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利用乳糖化羧甲基壳聚糖构建小鼠OX40转基因细胞株
目的利用乳糖化羧甲基壳聚糖(Lac-CMCS)构建小鼠OX40转基因细胞株,探讨Lac-CMCS在HepG2细胞定向转染中的可行性.方法从Con A活化的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR方法,扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA,并将其克隆到pUCm-T载体,测序证实后构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体,利用Lac-CMCS与载体偶联靶向性转染HepG2细胞,G418筛选,RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株.结果pUCm-T-OX40和pIRES2-EGFP-OX40经PCR、酶切和测序分析,证实插入的目的片段与GenBank记载的小鼠OX40 cDNA序列完全一致.利用Lac-CMCS能将小鼠OX40靶向转染HepG2细胞并获得表达;经G418筛选后获得稳定表达小鼠OX40的细胞株.结论利用Lac-CMCS能够成功将OX40靶向转染入HepG2细胞中.
关键词： OX40 绿色荧光蛋白表达载体 乳糖化羧甲基壳聚糖 -
OX40信号上调Survivin表达对CD4+T淋巴细胞增殖存活的影响
目的探讨OX40信号抑制活化后CD4+T细胞凋亡,维持细胞存活及促增殖作用是否与Survivin相关.方法分离培养小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,以去除T细胞的脾细胞作为抗原呈递细胞,交联CD3单克隆抗体活化T细胞.用免疫印迹法比较不同时相点,加入OX40抗体及转染Survivin负显性突变体基因后,CD4+T细胞中Survivin蛋白表达差异.流式细胞仪检测Annexin v染色后细胞凋亡数量.[3H]-TdR掺入法测细胞增殖.结果CD4+T细胞活化后2～8 d,OX40抗体刺激可明显增强Survivin表达,并减少25%细胞凋亡;Survivin突变体降低Survivin蛋白表达后使凋亡增加22%.结论OX40信号能够通过上调Survivin表达来抑制CD4+T细胞凋亡,从而维持细胞存活和增殖.
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人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究
目的构建人OX40-Fc基因的真核表达质粒,并表达有生物学活性的纯化人OX40-Fc融合蛋白.方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX40膜外区cDNA编码基因,并导入真核表达载体pcDNA3中.测序证实后,进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中,采用脂质体法稳定转染COS-7细胞,用夹心ELISA检测其表达情况,经蛋白A亲和纯化,用SDS-PAGE与Western blotting进行鉴定.检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性.结果测序证实构建的OX40膜外区与OX40-Fc cDNA阅读框完整,连接部位序列正确;ELISA证实OX40-Fc蛋白的表达;SDS-PAGE与Westernblotting证实其为OX40-Fc蛋白.增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用.结论成功构建了人OX40-Fc真核表达载体,并使有生物学活性的OX40-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达.为进一步研究该蛋白在自身免疫性疾病治疗中的作用及调节免疫自稳机制中的地位奠定了基础.
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滤泡辅助性T细胞及亚群紊乱参与儿童过敏性紫癜发病机制初探
目的 探讨外周血滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells,Tfh细胞)及其亚类失衡在儿童过敏性紫癜(Henoch-Seh(o)nlein purpura,HSP)及紫癜性肾炎(HSP nephritis,HSPN)发生发展中的作用及可能机制.方法 收集确诊的HSP患儿45例,根据肾脏受累情况分为3组:无肾脏受累组(A组)21例,孤立性血尿组(B组)12例,血尿合并蛋白尿组(C组)12例,另收集同期在我院健康体检儿童17例为对照组.采用流式细胞术检测外周血中Tfh (CDTCD4+CXCR5+)细胞及其亚类Tfh1(CCR6-CXCR3+Tfh),Tfh2(CCR6-CXCR3-Tfh),Tfh17(CCR6+CXCR3-Tfh)比例,同时检测ICOS及OX40在Tfh细胞及其亚类上表达情况.结果 与对照组相比,A组和C组Tfh细胞及表达ICOS水平都明显增高(P＜0.05);C组Tfh2细胞、(Tfh2+Tfh 17)/Tfh1、Tfh细胞OX40和ICOS表达、Tfh2细胞ICOS表达均上调,而Tfh1细胞水平下调,差异有统计学意义(P＜0.05);A组和B组Tfh1细胞、Tfh2细胞、Tfh17细胞及这些亚类细胞上ICOS和OX40表达,均无统计学差异(P＞0.05).HSP各组间比较,C组Tfh细胞比例较A、B组有增高的趋势,但差异无统计学意义,A组和B组间Tfh细胞无差异(P＞0.05).进一步发现外周血Tfh细胞、Tfh2细胞、Tfh细胞上ICOS和OX40表达与血清IgA水平成正相关,而Tfh1细胞与IgA水平成负相关,Tfh17细胞与IgA无相关性.结论 Tfh亚类紊乱(Ifh2增加,Tfh1降低)参与了HSP及HPSN发生.而Tfh可能通过ICOS和OX40信号通路参与HSP高IgA血症,但其具体机制尚待进一步研究.
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共刺激分子OX40在抗感染免疫中的作用
正性共刺激分子OX40与多种疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应等)的发生、发展有关,能促进T细胞的活化和细胞因子的分泌.调节性T细胞通过免疫抑制与免疫耐受机制影响疾病的发展.本文主要就OX40/OX40L与调节性T细胞的关联性及其在病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原体引起的感染性疾病中的调节机制的研究进展进行简要综述.
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OX40/OX40L与急性冠状动脉综合征
急性冠状动脉综合征为一类慢性炎症性疾病,T细胞的激活是急性冠状动脉综合征的形成和发展的重要因素.OX40/OX40L是机体炎症反应中一对重要的信号通路,它们相互作用能促进CD4+T细胞的活化、增殖、迁移,因此OX40/OX40L可能参与急性冠状动脉综合征的形成.
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OX40基因rs17568A/G多态性与急性冠脉综合征的关联研究
目的 研究OX40基因rs17568A/G多态性在中国汉族人群中的分布以及与急性冠脉综合征(acutecoronary syndrome,ACS)的相关性.方法 共纳入228名中国汉族ACS患者和165名年龄性别匹配的正常对照,采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术对OX40基因rs17568A/G多态性位点进行基因型分型,同时采用DNA测序对酶切产物进行鉴定.结果 ACS组和对照组中均检出了AA、AG和GG3种基因型,ACS组和对照组中rs17568A/G多态位点G等位基因频率分别为29.4%和26.7%,差异无统计学意义(P>0.05).同时,基因型分布频率差异亦无统计学意义(P>0.05).在ACS组中,根据冠脉病变分组,在1、2或3支血管病变患者间G等位基因和基因型频率也没有发现差异.通过不同基因型的血脂分析发现,G等位基因携带者(AG+GG型)高密度脂蛋白胆固醇(high density cholesterol,HDL-C)水平显著高于AA纯合子(P<0.05).结论 OX40基因rs17568A/G多态性位点同中国汉族ACS的发生以及冠脉病变严重度问没有关联,但是G等位基因对于血清HDL-C水平有一定影响.
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纳米微粒偶联抗OX40/抗AFP抗体在细胞毒性T细胞抗肝癌中的作用
目的 探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-155抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CTL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响.方法 用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗AFP共价偶联.用扫描电镜观察所制得PLGA-NP纳米颗粒的形态；ZetaPlusTM粒度测定仪检测纳米微粒的粒径及电荷；用BCA蛋白定量方法检测纳米微粒偶联抗体的效率；用人外周血单核细胞诱导形成树突状细胞(DC),用AFP158-166抗原肽负载DC诱导AFP特异性的CTL/AFP158-166；分别用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1法(WST-1)法、ELISA及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测抗OX40/抗AFP-NP对CTL/AFP158-166细胞增殖能力、分泌IL-2和IFN-γ及杀瘤活性的影响.结果 所制得的PLGA-NP为圆形,大小较均一,粒径约为(300±42)nm,带负电荷,约为-(25.12 ±5.34) mV.蛋白定量显示每mg的PLGA-NP偶联约100μg抗体,偶联效率为25％；增殖和活化实验显示偶联有抗OX40的纳米微粒能显著刺激CTL的增殖、IL-2和IFN-γ的分泌；杀伤实验显示,抗OX40/抗AFP-NP能显著增强AFP特异性CTL/AFP158-166细胞对HepG2细胞特异性杀伤作用,而对SMMC-7721杀伤作用无明显效果.结论 抗OX40/抗AFP-NP能刺激CTL/AFP158-166细胞的增殖、细胞因子的分泌并增强CTL/AFP158-166细胞对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用.
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mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究
目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.
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急性冠脉综合征患者CD4+CD28-T细胞表面OX40和4-1BB表达上调
目的 探讨急性冠脉综合征(ACS)患者CD4+ CD28-T细胞表面OX40和4-1BB的表达及其临床意义.方法 采用流式细胞术检测57例ACS患者、46例稳定性心绞痛(SA)患者和60例健康体检者(HC)外周血CD4+ CD28-T细胞表面OX40和4-1BB的表达.结果 HC组、SA组和ACS组,三组相比CD4+ CD28-T细胞表面OX40的表达水平依次升高;HC组、SA组和ACS组,三组相比CD4+ CD28-T细胞表面4-1BB的表达水平依次升高.结论 ACS患者外周血CD4+ CD28-T细胞表面OX40和4-1BB表达上调.
关键词： 急性冠脉综合征 CD4+CD28-T细胞 OX40 4-1BB -
OX40和OX40L在原发性干燥综合征患者外周血中的表达及临床意义
目的 检测原发性干燥综合征(pSS)患者外周血单个核细胞表面共刺激分子OX40和OX40L的表达,并探讨其临床意义.方法 采用免疫荧光标记流式细胞技术检测51例pSS患者及36例健康志愿者外周血T细胞表面OX40的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面OX40L分子表达,比较11例初诊pSS患者治疗前后OX40和OX40L表达水平变化,分析其临床意义.结果 与健康志愿者相比,pSS患者外周血CD4+T细胞表面OX40表达显著增高(8.65％ ±3.51％ vs 5.68％ ±1.68％,P＜0.01),而CD8+T细胞表面OX40的表达无统计学差异.pSS患者表面OX40L的表达,在外周血中CD14+单核细胞(6.76％±3.60％ vs 3.15％±1.89％,P＜0.01)和CD19+B细胞(4.69％ ±2.40％ vs 2.76％ ±1.33％,P＜0.01)中均高于健康志愿者.活动期的pSS患者外周血OX40和OX40L的表达高于非活动期患者,伴发多系统损伤pSS患者外周血OX40和OX40L分子的表达显著高于单纯外分泌腺损伤患者.治疗后CD4+T细胞表面OX40的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面OX40L的表达显著下降.结论 pSS患者外周血单个核细胞表面OX40和OX40L异常高表达,且与疾病活动度、组织损伤及治疗密切相关.
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小鼠OX40稳定表达细胞株的构建及其对B细胞促分化作用的研究
目的: 构建稳定表达小鼠OX40的细胞株HUVEC,并探讨其对B细胞的促增殖作用. 方法: 从ConA活化的小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA, 应用RT-PCR法扩增小鼠OX40的cDNA, 并将其克隆到pUCm-T载体中,经PCR、酶切和测序分析,进而构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体.以脂质体法转染HUVEC,经G418筛选后,用流式细胞术检测OX40分子的表达.采用 3H-TdR掺入法,研究OX40信号对体外培养的B细胞的促分化作用.结果: 构建了OX40基因的真核表达载体.经PCR、酶切和测序证实, 插入的目的片段与GenBank登录的小鼠OX40 cDNA序列完全一致.用G418筛选后,获得能稳定表达小鼠OX40蛋白的HUVEC细胞.3H-TdR掺入法结果显示,小鼠OX40稳定表达的细胞HUVEC对体外培养的B细胞具有促增殖、分化的作用.OX40/OX40L信号与CD40/CD40L信号具有协同作用.结论: 成功地构建小鼠OX40稳定表达地细胞,OX40对B细胞具有促增殖、分化作用.
