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人CD226 (PTA1)分子胞膜外区截短体真核表达载体的构建、表达及其识别结构域的分析
目的确定一套CD226单克隆抗体(McAb)识别CD226分子胞膜外区结构域的部位. 方法应用计算机软件分析CD226分子蛋白质序列疏水性,确定其亲水性区域.采用PCR方法扩增CD226分子基因序列,分别缺失相应亲水性区域,构建CD226截短体重组真核细胞表达载体pcDNA3-PTA1T1和pcDNA3-PTA1T2.测序正确后,转染COS7细胞,抗CD226分子多克隆抗体间接免疫荧光染色,流式细胞术检测CD226分子截短体的表达.表达成功后,采用间接免疫荧光染色和流式细胞术分析,用一套CD226 McAb检测与截短突变体的免疫反应性,从而确定CD226 McAb识别CD226分子结构域的部位. 结果 PCR扩增出CD226分子相应目的片段序列,定向克隆入pcDNA3真核表达载体,DNA序列测定正确.转染COS7细胞后,流式细胞术检测CD226截短体分子有较高水平的表达.CD226 McAb Leo A1、New E1和FMU1～7均可识别CD226全长分子;Leo A1、New E1、FMU1、FMU2、FMU4和FMU5与截短突变体PTA1T1和PTA1T2均无反应性;FMU3可结合PTA1T1分子,不结合PTA1T2分子;FMU6和FMU7均可结合PTA1T1及PTA1T2分子. 结论 CD226 McAb Leo A1、New E1、FMU1、FMU2、FMU3、FMU4和FMU5识别CD226分子胞膜外区D1结构域,其中FMU3识别的位点位于V1和V2环之间;FMU6和FMU7识别D2结构域.
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CD226与临床相关疾病
1985年Burns等[1]以活以的T细胞为免疫原制备了抗活化T细胞表面抗原的单克隆抗体,并将其中一株单抗Leo-A1识别的抗原命名为T细胞系特异性水活化抗原1(TLiSA1),实验证实其参与了CTL的活化和分化.
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噬菌体展示法筛选抗人 PTA1单克隆抗体结合肽
目的从噬菌体展示文库中筛选能与抗人 PTA1单克隆抗体 (mAbs)特异性结合的短肽。方法采用 protein-A亲和层析法纯化系列抗人 PTA1mAbs，通过流式细胞术检测筛选出能够阻断 PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的 mAb，经过三轮亲和筛选，从噬菌体随机 12肽库中筛选可特异性结合 mAb的重组噬菌体阳性克隆，进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析。结果确定了能够阻断 PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的 mAb为 LeoA1，得到了 13个具有特异性结合 LeoA1的重组噬菌体阳性克隆，序列测定结果发现，这些可结合 LeoA1的短肽，有较保守而集中的模式序列，即 WPXHHX序列。结论这些具有保守模式序列的短肽，有可能模拟 PTA1分子的功能表位，成为其天然配体拮抗剂的候选肽段。此外， PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定，也为今后寻找天然配体和进一步深入研究 PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。
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血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响
目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响.方法:①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达.②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量.结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24 h、 48 h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、 5.64%)(P<0.05).②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8 h、 24 h、 48h释放PDGF的量(1 593、 2 625、 2 175 ng/L)明显高于正常孕妇组(235、 405、 133.5ng/L)差异显著(P<0.01).③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24 h、 48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3 266、 2 360 ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05).结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放.
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CD226在猴睾丸分布的免疫组织化学研究
1985年， Burns等 [1]以活化的 T细胞为免疫原，制备了抗活化 T细胞表面抗原的单克隆抗体 (mAb)，并将其中 1株 mAb Leo-A1识别的抗原命名为人 T细胞谱系特异性活化抗原 1(T lineage-specific activation antigen 1, TLiSA1)。 mAb Leo-A1在混合淋巴细胞反应中，可抑制细胞毒 T细胞 (cytotoxic T lymphocytes, CTL)分化。随后 Scott等 [2]发现， TLiSA1也高表达于血小板表面，可刺激血小板的活化和凝集，遂将此抗原重新命名为血小板 /T细胞活化抗原 1(platelet and T cell activation antigen 1,CD226)。研究表明， CD226与免疫相关性疾病有密切关系，这些疾病主要包括：自身免疫性疾病、病毒性感染、肿瘤及移植排斥反应 [3]。人类生殖腺、生殖细胞及其所产生的激素都具有抗原性，当机体免疫功能紊乱时，可导致免疫反应，影响生殖过程。然而，关于睾丸组织能否表达 CD226及其可能与生殖免疫、男性不育等的相关研究，尚无有关文献报道。为此，我们采用小鼠抗 CD226 mAb 做 ABC免疫组化染色观察了 CD226在猴睾丸中的定位与分布。
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抗人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)不同表位单克隆抗体的制备及鉴定
目的研制一套可识别PTA1分子不同功能性表位的单克隆抗体(mAb)。方法采用亲和层析法从血小板裂解液中纯化的天然PTA1分子免疫Balb/c小鼠，以间接ELISA筛选阳性杂交瘤，并以PTA1 cDNA转染COS7细胞，进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。竞争结合试验确定mAb识别PTA1分子的表位。纯化的PTA1经SDS-PAGE后，转移到PVDF膜，确定mAb是否可用于Western blot。结果共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为FMU1，FMU2，FMU3，FMU4，FMU5，FMU6和FMU7。所有mAb与纯化天然PTA1和PTA1/Ig融合蛋白均有良好的免疫反应性，均可识别PTA1 cDNA转染的COS7细胞。流式细胞仪检测阳性荧光峰型与PTA1阳性对照Leo Al mAb的荧光峰型相似；7株mAb识别PTA1分子的5个不同表位；FMU1，FMU2，FMU4，FMU5，FMU6和FMU7可应用于Western blot。结论成功地制备7株抗PTA1分子的特异性mAb，这些mAb可分别识别PTA1的5个表位，为PTA1分子结构与功能的研究提供了新的手段。
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PTA1参与活化内皮细胞和淋巴细胞间粘附的形态学观察
血小板T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen1,PTA1)是1997年基因克隆的新分子,主要表达于血小板、活化T细胞和NK细胞表面,参与血小板的凝集、CTL的分化和NK细胞的杀伤等功能[1].
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小鼠PTA1(CD226)胞膜外两个结构域同时与小鼠Tage4(CD155)的相互作用
目的:确定mPTA1分子与mTage4参与相互作用的结构域,以深入研究这两种分子的功能. 方法: 扩增编码mTage4全长分子和mPTA1,hICAM-1分子不同结构域的DNA序列,构建含mTage4,mPTA1不同结构域编码序列的截短体、mPTA1/hICAM-1荧光蛋白嵌合体分子基因的真核表达载体,并转染COS-7真核细胞,通过激光共聚焦扫描显微镜研究这两种分子间的相互作用. 结果: DNA序列测定证实成功构建了含mTage4全长分子和mPTA1截短体、mPTA1/hICAM-1嵌合体分子基因的真核表达载体,激光共聚焦扫描显微镜观察结果表明mPTA1截短体分子和mPTA1/hICAM-1嵌合体分子不能与mTage4有效结合,而mPTA1全长分子能与mTage4相互作用. 结论: mPTA1分子胞膜外区两个结构域同时参与了与mTage4的相互作用.
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AP1对人CD226/PTA1启动子的调控作用
目的: 确定血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)基因的转录起始点,及激活蛋白1(AP1)对PTA1启动子的调控作用. 方法: 采用5′-RACE方法确定PTA1基因的转录起始点;将含AP1的真核表达载体和含有PTA1启动子的荧光素酶的报告基因载体共转染人肝癌细胞系HHCC,培养48 h后检测其荧光素酶活性. 结果: 人PTA1基因的转录起始点定位于ATG上游229 bp处,AP1可以显著地增强PTA1启动子P1和P2的活性,转录因子ets1对AP1上调P1和P2活性有不同的调控作用. 结论:PTA1的转录起始点位于ATG上游229 bp处,AP1可能参与调控PTA1的表达.
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PTA1配体表达的免疫组化研究
INTRODUCTION T lineage specific activation antigen 1 (TLiSA1), first reported by Burns in 1985[1], was renamed PTA1 in 1989 because of its expression on platelets as well[2]. Since 1985, a lot of investigations have been done on PTA1 expression, its functions and its relationship with diseases. PTA1, mainly expressed on activated T cells, platelets and megakaryocytes lineage, was involved in signal transduction of T cell activation and differentiation as well as platelet activation and aggregation. PTA1 mAb (Leo-A1) was found to stimulate activation and aggregation of platelets and inhibit differentiation of CTL.
