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报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型的建立
目的 建立稳定的报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型,对细胞内病毒蛋白和核酸的表达水平进行定量.方法 把neo抗性基因插入到Luc-JC1中,构建Luc-JC.将体外转录的Luc-JC RNA转染Huh7细胞,经筛选后获得的G418抗性克隆,通过荧光素酶活性检测、Western blot和HCV NS3/4A对eYFP-MAVS的切割试验进行鉴定.用IFN-α处理筛选到的细胞,观察细胞中荧光素酶活性、HCV相关蛋白和RNA的变化,对复制细胞在抗病毒药物评价方面的应用进行初步验证.结果 G418加压筛选得到了多个含HCV全基因组的细胞克隆.在细胞克隆中,荧光素酶活性检测观察到萤火虫荧光素酶;Western blot检测到HCV NS3和NS5A蛋白的表达;由于NS3/4A的切割,eYFP-MAVS的定位由线粒体转移到细胞质.IFN-α处理阳性克隆细胞,荧光素酶活性、HCV蛋白表达和RNA水平明显降低.结论成功建立稳定的报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型,报告基因能用来指示细胞内HCV蛋白和RNA的表达水平,为进一步开展HCV致病机制研究和治疗药物筛选奠定了基础.
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异体骨髓细胞在不同基因型辐照受鼠中动态分布与迁移规律研究
目的 观察异体小鼠骨髓细胞在不同基因型辐照小鼠体内的分布迁移规律和归巢特点.方法 分离萤火虫荧光素酶转基因C57BL/6J小鼠的骨髓细胞,分别输入γ射线辐照的C57BL/6J小鼠、CB6F1小鼠和BALB/c小鼠体内；在不同时间点,以活体成像仪观察供体骨髓细胞在受体内的动态分布和迁移规律.结果 供体骨髓细胞输注1h后,BALB/c小鼠肺脏中出现荧光且强度强,与C57BL/6J小鼠和CB6F1小鼠肺脏的荧光强度差异有统计学意义(P=0.000)；24 h后肺脏中荧光信号消失；48 h后在肺脏中又检测到荧光信号并逐渐增强.供体骨髓细胞输注4h后,各组小鼠均可在脾脏中检测到微弱荧光,C57BL/6J和CB6F1小鼠脾脏中荧光信号强度的差异无统计学意义(p=0.4051),而BALB/c小鼠和C57BL/6J、CB6F1小鼠脾脏的荧光强度差异有统计学意义(P=0.0012,P=0.001);48 h后各组小鼠脾脏中荧光均有增强,BALB/c小鼠脾脏中的荧光信号强度显著强于C57BL/6J和CB6F1小鼠(P=0.000).供体骨髓细胞输注24 h后各组小鼠肠系膜中均可检测到较弱的荧光信号,48 h后肠系膜中的荧光强度逐渐增强,BALB/c小鼠肠系膜表达的荧光强度强于CB6F1、C57BL/6J小鼠,差异有统计学意义(P=0.000),72 h后肠系膜的荧光强度继续增强,BALB/c小鼠肠系膜的荧光强度强于CB6F1小鼠,差异有统计学意义(P=0.000),CB6F1小鼠肠系膜的荧光强度强于C57BL/6J小鼠,但是两者之间的差异无统计学意义.结论 异体骨髓细胞通过尾静脉输入基因型相合、半相合和全不相合辐照小鼠体内,细胞均首先分布到肺脏,然后依次向肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结迁移,后定居于骨髓微环境后进行造血重建.异基因骨髓细胞输入基因型全不相合小鼠体内后,在脾脏和肠系膜中的分布要多于基因型相合和半相合的小鼠.
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分子生物学中报告基因的主要类型及应用现状
报告基因技术在分子生物学领域中已经广泛应用于基因表达调控、启动子活性分析、信号转导、受体功能鉴定以及基因治疗、药物筛选等领域,而且随着技术和检测方法的进步,不断有新的更加灵敏和非损伤性的报告基因出现,尤其是一些不影响细胞繁殖、能够实时检测的荧光报告基因的发展更为迅速.该文从报告基因的使用现状出发,对其主要的种类、特征、应用及发展趋势进行论述.
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红色荧光蛋白和荧光素酶双表达稳定肺癌细胞系的建立
目的 构建能稳定表达红色荧光蛋白(RFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)的人肺癌细胞系,为建立活体成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型及治疗研究奠定基础.方法 构建含Fluc和RFP基因的慢病毒载体pHBLV-Fluc-RFP,转染293T细胞进行病毒包装,用获得病毒液感染人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,再用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株,后分别采用荧光显微镜和实时定量PCR检测稳定感染细胞中RFP和Fluc的表达.结果 成功构建了pHBLV-Fluc-RFP慢病毒载体,获得了稳定表达Fluc和RFP的A549、H1975和K562细胞.荧光显微镜下可观测到3种稳定感染细胞中均有红色荧光.实时定量PCR检测结果显示,3种稳定感染细胞中Fluc基因的相对表达量远远高于对应的野生型细胞,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).结论 获得的RFP和Fluc双表达人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,为人肺癌细胞免疫缺陷小鼠模型的活体成像提供了新荧光配色细胞模型.
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分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤
背景：胚胎干细胞具有多向分化潜能，已被用于急性肝损伤的治疗，但其在体内治疗过程中的增殖迁移情况尚不清楚。
目的：利用分子影像技术监测移植胚胎干细胞在急性肝损伤修复过程中的行为。
方法：利用慢病毒载体，将萤火虫荧光素酶、红色荧光蛋白以及单纯疱疹病毒胸苷激酶三融合基因转入小鼠胚胎干细胞(D3)中，筛选得到稳定整合3个报告基因的D3胚胎干细胞系。将上述胚胎干细胞或分化了6 d的拟胚体细胞通过脾脏注射到急性肝损伤SV129模型小鼠体内，利用生物发光成像技术监测移植的细胞。
结果与结论：RT-PCR结果显示，三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞Oct-4和Nanog的表达。利用小动物活体成像系统可以观察到移植细胞从脾脏迁移到肝脏的过程。移植的胚胎干细胞和拟胚体细胞都在肝脏处形成畸胎瘤，由于单纯疱疹病毒胸苷激酶同时也是自杀基因，可以与更昔洛韦作用诱导转基因细胞死亡，通过注射更昔洛韦来抑制畸胎瘤的生长并逐步将其杀死。组织学分析显示，畸胎瘤里包含来自于3个胚层的组织。提示三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞的多向分化潜能，且胚胎干细胞用于细胞治疗有潜在的成瘤风险，影响了对肝损伤的修复，治疗策略有待进一步改进，并需要实时监控其在体内的行为。 -
荧光素酶标记的HBV细胞模型的建立
建立萤火虫荧光素酶(Fluc)为报告基因标记的乙型肝炎病毒(HBV)体外感染的细胞模型.利用分子亚克隆技术,以pAAV/1.2HBV质粒为模板,PCR扩增带有反向重复序列(ITR)的1.2倍HBV基因组片段,反向插入真核表达载体pGL3-CP-Fluc中,构建Fluc标记的HBV基因组表达质粒pGL3-CP-Fluc HBV1.2,并将此质粒转染至Huh-7细胞中.全自动免疫分析仪进行HBsAg、HBeAg的定量检测,生物发光检测仪检测Fluc其在细胞的表达水平.成功构建了1.2倍HBV全基因真核表达载体,稳定转染Huh 7细胞后,质粒在细胞中高水平表达Fluc,并可以正常分泌HBsAg、HBeAg.重组质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2能在Huh-7细胞中表达,其稳定转染的细胞可作为一种新型的HBV体外感染模型,为抗病毒药物研究奠定基础.
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小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建
目的 构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光索酶表达载体,并检测其在P19细胞中的表达.方法 采用PCR方法获得WNT1基因启动子小功能单位和3'UTR区域在内的DNA片段.双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受WNT1启动子控制.将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-SV40(表达海肾荧光素酶)共转染P19细胞,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性.结果 重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,空白对照组(荧光强度比值:2.8204±0.2944)与对照组(荧光强度比值:3.0508±0.3037)及WNT-3' UTR突变组(荧光强度比值:51.4758±0.9837)比较,差异均有统计学意义(Pa＜0.001),该重组表达载体在P19细胞特异性高表达萤火虫荧光素酶.结论 成功构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在P19细胞的特异性表达.
关键词： WNT1 P19细胞 pGL3-Basic 基因表达载体构建 萤火虫荧光素酶 -
大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建
目的 构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达.方法 采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的 片段(-298～﹢283),双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制.将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-CMV(表达海肾荧光素酶)共转染原代培养皮质神经元,24 h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性.结果 重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶.结论 成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达.
关键词： GluR2 神经元 pGL3-Basic 基因表达构建 萤火虫荧光素酶 -
骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的多模态体内示踪分子成像
目的 利用多聚乙烯-超顺磁性氧化铁(PEI2k-SPIO)标记带有萤火虫荧光素酶(Luciferase)的SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs/Luciferase),探索多模态成像活体示踪BMSCs移植治疗急性心肌梗死的可行性.方法 PEI2k-SPIO成功标记BMSCs/Luciferase细胞后行普鲁士兰染色及MTT验证标记的有效性及安全性.超声引导下原位移植至SD大鼠急性心肌梗死模型的梗死心肌边缘,分别在移植后1d和1周行磁共振成像(MRI)及移植后1 d、2 d、3 d和1周行光学成像.结果 MTT结果显示PEI2k-SPIO标记的BMSCs/Luciferase细胞与未标记BMSCs/Luciferase细胞间存活细胞率差异无统计学意义(P＜0.05).MRI在细胞移植后1d能观察到注射区域低信号,移植后1周未观察到低信号影;移植后1、2、3d可同时探测到生物发光,移植后7d未检测到生物发光.结论 多模态分子成像可同时示踪移植干细胞的位置和判断细胞存活状态.
关键词： PEI2k-SPIO 萤火虫荧光素酶 骨髓间充质干细胞 生物发光 磁共振成像 -
水泡性口炎病毒载体共表达的热休克蛋白70可以增强抗人诺瓦克病毒的黏膜免疫
作为病原体，人类诺瓦克病毒（ NOV ）占全球非细菌性胃肠炎的95％。目前，没有可用于对抗人类NOV病毒的疫苗，因为它不可培养，而且缺乏小动物模型。近研究表明，表达人类NoV 衣壳蛋白（rVSV-VP1）的重组水泡性口炎病毒（rVSV）在小鼠体内引起强烈的免疫应答。为了进一步改善候选疫苗的安全性和有效性，热休克蛋白70（HSP70）被插入到rVSV-VP1骨架载体。作为双重插入，萤火虫荧光素酶（ luc）基因插入到HSP70，形成第二构建物。相比 rVSV-VP1，所得到的重组病毒（ rVSV-HSP70-VP1和rVSV-luc-VP1）在小鼠体内的细胞繁殖和病毒传播有所衰减。在接种剂量为1．0×106 PFU时，相对于 rVSV-VP1， rVSV-HSP70-VP1触发了显著增高的阴道IgA应答；相对于rVSV-luc-VP1，诱导显著加强的粪便和阴道IgA 应答，尽管血清IgG和T细胞的应答是相似的。在接种剂量为5．0×106PFU 时，rVSV-HSP70-VP1比rVSV-VP1刺激显著增高的T 细胞应答，粪便及阴道 IgA 应答。当rVSV-VP1和rVSV-HSP70构成联合疫苗时，粪便和阴道IgA应答也显著上升。总的来说，这些数据表明：（ⅰ）插入一个附加的基因（ HSP70或 luc ）到rVSV-VP1骨架，可以进一步衰减以VSV为基础的疫苗在体外和体内的毒性，从而提高了候选疫苗的安全性；（ ii ） HSP70增强基于VSV的人NOV疫苗引发的人类NOV病毒特异的黏膜和T细胞的免疫。
