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荧光显微数字成像系统对神经元内游离钙的动态测量
目的研究神经元内Ca2+浓度的动力学变化,建立动态检测细胞内Ca2+浓度的方法.方法原代培养大鼠大脑神经元,以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)刺激神经元,用荧光显微数字成像系统测定Ca2+浓度的变化.结果荧光显微数字成像系统测量的细胞荧光图像分析显示,神经元Ca2+在NMDA的刺激下迅速发生改变,并被全程记录.结论以荧光显微数字成像系统实时监测细胞内Ca2+的动力学变化,不失为一种代替激光共聚焦显微镜测量细胞内游离钙的有效方法.
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共聚焦激光扫描显微镜技术在研究大鼠海马神经元胞内钙超载中的应用
目的观察抑制性氨基酸牛磺酸对兴奋性氨基酸谷氨酸所致胞内钙超载的影响.方法选择Fluo-3/AM对培养的海马神经元进行着色后,用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)实时扫描,动态显示海马神经元二维图像,以计算机相应软件对胞内钙的荧光强度变化进行分析统计.结果在0.5 mmol/L谷氨酸作用下,胞内钙荧光强度迅速升高(P＜0.001);0.5 mmol/L谷氨酸与3 mmol/L牛磺酸共同作用于海马神经元时,胞内钙荧光强度明显降低(P＜0.001);灌流液中去除牛磺酸后,胞内钙荧光强度上升(P＜0.001).结论抑制性氨基酸牛磺酸可抑制由兴奋性氨基酸谷氨酸所致神经元的胞内钙超载;CLSM以其独特的优势,在高清晰度地显示海马神经元形态的同时,也可动态地观察活细胞在不同环境下胞内钙的快速变化以及定量分析.该技术在动态观察和二维图像的高分辨率上比传统测钙方法有更大的优越性.
关键词： 共聚焦激光扫描显微镜 Fluo-3 牛磺酸 胞内钙 大鼠海马神经元 -
腺苷对缺氧时海马神经元内游离Ca2+的影响
实验用Fluo-3负载细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下直接监测缺氧后分散培养的大鼠海马CA1区神经元内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化,观察腺苷对这种变化的影响并初步探讨其作用机制.结果发现,急性缺氧使海马神经元[Ca2+]i显著升高;腺苷(100μmol/L)明显抑制缺氧引起的[Ca2+]i增高,腺苷A1受体拮抗剂CPT以及K+通道阻断剂4-AP和ATP敏感性K+通道阻断剂glipizide均可拮抗腺苷的抑制作用.结果表明,腺苷通过其A1受体介导,可能激活4-AP和/或ATP敏感性K+通道,从而抑制缺氧引起的海马神经元胞内Ca2+升高.
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布比卡因对大鼠心室肌细胞内钙的影响
目的:运用激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度的布比卡因对KCl诱导的大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,进而探讨布比卡因心肌抑制作用的可能机制.方法:培养新生SD大鼠心室肌细胞,将培养的心室肌细胞随机分为4组,分别为对照组(C组)、10 μmol/L 布比卡因组(B1组)、50 μmol/L 布比卡因组(B2组)、100 μmol/L 布比卡因组(B3组).各组细胞均用钙荧光指示剂Fluo-3/AM染色,运用激光扫描共聚焦显微镜动态观察单个心室肌细胞内钙荧光强度(fluorescent intensity, FI)的变化.结果:与对照组比较 10 μmol/L 的布比卡因对KCl诱导的大鼠心室肌细胞内钙FI变化无明显影响(P＞0.05),50 μmol/L 和 100 μmol/L 的布比卡因则明显抑制KCl诱导的钙离子跨膜内流(P＜0.05);抑制程度B3组》B2组(P＜0.05).结论:低浓度的布比卡因对KCl诱导的大鼠心室肌细胞内[Ca2+]i的变化无明显影响,高浓度则明显抑制钙离子跨膜内流.布比卡因呈浓度依赖性抑制兴奋收缩耦联时心室肌细胞内游离钙离子内流,可能是其心肌抑制作用的原因之一.
关键词： 布比卡因 心室肌细胞 激光扫描共聚焦显微镜 细胞内钙离子 Fluo-3 -
多非替利衍生物CPU 228(V03)对大鼠心室肌细胞钙瞬变的调节
目的:在β-受体激动情况下,研究多非替利衍生物CPU 228对电刺激触发心肌细胞的胞浆Ca2+浓度([Ca2+]i)变化及钙瞬变动力学参数的影响.方法:游离单个大鼠心室肌细胞,Fluo-3/AM负载,电刺激诱发心室肌细胞钙瞬变,定量测定心室肌细胞内Ca2+浓度变化,异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)100nmol·L-1激动β-受体,观察CPU 228 1 μmol·L-1对钙瞬变动力学参数、[Ca2+]i及钙负荷水平的影响.结果:CPU 228 1 μmol·L-1对大鼠心室肌细胞[Ca2+]i的影响不明显(P>0.05);ISO 100 nmol·L-1显著升高大鼠心室肌细胞[Ca2+]i和细胞内钙负荷水平,缩短钙瞬变时程,并且增加钙瞬变的消除速率.CPU 228 1 μmol·L-1显著抑制ISO的上述作用.结论:在β-受体激动情况下,CPU 228可以降低心肌细胞[Ca2+]i,使ISO改变的钙瞬变动力学参数恢复到正常水平.
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黄芪甲苷对心肌细胞L型钙电流及细胞内钙的影响
目的 研究黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对豚鼠心室肌细胞L型钙电流和细胞内钙的影响.方法 分离单个豚鼠心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术测定钙电流,并采用荧光显微镜CCD成像系统动态观察细胞内钙(intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)变化.结果 1×10-6 mol · L-1 AS-IV可明显抑制ICa-L,使大电流峰值降低32.6%.AS-IV对60 mmol·L-1 KCl诱导的[Ca2+]i升高有抑制作用,大荧光密度变化值从1.17±0.30(n=6)降低到0.26±0.16(n=5,P<0.05).AS-IV可直接促进钙池内钙释放,使[Ca2+]i从0.08±0.02(n=10)升高到0.23±0.07(n=8,P<0.05).结论 AS-IV抑制L型钙通道,可减少细胞外钙内流;同时它促进内钙释放,对心肌细胞内钙稳态表现为双向调节作用.
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丹酚酸B镁抑制ATP和KCl诱导大鼠主动脉平滑肌细胞内钙的升高
目的研究丹酚酸B镁(Magnesium lithospermate B,MLB)对去内皮离体血管舒缩反应以及对血管平滑肌细胞内游离钙浓度[Ca2+]i的影响.方法去内皮大鼠胸主动脉血管环等张收缩实验和采用钙离子荧光指示剂Fluo-3,运用F-4500阳离子测定系统动态检测胸主动脉平滑肌细胞[Ca2+]i.结果血管舒缩实验显示,无钙或常钙条件下MLB对血管基础张力均无作用.MLB 50～200 μmol·L-1预给药组抑制无钙条件下苯肾上腺素(PE) 1 μmol·L-1诱导的血管收缩以及常钙条件下KCl 60 mmol·L-1诱导的血管收缩,并呈浓度相关性.而钙离子通道阻滞剂维拉帕米(Ver) 10 μmol·L-1则完全阻断KCl诱导的血管收缩.在复钙实验中观察到,MLB 50～200 μmol·L-1不仅抑制PE 1 μmol·L-1诱导的内钙依赖性血管收缩,而且对复钙后外钙依赖性的血管收缩也有抑制作用.细胞内钙测定实验表明,MLB预孵育的AVSMCs静息态[Ca2+]i没有变化.无钙条件下,MLB 50、100和200 μmol·L-1抑制ATP 20 μmol·L-1诱导内钙释放引起的[Ca2+]i升高,抑制率分别为17.4%、32.4%和61.1%,显示较好的浓度相关性.AVSMCs于常钙条件下用Thapsigargin耗竭钙库后,KCl 60 mmol·L-1诱发外钙内流,引起[Ca2+]i升高,10 μmol·L-1的Ver则能完全阻断这种外钙内流.在MLB预给药组,KCl诱导的[Ca2+]i升高降低,抑制率分别为20.0%、32.8%和52.6%.结论 MLB能够抑制PE、高K+和复Ca2+诱导的血管收缩,并能抑制ATP和KCl诱导的血管平滑肌细胞内钙的升高,提示MLB对血管平滑肌细胞内钙的影响可能与抑制细胞内钙释放和电压依赖性钙通道有关.
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牛磺酸对H2O2引起的大鼠血管平滑肌细胞核［Ca2+］及胞浆［Ca2+］变化的影响
目的毒性剂量H2O2可引起细胞坏死或凋亡, 此过程是否与H2O2引起的核［Ca2+］（［Ca2+］n）变化有关未见报导。本文研究牛磺酸对H2O2引起的血管平滑肌细胞（VSMC）［Ca2+］n与胞浆［Ca2+］(［Ca2+］c)的变化影响。方法应用激光共聚焦显微镜对负载Fluo-3的培养大鼠VSMC的［Ca2+］n及［Ca2+］c变化进行研究。结果在0.5% H2O2作用下，［Ca2+］n与［Ca2+］c持续升高，用抗氧化细胞保护剂-牛磺酸20 mmol*L-1预处理细胞，可降低H2O2引起的［Ca2+］n 升幅 (P<0.05)，但不影响［Ca2+］c升幅(P>0.05)，表明［Ca2+］n变化与［Ca2+］c变化对牛磺酸反应性存在差异。结论 VSMC的核Ca2+调控与胞浆Ca2+调控各自具有一定的独立性。牛磺酸对H2O2引起的大鼠VSMC核Ca2+的变化具有保护作用。
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九节龙皂甙对Hela细胞生长的抑制作用
目的观察九节龙皂甙(Ardiusilloside)对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用.方法九节龙皂甙6.25 mg*L-1处理Hela细胞0～72 h,在不同时间点采用光镜观察Hela细胞形态,以琼脂糖凝胶电泳检测Hela 细胞凋亡DNA的梯形带;应用特异性Ca2+荧光探测剂Fluo-3/AM在LSCM条件下检测不同时期细胞内Ca2+分布情况.结果光镜下体外培养的Hela 细胞在九节龙皂甙作用24 h开始出现细胞质皱缩和细胞核凝缩等凋亡的形态学特征.60、72 h均检测出DNA梯形带等凋亡的生物化学特征.诱导Hela 细胞48、60、72 h内Ca2+严重超载且维持在较高浓度水平.结论九节龙皂甙对体外培养的Hela 细胞具有明显的抑制作用且诱导Hela 细胞凋亡发生;细胞凋亡时细胞内[Ca2+]增加且维持在较高水平.
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马桑内酯对大鼠海马神经元细胞内游离钙离子浓度的影响
以荧光探针Fluo-3/AM为胞浆内游离钙特异性指示剂,通过激光扫描共聚焦显微镜动态监测急性分离SD大鼠(出生后7～14 d)海马神经元细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化情况,以了解钙离子及钙通道在癫痫发病中的作用,探讨马桑内酯(coriaria lactone, CL)调节神经细胞内钙稳态的机理.实验发现,CL能使急性分离大鼠海马神经元[Ca2+]i增加;nifedipine和低浓度NiCl2虽可延迟,但不能完全阻断这种作用.除促使电压依赖的T-、L-型钙离子通道开放外,CL尚可通过其他途径增加海马神经元内[Ca2+]i,改变细胞兴奋性而致痫.
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应用Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4测定H2O2诱导的A549细胞凋亡过程中的[Ca2+]i变化
背景与目的肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，Ca2+对于肿瘤细胞凋亡有重要的调控作用。实时监测肺癌细胞内Ca2+水平，有助于深入研究Ca2+介导肺癌细胞凋亡的分子机制。本研究旨在观察Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4在H2O2诱导的A549细胞凋亡过程中的应用，实时测定胞浆Ca2+浓度（[Ca2+]i），探讨[Ca2+]i与细胞凋亡的关系，并比较两种Ca2+探针在荧光强度及[Ca2+]i测定值方面的差异。方法采用Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4负载细胞，1 h后用不同浓度的H2O2刺激细胞，激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况。结果在相同的探针浓度、负载时间和相同的图像采集参数的条件下，选定细胞内fluo-4平均荧光强度高于fluo-3。50 mM H2O2刺激后，A549细胞胞浆内[Ca2+]i迅速升高，通过公式计算发现采用fluo-3探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是112.2 nM-1,069.6 nM，采用lfuo-4探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是7.6 nM-505.4 nM。同时发现经H2O2刺激后，凋亡细胞百分比明显增加（P<0.01）。结论H2O2促进A549细胞内Ca2+释放，诱导细胞凋亡。Ca2+探针lfuo-4可能更适合于监测含量较低的细胞中[Ca2+]i变化。
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川芎与天麻的不同配伍对体外培养大鼠皮层神经元正常和缺氧状态下[Ca2+]i的影响
目的遵循传统医学的药物配伍理论,研究川芎与天麻不同配伍对正常及缺氧情况下神经元胞浆[Ca2+]i的影响,寻找中药配伍和创新中药的理论基础.方法采用体外培养4～6 d的大鼠皮层神经元,分为生理盐水空白对照,95%乙醇本底对照, 尼莫地平阳性对照,实验组(1～5号药对,川芎与天麻的比例分别为4∶1、1∶4、4∶0、0∶4、1∶1,各药对分别配制成50、100、150 μg*ml-1 3个浓度),再分为两部分,一部分持续通入94.5%N2和5.5%CO2的混合气体4 h制备缺氧模型,一部分在正常状态下孵育4 h,以特异性荧光探针Fluo-3为胞浆内Ca2+指示剂负载神经元,用激光扫描共聚焦显微镜动态监测药对对神经元胞浆[Ca2+]的影响.结果缺氧4 h后神经元胞浆内[Ca2+]较缺氧前明显增加,川芎的醇提部分、川芎与天麻以1∶4配伍作用时,较小剂量(50 μg*ml-1)对正常及缺氧时的神经元均有降低胞浆[Ca2+]的作用(P＜0.05),川芎的醇提部分100 μg*ml-1作用明显减轻缺氧神经元钙超载的同时不影响正常情况下神经元胞浆内外的钙离子平衡,与此同时其它川芎与天麻的配伍或只降低正常情况下的胞浆[Ca2+],或无作用,或在大剂量时出现反转作用.结论川芎醇提物以及川芎与天麻以一定比例配伍时具有拮抗神经元胞浆[Ca2+]增加的作用,与剂量相关,支持中药配伍理论,为创新中药的发展提供细胞学基础.
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川芎醇提取物对马桑内酯致痫神经元胞浆游离钙的影响
目的研究川芎醇提取物对马桑内酯致痫神经元胞浆内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的作用,寻找创新中药的理论基础.方法采用体外培养4～6 d的大鼠皮层神经元,分为生理盐水空白对照组、乙醇本底对照组、尼莫地平阳性对照组、川芎醇提取物干预组.以胞浆内Ca2+特异性荧光探针Fluo-3负载神经元后,分别加入马桑内酯80、120 μg*ml-1作用5 min,用激光扫描共聚焦显微镜动态监测药物对神经元胞浆[Ca2+]的影响.结果马桑内酯120 μg*ml-1促进神经元[Ca2+]荧光强度增加,乙醇抑制马桑内酯所致神经元胞浆内[Ca2+]增加,尼莫地平有这种作用趋势却无统计学意义,川芎的醇提部分100 μg*ml-1能够抑制马桑内酯导致的神经元胞浆Ca2+荧光强度增加(P<0.05).结论川芎的醇提部分对致痫神经元有钙通道拮抗作用,为创新中药的发展提供细胞学基础.
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Ca2+荧光蛋白探针Cameleon和荧光染料探针fluo-3测定H2O2刺激的A549细胞中Ca2+浓度变化
目的:本研究旨在观察Ca2+荧光蛋白探针Cameleon和荧光染料探针fluo-3在H2O2刺激的A549细胞中的应用,实时测定细胞质Ca2+浓度([Ca2+]i),并比较两种Ca2+探针在荧光曲线及[Ca2+]i测定值等方面的差异.方法:采用Ca2+荧光蛋白探针Cameleon YC3.6转染A549细胞,24h后用50mmol/L H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化.采用Ca2+荧光染料探针fluo-3负载细胞,1h后用50mmol/L H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化.采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况.结果:采用Cameleon探针转染的细胞中,反映[Ca2+]i变化的R值曲线迅速升高后逐渐降至刺激前水平,通过公式计算发现[Ca2+]i变化范围是33.1-596.1 nmol/L.采用fluo-3探针负载的细胞中,反映[Ca2+]i变化的荧光强度F值曲线逐渐升高至稳定,通过公式计算得到[Ca2+]i变化范围是131.8-695.6 nmol/L.同时发现经H2O2刺激后,凋亡细胞百分比显著增加(P＜0.01).结论:Ca2+荧光蛋白探针Cameleon YC3.6和荧光染料探针fluo-3均检测到H2O2诱导的细胞内[Ca2+]i变化,Cameleon YC3.6可能更灵敏地反映快速变化的钙信号.
关键词： Cameleon YC3.6 Fluo-3 H2O2 Ca2+ 细胞凋亡 -
降钙素基因相关肽对心肌细胞缺血缺氧状态下胞内钙的影响
目的观察降钙素基因相关肽(CGRP)对急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下胞内钙的影响. 方法急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下,以Fluo-3 作为钙指示剂,用共聚焦显微镜测定胞内钙的变化. 结果急性缺血缺氧时, 心肌细胞胞内钙浓度降低,加入CGRP后,钙浓度恢复;先加入CGRP,再在缺血缺氧的条件下, 胞内钙浓度基本保持不变. 结论 CGRP可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内钙浓度降低.
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兔实验性食管炎食管平滑肌细胞内钙离子浓度的变化
目的: 观察兔急性实验性反流性食管炎与正常兔食管体部平滑肌细胞内钙离子浓度的变化. 方法: 20只成年新西兰大白兔(体重1.5 kg～1.8 kg)随机分成两组. 一组用0.1 mol/L HCl在距食管下括约肌(LES)上方6 cm处连续灌注兔食管4 d,1 mL/min,30 min/d. 用牵拉式方法在腔内测定灌注前与灌注后LES上方5 cm处食管内压. 急性分离食管体部距食管下括约肌上方5 cm处平滑肌细胞制成细胞悬浮液. Flou-3做为钙指示剂,共聚焦显微镜分别测定细胞内钙[Ca2+]i. 结果: 正常兔食管体部平滑肌细胞内钙浓度为(134.6±4.03) nmol/L. 急性实验性反流性食管炎兔食管体部平滑肌细胞内钙浓度为(113±5.90) nmol/L. 统计学处理(P<0.01)有显著统计学差异. 食管压力灌注前(0.064±0.0176) kPa,灌注后-(0.035±0.0176) kPa (P<0.01)有显著统计学差异. 结论: 急性实验性食管炎兔食管体部平滑肌细胞内钙浓度明显低于正常食管体部平滑肌细胞.
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风湿性心脏病心房纤颤和非心房纤颤患者心房肌细胞内钙离子浓度变化
目的 观察风湿性心脏病(RHD)心房纤颤(AF)患者心房肌细胞内是否存在 Ca2+超载. 方法 急性分离RHD伴AF和非AF患者的心房肌细胞，用Fl uo-3作为钙指示剂，用共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+浓度. 结果 A F组心房肌细胞内Ca2+浓度明显高于非AF组心房肌细胞内Ca2+浓度(517±98) n mol.L-1 vs (262±65) nmol.L-1，两组间差异显著（P<0.01）. 结论 RHD伴AF患者心房肌细胞内存在Ca2+超载.
