2)和55.4％ (A7).结论 结核患者血清IgG筛选噬菌体随机12肽库获得了能结合抗结核抗体的噬菌体展示短肽.
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利用噬菌体随机15肽库确定SLE相关多肽的研究
目的利用噬菌体随机15肽库确定SLE相关多肽。方法从系统性红斑狼疮（SLE）病人血清中纯化抗dsDNA多克隆抗体，以此为筛选配基，对噬菌体随机15肽库进行亲和筛选。结果经3轮筛选，每轮的投入/产出比逐轮升高，提示筛选具有良好的富集效果。第3轮筛选后选其中18个克隆进行结合试验，结果显示有6个仅与SLE病人血清反应而不与正常人血清反应，经DNA序列测定，发现其中5个克隆序列相同，通过该序列推出插入的外源短肽序列，合成并纯化该肽段。用此肽段分别与20例SLE病人及20例正常人血清反应，结果差异有显著性。结论该肽段可能是与SLE相关的抗原多肽。
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系统性红斑狼疮患者血清特异性的噬菌体7肽的筛选、鉴定及其意义
目的 筛选和鉴定与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者血清特异性结合的噬菌体7肽,并分析其实际意义.方法 分别选取正常人及SLE患者血清各30例,先后用正常人混合血清及SLE患者混合血清作为筛选配基,对噬菌体随机7肽库进行亲和筛选、扩增,获得SLE血清特异性结合的噬菌体克隆,并用患者混合血清进行Dot-ELISA实验鉴定获得的噬菌体克隆,进而分别用SLE患者及正常人血清各12例进一步鉴定阳性噬菌体的混合克隆,确定阳性噬菌体克隆与个体血清之间的结合情况;并对终鉴定的噬菌体克隆进行测序与比对分析.结果 筛选到与SLE患者混合血清特异性结合的阳性克隆12个;阳性噬菌体混合克隆与SLE患者个体血清反应阳性率明显高于其与正常人血清的反应率;序列分析显示阳性噬菌体克隆的抗原表位与大肠杆菌、沙门菌、人类免疫缺陷病毒(HIV)有一定的同源性,但与人类抗原表位无关.结论 噬菌体随机7肽库筛选出的SLE特异性多肽可能用于制备SLE诊断试剂,同时SLE患者血清中存在与病原体抗原表位结合的抗体成分,提示SLE可能与病原体感染有关.
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噬菌体表达短肽模拟日本血吸虫肝门型童虫表膜抗原表位的研究
目的从噬菌体随机12肽库免疫筛选日本血吸虫肝门型童虫表膜抗原(SjHmAg)的模拟短肽分子,探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果. 方法以纯化的SjHmAg 免疫血清IgG为配基免疫筛选噬菌体12肽库,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程进行3轮筛选;随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,并测序;用混和噬菌体克隆皮下免疫小鼠3次,分别在0、2、4周进行,第6周每鼠经腹部感染40±1条日本血吸虫尾蚴,42d后剖杀冲虫,观察减虫及减卵效果. 结果经3轮筛选,特异性噬菌体得到有效的富集,产出率为第一轮的210倍;随机挑取24个噬菌体克隆经ELISA鉴定,有21个克隆能与SjHmAg免疫血清特异性反应;自动测序仪测序,结果发现它们的外源肽具核心序列(STRKD);与对照组相比,混和噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为16.2%,减卵率为59.0%. 结论利用噬菌体展示技术可获得模拟SjHmAg短肽,这些短肽分子能诱导部分抗日本血吸虫保护力.
关键词： 日本血吸虫肝门型童虫 表膜抗原 模拟短肽 免疫筛选 噬菌体随机肽库 -
用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫免疫原的模拟短肽
目的从噬菌体随机12肽库免疫筛选出大鼠对血吸虫天然抗性的模拟靶表位,探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果. 方法用粗提大鼠血清IgG作固相配体筛选噬菌体12肽库,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程进行3轮筛选;随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,并对其中的2个克隆进行测序;用混合噬菌体克隆免疫小鼠3次,分别在0、1、3周进行,第5周每鼠经腹部感染40±1条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀冲虫,计虫数及肝卵数. 结果经3轮筛选,特异性结合噬菌体富集增加了200多倍,随机挑取20个噬菌体克隆经ELISA鉴定,有19个克隆能与大鼠血清呈特异性反应.自动测序仪测序的2个克隆的序列与GenBank的已知序列无同源性.与对照组相比,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为33.6%,减卵率为59.8%. 结论利用噬菌体展示技术可获得天然抗血吸虫抗性的短肽,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫
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噬菌体随机肽库分析HIV-1 p24抗原表位
目的利用噬菌体随机肽库分析抗HIV-1核心区抗原p24单抗在抗原上的识别位点. 方法用抗HIV-1 p24单抗2C7和3H10作为筛选分子,对噬菌体肽库进行生物淘洗(biopanning),并通过DNA测序、ELISA效价测定等对所获得的噬菌体克隆进行鉴定,后对合成的7肽位点通过间接ELISA及竞争抑制试验进行血清学分析. 结果序列分析结果表明,单抗2C7和3H10在HIV-1 p24上的抗原识别表位的保守序列分别为DHPXPXX和XXXXKAF.分别合成这2个7肽氨基酸序列P-C1(DHPSPWG)和P-H3(SPWLKAFGGGS),并分析其免疫学结合特性,结果表明与P-H3相比,单抗2C7的抗原识别表位P-C1的固相结合特性较好,固相P-C1检测血样,13份抗HIV阳性样本中,12份为阳性(检出率为92.3%),19份抗HIV阴性样本中,仅1份为假阳性结果(特异性为94.7%).与P-C1相比,单抗3H10的抗原表位P-H3的固相结合能力极差,但液相结合活性较好,血样与P-H3的抑制试验表明,13份抗HIV阳性样本中12份样本对P-H3的抑制率大于60%(12/13),而9份抗HIV阴性样本中仅1份对P-H3的抑制率大于50%. 结论用抗HIV-1 p24单抗筛选噬菌体随机肽库,获得单抗在p24抗原上的识别表位的氨基酸序列,血清学结果表明这2个抗原表位存在于p24自然抗原上,在抗HIV-1的感染检测中具有潜在的应用价值.
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应用噬菌体随机肽库技术研究干扰素-α2b抗原表位
目的应用噬菌体随机肽库技术,研究干扰素-α2b高抗原性表位. 方法利用结合有干扰素-α2b多克隆抗体的免疫磁性微球,对噬菌体随机肽库进行生物淘筛,以ELISA方法鉴定阳性克隆.阳性克隆测序后与干扰素氨基酸序列进行了同源性分析,研究干扰素-α2b分子中高抗原性表位. 结果经4轮淘筛后噬菌体克隆的阳性率为57.6%,据随机挑选的12个阳性克隆的同源性分析结果将其分为3组,分别对应干扰素-α2b 3个高抗原性表位与预测的结果吻合,其中第2组与干扰素受体结合区AB环接近. 结论利用噬菌体随机肽库技术,成功筛选出3个与抗原性预测相符合的干扰素-α2b抗原表位,为研究干扰素分子的作用机理、制备抗特定表位的单克隆抗体以及设计和开发干扰素的小分子模拟肽奠定了基础.
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人骨肉瘤组织血管特异性亲和肽的筛选和测序分析
噬菌体呈现技术是一种高效的筛选体系.本研究旨在以人骨肉瘤组织血管为靶,对噬菌体随机肽库进行淘筛,阳性克隆经过测序分析,得到保守短肽序列,为骨肉瘤的靶向化疗打下基础.
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基于骨架蛋白的噬菌体肽库研究
噬菌体展示肽库技术是研究蛋白质分子进化的理想工具.从选择合适的蛋白骨架入手,构建在此结构基础上的构象型肽库,结合高通量大规模的筛选技术,可以方便地获得具有新功能的蛋白质.这些新功能蛋白因具有高亲和力和高特异性,将有可能在许多生物技术领域中替代天然抗体.
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类风湿关节炎相关多肽对临床诊断的价值
目的 评价利用噬菌体随机肽库,以抗角蛋白抗体(AKA)为配基筛选特异结合的抗原表位的临床诊断价值.方法 将间接荧光法检测AKA阳性的类风湿关节炎(RA)患者混合血清,经33.3%饱和硫酸铵盐析纯化IgG,以此多克隆抗体为配基,对噬荫体递呈的随机12肽库(预先经正常人血清吸收)进行淘筛,将筛选到的阳性噬菌体克隆包被酶标反应板,通过间接ELISA法检测临床RA患者、系统性红斑狼疮(SLE)患者、强直脊柱炎患者及正常人血清标本,评价诊断价值.结果 筛选到一个模拟表位,对RA诊断的特异性为95.6%,敏感性为60%,约臀诊断指数为155.6%,刚性预测值为90%,其氨基酸序列为QSESAGPTFSRR,与人的聚角蛋白微丝蛋白137-148位氨基酸相似.结论 筛选到的多肽QSESAGPTTSRR为RA相关多肽,可能对RA具有一定的特异性诊断价值.
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Survivin拮抗肽对体内血管生成的影响
肿瘤的侵袭、转移过程是多因素、多步骤的过程,一般涉及肿瘤细胞黏附、运动,细胞外基质降解,肿瘤新生血管生成等多个环节[1].抗肿瘤血管生成是目前抗肿瘤转移药物研究的重要靶环节之一[2].Survivin是近年来分离的一种哺乳动物凋亡抑制蛋白[3],被认为在bcl-2的下游阻断了半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7凋亡调节通路[4,5],与其他家族成员不同,Survivin基因在正常组织中不表达,而在几乎所有被研究的肿瘤组织中呈阳性表达,这一特点为肿瘤的诊断和治疗提供了新的靶点[6,7].文献[8-9]报道,Survivin表达与脑胶质瘤增殖、凋亡及血管生成有密切的关系.Survivin拮抗肽(survivin antagonisticpeptides,SPs)是本课题组筛选噬菌体随机肽库获得的高亲和性12肽[10].本研究采用抗血管生成研究界公认的实验方法研究SPs对于体内血管生成的抑制作用,现报告如下.
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从随机9肽库中筛选HCV抗原表位
目的:用患者血清中抗HCV抗体从随机9肽库中筛选HCV抗原表位.方法:将病人血清用硫酸铵粗提后,用ProteinA亲和层析柱纯化和制备抗HCV多克隆抗体;以此为筛选配基,对噬菌体表面展示的随机9肽库进行亲和筛选.结果:三轮筛选的投入产出比逐轮升高至5.0×10-3、假阳性率逐轮降低至0.2%,提示具有良好的富集效果.从第三轮挑选出的15个克隆进行结合试验,发现7个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清反应;测序表明6个克隆的外源肽含有核心序列SPVAXVLXT.用阳性噬菌体克隆检测20例病人血清,有程度不等的阳性反应.结论:用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中筛选得到了有一定功能的模拟表位.
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单克隆抗体表位分析技术的研究进展
单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性,已广泛应用于自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗.单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位,确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤.本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方法,包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱(hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)、生物信息学表位预测方法的原理、特点及研究进展作一综述.
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SLE患者血清中病原体相关噬菌体7肽的检测
目的用噬菌体7肽库筛选系统性红斑狼疮(SLE)患者血清特异性抗体，测序分析其实际意义。方法先用30例正常人混合血清与噬菌体7肽库反应，未与正常人白清结合的7肽再与30例SLE患者混合血清结合，获得SLE血清特异性结合的噬菌体克隆。用患者混合血清进行Dot-ELISA实验鉴定获得的噬菌体克隆，进一步用SLE患者及正常人血清各12例筛选阳性噬菌体的混合克隆，确定阳性噬菌体克隆与个体血清之间的结合情况，并对终鉴定的噬菌体克隆进行测序与比对分析。结果混合的阳性噬菌体克隆与SLE患者个体血清反应阳性率明显高于其与正常人血清的反应率;序列分析显示阳性噬菌体克隆的抗原表位与杆菌、球菌、弧菌等微生物有同源性，与裂殖酵母属、链球菌属、立克次(氏)体属等有100％同源性，与人类抗原表位无关。结论SLE患者血清中存在与病原体抗原表位结合的抗体成分，提示SLE可能与病原体感染有关。
