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OX40及Bcl-2在红斑狼疮皮损及外周血淋巴细胞中的表达
目的:测定OX40及Bcl-2在红斑狼疮皮损及外周血淋巴细胞中的表达.方法: 采用免疫组化ABC法和半定量RT-PCR法,检测不同亚型红斑狼疮患者的皮损及活动期SLE患者外周血单一核细胞中OX40及Bcl-2的表达水平,并与正常人的皮肤和外周血淋巴细胞进行比较.结果: 不同亚型红斑狼疮的皮损及活动期SLE外周血淋巴细胞中OX40及Bcl-2的表达水平均增高,与正常人以上指标差异显著;而不同亚型红斑狼疮组间差异无显著性.结论:OX40及Bcl-2在红斑狼疮发病中可能发挥重要作用,为寻找红斑狼疮诊断与治疗的新靶点提供了新的思路.
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小鼠OX40真核表达载体的构建及表达
目的构建小鼠OX40的真核表达载体.方法从ConA活化的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR方法,扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA,并将其克隆到PUCm-T载体,经PCR、酶切和测序分析证实,进而脂质体法转染HUVECS,G418筛选,RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株.结果构建的pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体经PCR、酶切和测序分析,证实该片段与GeneBank记载的小鼠OX40cDNA序列完全一致.筛选获得能表达小鼠OX40蛋白的HUVECs转基因细胞.结论成功构建小鼠OX40转基因细胞,该克隆细胞为进一步研究OX40分子的功能奠定了基础.
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mOX40-hIgG1Fc真核表达载体的构建
目的 构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体.方法 从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,将其插入pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒.进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,再利用pcDNA3.1-hIgG1Fc重组载体构建pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,并经PCR、限制性酶谱分析和测序分析进行证实.结果 构建的pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,经PCR、限制性酶谱分析和测序分析,证实获得的hlgGIFc段及mOX40胞外段基因均与国际生物信息资源库GenBank登录的相应基因序列完全一致.结论 成功构建pCD-NA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,为OX40分子的进一步研究奠定良好的基础.
关键词： OX40 mOX40-hIgG1 Fc 真核表达 -
小鼠OX40原核表达载体的构建及表达
目的 构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达.方法 PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株B121(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达.结果 出现新增蛋白条带,融合蛋白主要存在于包涵体中;Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合.结论 构建了小鼠OX40基因的原核表达载体,获得OX40胞外段融合蛋白.
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人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定
目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.
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食管鳞状细胞癌组织中 PD-1、CD45 RO 和 OX40的表达
目的：探讨食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中程序性细胞死亡1（PD-1）、CD45RO和OX40的表达状况及意义。方法：应用免疫组化SP法检测118例ESCC、39例癌旁不典型增生及39例正常食管组织中PD-1、CD45 RO和OX40的表达情况。结果：3种组织中PD-1、CD45 RO和OX40的阳性表达率差异有统计学意义（χ2＝32．923，24．171，33．008， P＜0．001）。 ESCC组织中3者的表达明显高于正常组织（P＜0．01）。 OX40的表达与ESCC患者的TNM分期、淋巴结转移有关（χ2＝8．787，9．756，P＜0．05），PD-1、CD45RO的表达与ESCC患者临床病理指标无关（P＞0．05）。 ESCC组织中OX40与CD45RO的表达呈正关联（rP ＝0．351，P＜0．001）。结论：PD-1、CD45RO和OX40可能在ESCC恶变过程中发挥了重要作用。 OX40可能与ESCC的侵袭和转移有关。
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阻断OX40和CD40协同共刺激信号延长小鼠胰岛移植物存活时间
目的 研究阻断OX40/OX40L和CD40/CD154L协同共刺激通路对小鼠胰岛移植物存活的影响及其机制.方法 以DBA/2小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者,制作胰岛移植模型.受鼠分为4组.(1)对照组,注射IgG; (2)抗OX40组,注射抗OX40L单克隆抗体；(3)抗CD154组,注射抗CD154单克隆抗体；(4)联合治疗组,注射抗OX40L单克隆抗体和抗CD1 54单克隆抗体.记录各组胰岛移植物平均存活时间(MST).将CD154敲除小鼠处死,取其脾脏T淋巴细胞,体外检测活化T淋巴细胞表面OX40的表达；在活化T淋巴细胞中加入不同浓度的抗OX40L单克隆抗体,体外检测T淋巴细胞增殖情况.结果 对照组胰岛移植物MST为19 d,抗CD154组胰岛移植物MST为48 d(P＜0.05)；抗OX40组胰岛移植物MST为22 d,与前两组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；联合治疗组胰岛移植物MST＞ 150 d,高于另外3组(P＜0.05).66％的胞表达OX40,较初始T淋巴细胞的表达率高(2％,P＜0.05)；加入抗OX40L单克隆抗体后,T淋巴细胞增殖受抑制且呈剂量依赖性.结论 阻断OX40/OX40L和CD40/CD154L双通路可诱导小鼠胰岛移植物长期存活, 其发挥作用的关键机制是抑制了T淋巴细胞的增殖.
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抑制记忆性T淋巴细胞共刺激分子OX40延长小鼠胰岛移植物的存活时间
目的 观察抑制记忆性T淋巴细胞共刺激分子OX40延长胰岛移植小鼠存活时间的作用,探讨其作用机制.方法 采用免疫磁珠法制备初始性、类记忆性及记忆性CD8+T淋巴细胞,并采用逆转录聚合酶链反应法检测3种T淋巴细胞上OX40的表达量.将C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞经尾静脉注射给Rag-/-小鼠.将Rag-/-小鼠分为3组,对照组:给予同型IgG;治疗组:给予抗OX40L单克隆抗体;基因敲除组:输注的T淋巴细胞由OX40基因敲除的C57BL/6小鼠供给.T淋巴细胞输注6周后,使用链脲霉素诱导建立糖尿病模型,然后以DBA/2小鼠为供者,进行胰岛移植,移植后观察和比较3组间胰岛移植物的存活时间.结果 OX40在初始性、类记忆性和记忆性T淋巴细胞上的相对表达量分别为2.87、111.24和146.15,类记忆性和记忆性T淋巴细胞间OX40表达量的差异无统计学意义(P＞0.05),但均显著高于初始性T淋巴细胞(P＜0.01).对照组、治疗组和基因敲除组胰岛移植物的存活时间分别为21、130和125 d,治疗组和基因敲除组间胰岛移植物存活时间的差异无统计学意义(P＞0.05),二者均显著长于对照组(P＜0.05).结论 OX40在记忆性T淋巴细胞表面高表达,且阻断OX40共刺激分子通道可明显延长胰岛移植物的存活时间,抑制OX40/OX40L共刺激通道可能是诱导胰岛移植免疫耐受的关键点之一.
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靶向OX40/OX40L通路对CD4+CD25+调节性T细胞诱导移植耐受的影响
目的 观察OX40/OX40L共刺激通路在调节性T细胞(Treg)诱导移植耐受中的作用.方法 建立小鼠胰岛移植模型,分3组:IgG组、抗-OX40L单抗(RM134L)+抗-CD154单抗( MR1)组、联合RM134L+ MR1及抗-CD25单抗(PC61)组.存活超过150 d小鼠切除移植侧肾脏,在对侧行同或不同主要组织相容性复合体( MHC)的2次胰岛移植.观察各组平均存活时间(MST).检测效应性T细胞(Teff)、野生型和CD154敲除小鼠Treg OX40表达.检测同基因小鼠胰岛、胰岛移植不加或加RM134L+ MR1治疗的移植物内Foxp3表达.Treg与Teff加或不加OX40激动剂(OX86)以不同比例共培养,检测Teff增殖抑制情况.结果 RM134L+ MR1组MST为＞150 d(n =8),较IgG组(19d,n=5)和联合PC61组(23 d,n=4)明显延长(P＜0.05).同或不同MHC的2次胰岛移植MST分别为＞60 d(n=3)和17 d(n =3) (P ＜0.05).OX40在Teff不表达,在野生型和CD154敲除小鼠Treg表达.3组小鼠胰岛移植物内Foxp3相对表达量分别为8、21、123 AU(P ＜0.05).Teff与Treg以1∶2和1∶4共培养,β-液体闪烁计数仪测定Teff的核素每分钟计数(CPM)分别为63×103和41×103,与对照组(140×103)比较增殖受抑制(P＜0.05),加OX86时CPM值分别为128×103和135×103 (P ＞0.05).结论 CD4+ CD25+ Treg在诱导移植耐受中发挥重要作用,OX40在其中发挥负性调节作用.
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siRNA干扰OX40/OX40L通路对小鼠移植心脏的免疫保护作用
目的 观察真核表达载体介导siRNA对小鼠移植心脏的免疫保护作用.方法 在C57/BL6J→BALB/C组合[主要组织相容性复合体(MHC)不合]、DBA/2→BALB/C组合[次要组织相容性复合体(mHC)不合]中分别于小鼠心脏移植术后第1、4天胸腺注射生理盐水,pRNAT-CTL阴性对照载体和pRNAT-OX40 siRNA,观察移植心脏存活情况.术后第7天取移植心脏行病理学检查,取血清检测心肌酶谱,取脾脏行逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测OX40mRNA表达和OX40膜蛋白表达.结果 在C57/BL6J→BALB/C组合中(MHC不合),pRNAT-OX40siRNA组移植心脏生存时间较生理盐水组和阴性对照组无明显延长,移植心脏病理学检查无明显改善.而在DBA/2→BALB/C组合中(mHC不合),pRNAT-OX40 siRNA组小鼠移植心脏生存时间较生理盐水组和阴性对照组显著延长,病理改变显著减轻,乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、肌钙蛋白(Tn)以及脾脏OX40 mRNA表达和OX40膜蛋白表达与空白对照组和阴性对照组比较明显下降.结论 在DBA/2→BALB/C组合中(mHC不合),单独阻断OXdO/OX40L通路对小鼠移植心脏有保护作用.在C57/BL6J→BALB/C的组合中(MHC不合),单独阻断OX40/OX40L通路未发现对移植心脏的保护作用.
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针对OX40小于扰RNA供体转染抗大鼠肝移植排斥反应
目的 观察RNA干扰阻断OX40-OX40L共刺激通路对大鼠移植肝存活时间的影响.方法 制作DA大鼠到Lewis大鼠的原位肝脏移植模型,移植前取预先制备的5 ml含5×109pfu的pLVTHM-OX40-siRNA重组慢病毒,灌注感染移植供肝30 min,术后观察受者存活时间,移植肝脏进行组织病理学检查;采用ELISA法检测大鼠外周血IL-2,IFN-γ,的水平,并进行受者大鼠脾细胞对供者大鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应(MLR).结果 转染组受者肝脏移植物的存活时间为(74.00±3.79)d,明显长于对照组和未转染组;转染组移植肝组织炎细胞侵润、间质水肿、肝组织坏死程度较对照组和未转染组减轻,实验组大鼠脾细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力降低(P<0.01);移植术后的第7天,转染组血清IL-2浓度为(46.0±8.4)ng/L,IFN-γ浓度为(202.7±14.6)ng/L,均显著低于对照组和未转染组(P<0.05).结论 转染靶向OX40的siRNA,在体内可通过阻断OX40-OX40L共刺激通路,抑制大鼠肝脏移植后的排斥反应,延长大鼠移植肝的存活时间.
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OX40及Bcl-2在变应性鼻炎中的表达
目的:探讨OX40及Bcl-2在变应性鼻炎(AR)发病机制中的可能作用.方法:取23例AR患者(AR组)和20例单纯鼻中隔偏曲患者(对照组)为研究对象,应用免疫组织化学技术分别检测OX40及Bel-2的表达,并分析OX40与Bcl-2表达的相关性.结果:在AR患者鼻黏膜中,OX40及Bcl-2的表达都显著上调,除CD4+T细胞外,均在鼻黏膜上皮细胞、腺体细胞、血管内皮细胞呈显著性表达(均P<0.01).平均吸收度值(A值)OX40为0.239 4±0.033 5,Bcl-2为0.237 3±0.042 1,与对照组相比,均P<0.01.AR患者鼻黏膜中OX40与Bcl-2的表达呈正相关(r=0.869 0,P<0.05).结论:AR患者存在OX40共刺激分子的异常表达,Bcl-2在鼻黏膜组织中表达异常增高.
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OX40-OX40L轴对动脉粥样硬化小鼠淋巴细胞活性氧和亲环素A表达的调控作用
目的 探讨OX40-OX40L相互作用对C57BL/6J小鼠活性氧(ROS)水平及亲环素A(CyPA)表达的影响.方法 采用C57BL/6J小鼠颈动脉硅胶圈置入法快速建立动脉粥样硬化斑块模型,免疫组织化学法检测颈动脉粥样硬化(As)斑块内CyPA的表达;小鼠淋巴细胞表达CyPA采用Western Blot检测;采用流式细胞术检测CD4、OX40及细胞内ROS水平.结果 C57BL/6J小鼠形成As斑块后,淋巴细胞表达OX40较非As小鼠明显增加,同时发现As小鼠淋巴细胞内ROS水平和CyPA表达水平显著增加;体外应用anti-OX40特异性刺激OX40-OX40L轴后,淋巴细胞表达OX40及ROS水平显著上调,anti-OX40L特异性阻断OX40-OX40L后,淋巴细胞OX40表达减少,细胞分泌ROS水平较刺激组降低(P＜0.05);体外培养淋巴细胞6h,刺激组分泌的CyPA水平明显高于抑制组(P＜0.001).结论 OX40-OX40L相互作用能调控动脉粥样硬化小鼠活性氧水平及亲环素A表达.
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OX40/OX40L与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化为一种慢性炎症疾病.T细胞与动脉粥样斑块炎症反应关系密切.OX40/OX40L是机体炎症反应中一对重要的信号通路,参与T细胞的活化、增值、迁移,在动脉粥样硬化的形成和发展中起到重要的作用.本文就OX40/OX4OL的生物学特性以及与动脉粥样硬化相关性做一综述.
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肺结核患者外周血T淋巴细胞上OX40的表达水平
目的 比较肺结核病人和健康人群外周血单个核细胞(PBMC)和T淋巴细胞上共刺激分子OX40的表达水平,以及辅助性T细胞亚群,包括Th1、Th2、Th9和调节性T细胞(Treg)在两组人群中的差异,进而探索OX40的表达水平与结核病进程以及CD4+T细胞功能亚群分化的相关性.方法 选取2015年11月至2016年4月于广州胸科医院住院治疗的42例肺结核患者作为肺结核(TB)组,健康对照(HC)组40名来自中山大学附属第一医院门诊体检的健康志愿者.收集研究对象血浆,分离出PBMC,采用流式细胞术检测各组PBMC和T淋巴细胞上OX40的表达;检测Th1、Th2、Th9和Treg细胞的比例.结果 肺结核组PBMC、CD4+T、Treg细胞上OX40的表达以及OX40+细胞比例均明显低于健康对照组,差异有统计学意义(P均<0.05);肺结核组CD4+T细胞中Th1、Th2和Treg亚群比例均明显高于健康对照组,而Th9亚群比例明显低于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);Treg细胞比例和Treg细胞上OX40+比例呈负相关(r2=0.3474,P<0.05).结论 肺结核患者外周血CD4+T淋巴细胞OX40的表达明显降低,并且肺结核患者Treg比例的增加可能与其OX40表达降低有关.
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小鼠心脏移植中阻断 OX40信号通路诱导免疫保护的实验研究
目的：为了探讨真核表达载体介导siRNA在小鼠移植心脏术后的免疫保护作用。方法我们选用次要组织相容性复合体不合的小鼠分成三组作心脏移植并于移植术后第1天、第4天对三组移植小鼠的胸腺分别注射生理盐水、pRNAT-CTL 阴性对照载体和 pRNAT-OX40siRNA。在小鼠移植心脏术后第7天取移植小鼠心脏、血清、脾脏分别进行病理学免疫组化检查、心肌酶谱检测以及OX40mRNA和OX40膜蛋白表达的检测。结果 pRNAT-OX40siRNA组较生理盐水组和阴性对照组，小鼠移植心脏生存时间显著延长，病理改变显著减轻，谷草转氨酶（AST）、肌钙蛋白（Tn）、乳酸脱氢酶（LDH）以及OX40mRNA和OX40膜蛋白表达与空白对照组和阴性对照组相比明显下降，差异具有显著性。结论小鼠次要组织相容性复合体不合的心脏移植中阻断OX40／OX40L免疫通路能够诱导免疫保护效应。
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OX40/OX40L在动脉粥样硬化不稳定斑块中的作用
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症疾病[1],炎症反应参与了在AS的发生发展、斑块破裂及血栓形成的所有阶段.T细胞的激活是AS发生、发展中重要的炎性致病因素[2].体内存在多种激活T细胞的受体一配体信号通路,近年来OX40/OX40L受体一配体途径与AS的发生、发展逐渐受到关注.
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狼疮肾炎患者外周血中ICOS、OX40、CD40表达量与病情活动的相关性研究
目的:研究狼疮肾炎(LN)患者外周血中ICOS、OX40、CD40表达量与病情活动的相关性.方法:选择在本院诊断为稳定期狼疮性肾炎患者和活动性狼疮性肾炎患者,分别作为稳定期LN组和活动性LN组;选择同期体检的健康志愿者作为对照组.测定外周血单个核细胞中ICOS、OX40、CD40的mRNA表达量及血清中细胞因子、病情活动相关指标的含量.结果:稳定期LN组和活动性LN组患者外周血单个核细胞中ICOS、OX40、CD40的mRNA表达量以及血清中IL-4、IL-5、IL-10、抗C1q抗体、抗,ds-DNA抗体的含量均显著高于对照组,血清中TNF-α、IFN-γ、C3、C4的含量均显著低于对照组;活动性LN组患者的上述变化较稳定期LN组更为显著;LN患者外周血单个核细胞中ICOS、OX40、CD40的mRNA表达量与血清中IL-4、IL-5、IL-10、抗C1q抗体、抗ds-DNA抗体的含量呈正相关,与血清中TNF-α、IFN-γ、C3、C4的含量呈负相关.结论:LN患者外周血中ICOS、OX40、CD40的高表达与Th1/Th2的偏移、病情的活动密切相关.
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芦荟多糖对炎症性肠病小鼠免疫功能及OX40、OX40L表达的影响
目的 观察芦荟多糖对炎症性肠病(IBD)小鼠免疫功能及对OX40、OX40L表达的影响并探讨其机制. 方法 采用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导法制备IBD小鼠模型,随机分为模型组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组(514 mq/kq)及芦荟多糖低(150 mq/kq)、中(300 mq/kq)、高(600 mq/kq)剂量组,每组10只,另设正常对照组10只,连续给药10 d后,计算各受试小鼠疾病活动指数(DAI)积分,苏木素-伊红(HE)染色观察肠黏膜组织损伤情况,检测胸腺及脾脏指数、碳粒吞噬指数、溶血素水平及结肠组织中OX40、OX40L蛋白表达水平. 结果 与正常对照组比较,模型组小鼠结肠黏膜组织细胞排列稀疏紊乱,可见大量炎性细胞浸润,疾病活动指数积分、胸腺系数、脾脏系数、吞噬指数K、校正吞噬指数α、半数溶血值、结肠黏膜组织中OX40、OX40L蛋白表达水平均明显增高(P＜0.05);与模型对照组比较,芦荟多糖低、中、高剂量组小鼠肠炎症状明显减轻,疾病活动指数积分、胸腺系数、脾脏系数、吞噬指数K、校正吞噬指数α、半数溶血值、结肠黏膜组织中OX40、OX40L蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05). 结论 芦荟多糖可能通过下调OX40、OX40L表达,减弱炎症性肠病小鼠免疫功能而实现对IBD的治疗作用.
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OX40和OX40L与自身免疫性疾病
自身免疫性疾病多数目前病因和发病机制尚未完全阐明.免疫应答异常在其中扮演非常重要的角色.近年研究发现OX40和OX40L相互作用对抗原特异性T细胞的增殖和生存具有重要意义.本文综述了OX40和OX40L的表达和调控、OX40和OX40L相互作用的生物学功能、自身免疫病中OX40和OX40L的表达和作用.
