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HOX11+急性T淋巴细胞白血病RUNX2基因启动子区域CpG岛甲基化及其表达的研究
本研究检测RNX2基因在HOX11+急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞株和T-ALL患者骨髓细胞中的甲基化状态和表达水平,探讨其表达水平与启动子区CpG岛甲基化的关系.以3株急性T淋巴细胞白血病细胞株sil-ALL、DND41和RPMI及38例T-ALL患者、29例治疗后完全缓解T-ALL患者骨髓和8例正常人骨髓为样本,采用RT-PCR检测RUNX2 mRNA表达水平,采用重硫酸盐测序法、甲基化DNA免疫沉淀技术和启动子寡核苷酸微阵列芯片分析基因启动子区CpG岛甲基化状态和基因功能.结果表明,高表达HOX11的T-ALL患者样本中会出现UNX2基因启动子区域的甲基化.RUNX2基因启动子区域在HOX11+ T-ALL的甲基化比率为78.9％,明显高于HOX11-ALL(36.8％),两组差异有统计学意义(P＜0.01).RUNX2在HOX11+的细胞株中的表达明显低于HOX11-的细胞株,RUNX2在HOX11+的T-ALL患者中的表达水平(0.581±0.257)明显低于HOX11-的T-ALL患者(0.835±0.317),并且RUNX2 mRNA的相对表达程度与HOX11 mRNA的相对表达程度成负相关(rs=-0.378,P＜0.01).RUNX2基因在T-ALL中的表达水平与其甲基化呈负相关(rs=-0.419,P＜0.01).结论:HOX11能负调控RUNX2的表达,RUNX2基因启动子甲基化是导致其在T-ALL中表达下调或基因沉默的原因,这种HOX11对RNX2基因的抑制作用有可能就是临床上HOX11高表达T-ALL患者具有更好的无事件生存率和更长的总生存率的原因.RUNX2基因的表达和甲基化水平对判断T-ALL患者的疗效有一定意义,并有望成为一个诊断T-ALL的分子标志.
关键词： 急性T淋巴细胞白血病 HOX11+ RUNX2基因 甲基化 -
锁骨颅骨发育不良家系致病基因突变及蛋白结构变化
目的：检测一个锁骨颅骨发育不良综合征（ CCD ）家系RUNX2基因突变情况，分析突变体蛋白结构的变化。方法对家系患者进行X线片检查，抽取外周静脉血，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应（ PCR）扩增RUNX2基因并测序，对测序结果进行Blast分析。运用Swiss-Model软件预测， SWISS-Pdb、 Ras-Mol浏览器分析突变体蛋白构像。结果 CCD家系患者RUNX2基因编码序列在外显子3发生错义突变c.674 G＞T （p.R225L）。蛋白结构预测分析显示，突变体蛋白由于亲水性精氨酸为疏水性的亮氨酸所替代，引起分子内部分氢键基团丢失以及分子表面静电势能改变。结论 RUNX2基因c.674G＞T （p.R225L）杂合突变是该家系发病的分子基础，氨基酸序列的改变对蛋白质的空间结构产生影响。
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兔骨髓间充质干细胞 Runx2基因特异 siRNA 的设计和沉默作用
目的：探讨应用小干扰RNA（ small interfering RNA，siRNA）特异性抑制兔骨髓间充质干细胞内Runx2基因表达，筛选高效特异性siRNA。方法根据siRNA设计原则，针对Runx2基因序列特征设计Runx2特异siRNA（1-3），转染兔骨髓间充质干细胞，用QPCR和Western blot方法检测siRNA对Runx2基因的抑制效果。结果 Runx2 siRNA-2可有效抑制骨髓间充质干细胞中Runx2基因的表达。随siRNA-2终浓度由50 nmol/L增加到100 nmol/L及200 nmol/L，抑制效率逐渐增强（ P＜0．05）；siRNA-2以终浓度200 nmol/L转染后48 h抑制效果强，72 h逐渐减弱，但仍明显抑制（ P＜0．05）。结论应用RNA干扰技术可抑制骨髓间充质干细胞中Runx2基因的表达，其抑制作用具有明显的时间、浓度依赖性。
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Runx2基因参与骨代谢相关通路的研究进展
随着老龄化时代的到来,骨质疏松症成为人们研究的热点,而Runx2基因作为一种成骨分化特异性转录因子,参与多种信号通路调控成骨分化的过程.本文仅就Runx2基因参与转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)通路、Notch信号通路及Wnt信号通路的研究进展进行综述.
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云南红河地区哈尼族与昆明地区汉族 Runx2 基因多态性比较研究
目的 比较云南红河地区哈尼族与昆明地区汉族Runx2基因多态性. 方法 将昆明医科大学第一附属医院120名汉族健康体检者作为汉族人群,云南省红河地区126名哈尼族作为哈尼族人群. 应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性( PCR-RFLP)方法分析Runx2基因第一启动子P1-330G/T位点等位基因多态性,应用RT-PCR TaqMan SNP基因分型技术分析Runx2基因第二启动子P2-1025 T/C位点等位基因多态性,并测序验证基因型. 采用超声测量仪测量研究人群右足跟骨的骨密度( BMD). 比较汉族人群和哈尼族人群在基因型分布和等位基因频率之间的差异,分析哈尼族人群BMD与影响因素之间的关系. 结果 Runx2基因P1-330G/T位点GG、GT、TT基因型分布以及G、T等位基因频率,Runx2基因P2-1025T/C位点TT、TC、CC基因型分布以及T、C等位基因频率在云南昆明地区汉族、云南红河地区哈尼族人群间无统计学差异( P>0.05 ).Runx2基因P1-330G/T位点GG和GT基因型,Runx2 基因P2-1025T/C位点TC和TT基因型在哈尼族人群BMD正常和减低组间的差异有统计学意义(P<0.05). Logistic回归分析显示,BMD与哈尼族人群Runx2基因P1-330 G/T位点、P2-1025T/C位点、以及年龄因素的OR值和95%CI分别为:1.337,0.649~2.756;0.132,0.024~0.710;1.101, 1.041~1.163. 结论 云南红河地区哈尼族与昆明地区汉族Runx2基因P1-330G/T位点和P2-1025T/C位点的基因型分布以及等位基因频率无人群间差异和地域性差异. Runx2基因P1-330G/T位点和P2-1025T/C位点的基因型分布以及等位基因频率在云南省红河地区哈尼族人群BMD正常和减低组间存在显著差异. Runx2基因P1-330G/T位点与BMD无关,年龄是BMD的危险因素,Runx2基因P2-1025T/C位点可能是BMD的保护因素,该位点的T等位基因可能是BMD的保护基因.
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构建靶向Runx2基因成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体
背景:研究表明成骨细胞特异性转录因子(Runx2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因.目前关于Runx2基因沉默后成骨细胞功能会发生怎样的变化,及如何沉默成骨细胞Runx2基因表达的相关研究未见报道.目的:构建靶向Runx2基因的小鼠成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体,为颅骨锁骨发育不全的研究提供实验依据.方法:根据预实验结果在含5 mg/L Polybrene的ENi.S培养液中,病毒按MOI=40进行感染,按病毒序号分为4组:NC组:pFU-GW-016PSC53349-1;KD1组:LVpFU-GW-016PSC60107-1;KD2组:LVpFU-GW-016PSC60108-1;KD3组:LVpFU-GW-016PSC60109-1.转染后16 h换液,72 h后,Celigo全视野细胞扫描分析仪观察检测基因的表达情况;两步法进行Real-Time PCR检测Runx2基因的沉默效果.结果与结论:①病毒转染后72 h,NC组未见荧光表达;KD1组可见少量荧光表达;KD2组荧光表达增强;KD3组可见强绿色荧光;②Real-Time PCR结果提示KD3组获得较好Runx2基因沉默效果;③实验成功构建靶向Runx2基因的MC3T3-E1细胞慢病毒载体,筛选出特异性抑制成骨细胞Runx2基因的病毒,并初步确定其作用的时间、相应的计量.
关键词： 组织构建 RUNX2基因 MC3T3-E1细胞 慢病毒 转染 -
Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响
背景:Runx2在成骨分化的信号途径中起核心作用,在诱导干细胞成骨分化及促进骨愈合方面具有重要的研究意义.目的:观察Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化的影响.方法:①扩增Runx2基因,利用腺病毒载体构建Runx2重组腺病毒(pAd-Runx2),检测病毒滴度后用重组腺病毒感染脐血间充质干细胞,并于荧光显微镜下观察荧光表达变化;②感染后1,3,7,14 d采用实时荧光定量PCR及Western blot检测脐血间充质干细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP的mRNA和蛋白表达.结果与结论:①成功制备pAd-Runx2重组腺病毒,病毒滴度为1.7×1010 pfu/L;②Runx2重组腺病毒感染脐血间充质干细胞后细胞形态呈成骨样细胞改变,对照组细胞无明显变化;③感染组细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP mRNA和蛋白的表达量随感染时间的增加均有不同程度的上调;④结果表明,高表达Runx2基因腺病毒感染脐血间充质干细胞,能够上调BMP-2、OCN、ALP基因的表达,从而促进脐血间充质干细胞的成骨分化.
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木犀草素对人牙周膜细胞增殖及成骨分化能力的影响
目的：探讨不同浓度木犀草素对人牙周膜细胞（PDLC）增殖及成骨分化能力的影响。方法：体外培养PDLC并进行组织来源鉴定，取第3代细胞进行实验。MTT四唑盐比色法、碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒、Q-PCR检测成骨相关基因等方法观察不同浓度木犀草素对PDLC增殖及成骨分化能力的影响。结果：MTT结果显示不同浓度的木犀草素可以促进PDLC增殖， ALP试剂盒检测结果表明木犀草素也可以促进PDLC的ALP活性，且浓度为1μmol/L的ALP OD值高。Q-PCR结果显示木犀草素可以上调PDLC内ALP及成骨转录因子mRNA的含量。结论：一定浓度的木犀草素对PDLC增殖及成骨分化能力有一定的促进作用，为未来木犀草素应用于临床治疗牙周疾病提供依据。
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Runx2、Osterix转录因子过表达驱动内皮细胞成骨分化的机制探讨
目的:探讨Runx2和Osterix (OSX)过表达对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成骨分化的调控作用.方法:通过慢病毒载体,将Runx2和Osterix基因分别转染入HUVECs.通过碱性磷酸酶(ALP)染色、半定量活性检测,探讨过表达Runx2和Osterix对HUVECs成骨分化的影响.通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色检测成骨相关标志物Runx2、OSX、ALP、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)在HUVECs中的表达.采用GraphPad Prism 6.01软件包对数据进行统计学分析.结果:Runx2过表达有利于HUVECs的成骨分化,而Osterix过表达则无此作用.HUVECs转染Runx2过表达慢病毒后,成骨相关基因Runx2、OSX、ALP、BSP、OPN及OCN的转录水平上调,同时Runx2、OSX、OPN及OCN的蛋白表达水平亦有所上调.结论:Runx2过表达可促进HUVECs的成骨分化.
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胶体金对MC3T3-E1增殖、分化及RUNX2基因表达的影响
目的 研究30 nm胶体金对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响.方法 体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1,在α-MEM培养液中加入不同体积的胶体金处理细胞,利用MTT法检测胶体金对成骨细胞增殖活性的影响,碱性磷酸酶活性测定及RT-PCR法分别检测其对成骨细胞分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响.结果 浓度为10-10、10-11、10-12 mg/L的胶体金均促进成骨细胞的增殖,且ALP相对活性及RUNX2基因表达也均高于阳性对照组.结论 30 nm胶体金能促进小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2的表达,进而促进成骨.
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Runx2基因调控及其异构体的新研究进展
Runx2基因编码成骨细胞特异性转录因子,调控成骨细胞分化和骨的形成.Runx2基因主要编码两种异构体,Runx2-TypeI和Runx2-TypeII,分别在骨质形成调控中发挥不同的作用.近发现多条信号转导通路如Wnt/LRP5/β-catenin、BMP/Smads/DPC4、1,25-二羟维生素D/VDR/VDRE 及多种调节蛋白如Msx2、Dlx5、Twists涉及Runx2的活性或表达的调控.这些研究为药物调控成骨细胞分化和骨质形成及基因治疗骨质疏松症开拓了新的思路.
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地塞米松对骨髓间充质干细胞Runx2表达的影响
表达同样减少.结论 大剂量地塞米松下调BMSC的Runx2 mRNA和蛋白表达,促进其成脂分化.
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先天性颅锁骨发育不全家系基因诊断探讨
目的 探讨家族性颅锁骨发育不全家系的基因诊断方法.方法 提取临床先天性颅锁骨发育不全两个家系中患者和健康成员外周血基因组DNA,PCR扩增RUNX2/CBFA1基因7个编码外显子及其侧翼内含子序列,分别进行正反向测序,测序结果与GenBank中的原始序列进行比对分析.根据人类基因突变命名规则确认测序发现的碱基突变.结果 测序结果发现一家系中2例父子患者的RUNX2基因外显子1发生错义突变c.346T→A(W116R);另一家系中2位患者的RUNX2基因外显子3发生无义突变c.610A→T(K204X).在2个家系中的健康成员和无关正常对照RUNX2基因DNA序列中没有发现上述突变.结论 RUNX2基因检测是对家族性颅锁骨发育不全家系进行基因诊断的准确有效方法,对其遗传咨询有重要意义.
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Runx2基因在糖尿病合并骨质疏松中的作用
目的 Runx2基因在糖尿病合并骨质疏松患者成骨细胞分化,软骨细胞成熟中的促进作用.方法 构建pLko.1-shRunx2-puro以及pWPI-Runx2-绿色荧光蛋白(GFP)质粒,通过序列测定和Western blot验证这两个质粒的正确性.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测Runx2基因沉默和Runx2过表达后,肿瘤坏死因子(TNF)-α和血管内皮生长因子(VEGF)水平变化,探讨Runx2在成骨细胞分化和软骨细胞成熟中的作用.结果 pLko.1-shRunx2-puro以及pWPI-Runx2-GFP质粒构建成功.真核表达后Runx2基因正常组,沉默组和过表达组VEGF的表达水平分别为373.78、10.94、4 161.54 μg/L;而3组TNF-α表达水平分别为62.04、0.22、615.08 ng/L.两者表达水平随着随着Runx2基因的沉默和过表达而降低和升高.结论 在糖尿病合并骨质疏松患者破骨细胞修复过程中,Wnt/β-环连蛋白(β-catenin)信号通路通过激活Runx2表达调节骨质形成.
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颅骨锁骨发育不全(CCD)患者RUNX2基因突变的研究
目的:对确诊为颅骨锁骨发育不全(cleidocranial dysplasia,CCD)的先证者RUNX2基因测序,了解其序列特征,认识CCD分子生物学水平成因,扩充RUNX2基因序列大数据.方法:通过临床症状和X线检查,确诊了1例CCD先证者,抽取该先证者及其家庭成员的外周血进行基因分析.发现该先证者RUNX2基因转录过程中新的突变点,并针对该突变点,采用PCR方法进行基因扩增后,进行基因突变分析.结果:从这例先证者的基因中发现了1个新的突变点——7号外显子上有1种在正常家庭成员中的基因序列中并不存在的新的错义突变(c 895T>C,Y299H).此突变将导致密码子895(p Tyr 299 His)相对应的氨基酸发生变化,即从1个翻译成色氨酸的密码子(TAT)变成了1个翻译成组氨酸的密码子(CAT).结论:首次在1例中国CCD患者中发现7号外显子新的错义突变位点(c 895T>C),补充了CCD疾病相关基因RUNX2变异库.
关键词： 颅骨锁骨发育不全(CCD) RUNX2基因 突变 -
RUNX2基因扩增与骨肉瘤组织上皮-间质转换和患者预后的关系
目的 探讨RUNX2基因扩增与骨肉瘤组织上皮-间质转换和患者预后的关系,旨在为分析RUNX2在介导骨肉瘤恶性生物学行为进展中的作用.方法 采用回顾性研究方法,选取我院诊治的骨肉瘤患者60例,同期选取癌旁组织30例,采用免疫组化Envision法检测RUNX2基因的蛋白水平,同时检测上皮-间质转换标记物E-cadherin和Vimentin的表达情况,采用相关分析RUNX2与上皮-间质转换的关系,同时采用生存曲线分析RUNX2基因表达与患者中位生存时间的关系.结果 RUNX2在骨肉瘤组织中的表达阳性率为68.33％,明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05);在41例RUNX2阳性组织中,上皮-间质转换发生率明显升高,表现为E-cadherin表达降低和Vimentin表达增加,明显高于RUNX2阴性组织(P＜0.05).RUNX2阳性组中患者的中位生存时间为(27.33±7.12)月,3年生存率为19.51％(8/41),明显低于RUNX2阴性组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 骨肉瘤组织中存在RUNX2基因异常扩增表达,并参与介导了上皮-间质转换的发生,后者与化疗耐药和患者预后关系密切.
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RUNX2突变牙髓细胞转化生长因子-β相关信号通路基因表达的分析
目的 利用第二代功能分类基因芯片检测颅骨锁骨发育不良患者成骨细胞特异性转录因子(runt-related gene 2,RUNX2)基因突变的牙髓细胞在转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)-骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号传导通路上的基因表达差异.方法 利用本课题组前期成功分离培养的携带RUNX2致病基因突变的牙髓细胞,通过第二代TGF-β/BMP信号传导通路功能分类基因芯片,进行实时定量PCR基因芯片,检测携带突变的颅骨锁骨发育不良患者牙髓细胞与正常牙髓细胞的基因表达差异,进行数据分析.结果 基因芯片的实时定量PCR结果分析表明,在TGF-β/BMP信号传导通路上,RUNX2基因突变的牙髓细胞有18条基因表达上调,14条基因表达下调.结论 RUNX2基因可能通过调节TGF-β/BMP信号传导通路相关基因表达而影响牙髓细胞生物学特性.
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颅锁骨发育不良的三个RUNX2基因新突变
目的 通过对3例散发的颅锁骨发育不良患者进行RUNX2基因编码区的扩增及测序,寻找RUNX2基因突变,为家系进行遗传咨询和产前诊断提供依据.方法 抽取患者及其父母外周血,提取基因组DNA,PCR扩增RUNX2基因的7个编码外显子并测序;并对患者突变所在外显子的PCR产物经T-A克隆后再次测序.结果 例1的RUNX2第1外显子发生了1个80bp的c.227_306del杂合性缺失突变,引起读码框移位并提前出现终止密码(p.Ala76GlyfsX58);例2的RUNX2第2外显子发生了1个c.471_472dupGG杂合重复突变,亦导致读码框改变及提前出现终止密码(p.Ala158GlyfsX19);例3的R UNX2第17显子发生了1个c.1321dupT杂合重复突变,同样导致读码框改变和提前出现终止密码(p.Ser370PhefsX13).这三个移码突变经查询HGMD突变数据库及国内外文献均未见报道.结论 发现了3种新的导致颅锁骨发育不良的RUNX2基因突变,新的突变扩展了RUNX2基因的突变谱,可为这些家系提供准确可靠的遗传咨询和产前诊断.
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两个新RUNX2基因突变引起家族性锁骨颅骨发育不全
目的 探讨RUNX2基因突变在锁骨颅骨发育不全病因研究中的意义及两个中国家族性锁骨颅骨发育不全家系发病的分子机制.方法 提取收集到的2个锁骨颅骨发育不全家系中4例患者和4名家系健康成员、102名无关正常对照外周血基因组DNA,应用PCR扩增产物双向直接测序方法 检测RUNX2基因第1～7外显子及相邻侧翼区的DNA序列,测序结果 与RUNX2基因正常序列对比分析.对发现的突变位点用酶切方法 证实.结果 测序结果 发现一家系中两例父子患者的RUNX2基因第1外显子发生错义突变c.346T＞A(W116R),该错义突变通过Bsr Ⅰ限制性内切酶对PCR扩增产物行酶切分析得到进一步确认.另一家系中两例患者的RUNX2基因第3外显子发生无义突变c.610A＞T(K204X).在两个家系中的正常家系成员和无关正常对照RUNX2基因DNA序列中没有发现上述突变.结论 通过RUNX2基因,检测在中国人群中发现两个RUNX2基因新致病突变,扩展了遗传性锁骨颅骨发育不全的基因突变谱,对阐明该病发病机制及其基因诊断和遗传咨询有重要意义.
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一例合并6q21-q22.31微缺失的锁骨颅骨发育不良患者的遗传学分析
目的 对1例发育迟缓伴多发畸形患儿进行遗传学检测,分析其预后及发生机制,为临床咨询提供依据.方法 采用常规G显带和微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization,aCGH)技术分析患儿及其父母的外周血染色体核型和DNA.结果 G显带分析结果显示,患儿染色体核型为46,XX,del(6)(q22),inv(6) (p21.1q21),其父母染色体核型未见异常.aCGH检测结果显示患儿6p21.1区存在800 kb杂合缺失,包含RUNX2基因,6q21-q22.31区存在11.79 Mb杂合缺失,其父母未检测到染色体微重复/微缺失.结论 患儿为染色体新发倒位,两处微缺失均为新发突变,具有致病性.6p21.1区域RUNX2基因微缺失导致锁骨颅骨发育不良,6q21-q22.31区域微缺失可能与患儿脑部结构发育异常相关.
