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沙门氏菌LAMP检测方法的建立
目的 建立检测沙门氏菌的环介导等温扩增技术. 方法 针对沙门氏菌侵袭蛋白基因(invA),用LAMP引物在线设计软件设计4条特异性引物(内、外引物各2条),建立了快速检测食品中沙门氏菌的环介导等温扩增方法.对dNTP浓度、Mg2+浓度、内引物浓度和外引物浓度等反应条件进行优化,并测定方法的特异性和灵敏度,然后用该方法对猪肉模拟样品和猪肉实物样品进行检测. 结果 优化的LAMP反应体系为:0.8 mmol/L dNTP,6.0 mmol/LMgCl2,0.2μmol/L外引物F3和B3,1.6 μmol/L内引物FIP和BIP.对6种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含invA基因的沙门氏菌扩增阳性.对细菌纯培养物检测的灵敏度为101 cfu/ml,对猪肉模拟样品检测的灵敏度为102 cfu/g.采用环介导等温扩增方法检测57份猪肉实物样品,invA基因阳性5份.LAMP方法检测(包括DNA提取、LAMP反应和电泳分析)可在2h内完成. 结论 检测沙门氏菌的环介导等温扩增方法快速、灵敏、特异,适合在基层食源性疾病监测和应急检测中应用.
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问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究
目的 确定我国不同基因种问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株携带毒力相关基因invA的情况,了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化.方法 采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体Patoc Ⅰ株invA基因.克隆问号钩体全长invA基因并测序,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rlnvA后免疫家兔获得抗血清,免疫双扩散法检测其效价.建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型,采用荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化.结果 4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.4株不同基因种的问号钩体invA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.33%～100%和98.66%～100%.所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA.rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1:16.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min以后可大量黏附于细胞表面.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min时,invA基因mRNA水平明显上调,45 min时达到峰值,然后逐渐下降.问号钩体赖株感染HEK293细胞后45 min和60 min时可检出InvA蛋白,感染前及感染90 min以后检测结果均为阴性.结论 invA基因是致病性问号钩体所特有的基因.invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点,与问号钩体侵入宿主细胞密切相关.
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荧光定量PCR快速检测粪便中沙门氏菌方法的建立及应用
沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属,也是肠杆菌科中重要的病原菌属.沙门氏菌菌型繁多,分布广泛,是重要的人畜共患病病原体之一.也是引起人类食物中毒常见的病原菌[1].然而目前,包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的检验普遍采用传统培养方法,报告检验结果大致需(4～7)d,耗时太长,程序繁琐[2].所以,建立快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题.本文拟采用沙门菌invA基因为靶基因建立快速荧光定量PCR方法检测粪便中伤寒沙门氏菌.
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应用PCR技术快速检测沙门菌
[目的]建立用于快速和特异检测沙门菌的PCR方法.[方法]将受试菌种按煮沸裂解法提取DNA,针对hns与invA基因序列合成2对PCR引物,对沙门菌标准菌株和其他菌属的菌株进行PCR检测,并用福建省2006-2007年沙门菌临床分离株137株进行验证.[结果]沙门菌标准菌株hns和invA基因均为阳性;137株沙门菌临床分离株hns和invA基因的阳性率分别为100%和99.3%,其他菌属的菌株无特异性条带.[结论]本研究建立的PCR方法可用于检测沙门菌属.
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福建省沙门菌病invA与spvB基因分布状况的研究
[目的]了解福建省沙门菌临床分离株invA以与spvB基因的分布特点,为掌握我省沙门菌病分子流行病学特征提供依据.[方法]采集2006、2007年沙门菌临床分离株137株,煮沸裂解法提取DNA后对invA和spvB基因进行PCR检测.[结果]invA和spvB基因的阳性率分别为99.3%和24.8%;spvB基因在腹泻病例中的阳性率高于在发热病例中的阳性率,在非伤寒病例株的阳性率显著高于伤寒、副伤寒病例株的阳性率.[结论]invA基因可作为沙门菌病快速诊断基因,spvB基因在非伤寒、伤寒及副伤寒沙门菌血清型中均有不同程度地存在.
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沙门氏菌的invA基因序列分析与分子检测
目的采用聚合酶链反应和DNA序列分析,了解沙门氏菌侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)基因核苷酸序列有何差异,建立沙门氏菌的分子快速检测方法.方法根据沙门氏菌的invA基因核苷酸序列设计一对引物,应用聚合酶链反应技术,分别对3种沙门氏菌标准菌株的invA基因及6种非沙门氏菌株进行PCR扩增,并将扩增的片段进行克隆及序列分析.结果 3种沙门氏菌标准菌株PCR均扩增出283 bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异带扩增;DNA序列分析证实,沙门氏菌的invA基因核苷酸序列比较保守.结论本研究建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,invA基因的序列分析为进一步研究沙门氏菌不同分离株的流行病学、遗传学与分子致病机理奠定了基础.
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实时荧光PCR检测沙门菌特异基因
目的:建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法.方法:针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析.结果:应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异.结论:该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测.
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沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用
目的:建立适合基层检验部门使用的快速检测沙门菌LAMP法.方法:在65℃普通恒温水浴中、60 min扩增沙门菌invA基因片段,目测或电泳快速检测沙门菌.分别对环介导等温扩增(LAMP)反应影响较大的温度、Betaine浓度等进行优化,并对实验室保存的28种沙门菌不同血清型共34株和其他9种肠杆菌科细菌进行检测;对部分沙门菌进行污染血清直接LAMP模拟检测.结果:28种不同血清型的沙门菌LAMP检测都呈阳性,其它9种肠杆菌科细菌均为阴性;血清模拟实验与菌株直接DNA提取LAMP检测结果一致.结论:LAMP法能够快速、特异地检测沙门菌,且不需要昂贵的仪器,适合基层检验部门使用.
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鲫鱼沙门菌检出与水质间关系的调查研究
目的 监测杭州白马湖水域鲫鱼的沙门菌感染和耐药状况,了解该水域的水质污染状况.方法 收集不同水产市场的244份鲫鱼肠道样本,野生(白马湖水域)样本和健康饲养(养殖场)样本分别为97份和147份,PCR检测沙门菌保守基因invA与耐药相关基因.K-B药敏纸片法检测细菌的耐药性.结果 标本共计检测到6份肠炎沙门菌阳性.鲫鱼沙门菌感染率平均为2.5％ (6/244),野生鲫鱼和饲养鲫鱼的感染率分别为3.1％ (3/97)和2.0％ (3/147).6株菌均扩增出耐药相关基因parC和gyrA,1株还扩增出了blaTEM和tetB基因.药敏试验显示部分菌呈多重耐药,所有菌对喹诺酮类药物有不同程度耐药,部分菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类或四环素类药物耐药.结论 野生鲫鱼与饲养鲫鱼均存在肠炎沙门菌感染.药敏试验结果显示,野生鲫鱼耐药程度强于饲养鲫鱼,提示白马湖水域可能存在抗生素污染.
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单增李斯特菌LAMP方法的建立
目的:探索建立一种能应用于单增李斯特菌检测与鉴定的LAMP方法,以适合在基层实验室开展应用.方法:针对单增李斯特菌invA基因靶序列,设计5条特异性LAMP引物,建立LAMP反应条件与体系.结果:整个检测过程仅需1.5 h,可通过肉眼目测或电泳检测判断结果,对5株单增李斯特菌和英诺克李斯特菌等共23株其它实验株的invA基因进行检测,结果显示该方法有良好的特异性;检测限试验显示敏感性稍差但不影响对单增李斯特菌分离疑似菌株鉴定及疑似食品污染物的批量检测.结论:本研究建立的LAMP方法能够快速、特异地检测单增李斯特菌;简单经济,不需要其他辅助仪器,结果即可直观判断;适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值.
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分子信标探针技术检测沙门菌invA基因
目的研究沙门菌的分子信标基因检测方法.方法在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5′端标记6-fluorescine(6-FAM),3′端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoicacid(DABCYL),对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测.结果肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌"H"、伤寒沙门菌和肠侵袭型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104.5、85.9、83.1、94.8、46.1,Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121.3、64.2、45.6、42.8、54.5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21,结果阳性,与琼脂糖电泳分析结果一致.结论分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测.
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喹诺酮对沙门菌毒力基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响
目的:研究喹诺酮对沙门菌毒力岛基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响.方法:用多阶段诱导方式体外筛选耐喹诺酮沙门菌株,用荧光定量PCR方法测定喹诺酮敏感株和耐药株的hilA和invA基因的mRNA表达水平.结果:与喹诺酮敏感株相比,喹诺酮耐药株的hilA和invA的mRNA的表达水平显著降低(P<0.01).结论:喹诺酮可导致沙门菌毒力相关基因表达水平降低,这意味着喹诺酮耐药株毒力和致病性的降低.
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环丙沙星对沙门菌毒力岛基因invA影响的分析
目的:分析沙门菌毒力岛基因invA在不同血清型的基因变异和耐环丙沙星菌株中基因突变情况,及环丙沙星对沙门菌生长能力的影响.方法:用微量肉汤稀释法测定6个血清型的40株沙门菌的环丙沙星MIC;采用多阶段筛选法对敏感菌株诱导环丙沙星耐药株;对invA基因进行测序比对,分析其基因变异和突变情况;测定诱导前后沙门菌的生长曲线.结果:不同血清型的沙门菌其invA基因序列存在不同程度的变异,但均属于沉默突变;环丙沙星耐药株未发现invA基因突变或缺失;环丙沙星诱导后沙门菌的生长能力明显减弱(P ＜ 0.001).结论:invA基因在不同血清型的变异,说明沙门菌的毒力仍在进化中;环丙沙星未引起invA基因的突变或缺失,但可使沙门菌的生长能力下降.
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大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选
目的 构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGKINVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础.方法 将invA基因克隆于pGKble24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGKINVA.质粒pGKINVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株.结论 从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGKble24构建重组穿梭质粒pGKINVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在Korthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株.结论 成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGKINVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析.
关键词： invA基因 大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭载体 钩端螺旋体 -
沙门氏菌invA基因ICAN快速检测法的研究
嵌合引物介导的恒温扩增（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，ICAN）反应需要三个特殊的组成：5'-DNA-RNA-3'的嵌合引物、耐热的RNaseH及具有链取代活性的DNA聚合酶，此法只需在55益左右恒温反应一个小时即可[1]。本文阐述了为建立快速检测沙门氏菌invA基因的ICAN法进行的研究，结果没有出现如报道中描述的清晰的三条带，但是与阴性和其他肠杆菌科细菌相比，沙门菌有明显的特异性条带。本文对出现此结果的原因进行了比较详尽的分析。
