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安神汤含药血清对皮质酮损伤的PC12细胞PKC活性的影响
安神汤临床除治疗失眠症外,还用于以情绪或神志障碍为主要表现的精神神经系统疾病,有确切的抗焦虑作用.本研究拟在前期工作的基础上,以高浓度皮质酮诱导PC12细胞凋亡模拟焦虑症神经细胞损伤状态,以细胞凋亡的信号转导机制为背景,以胞内钙信号转导为切入点,观察安神汤含药血清对皮质酮干预的PC12细胞蛋白激酶C(PKC)活性的影响.
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培养的小鼠小肠和胃Cajal间质细胞起搏电流的特性
目的:探讨培养的小鼠小肠和胃Cajal间质细胞(ICC)起搏电流的特性.方法:用二型胶原酶分离ICC并在含有干细胞因子的培养液中培养,72 h后通过免疫组织化学方法进行鉴定.利用传统全细胞模式膜片钳技术记录胃窦和小肠ICC的起搏电流.把电极内液的钙螯合剂EGTA浓度由0.1 mmol/L增加到10 mmol/L,使游离钙浓度降低,观察细胞内低钙对起搏电流的影响.结果:培养72 h后的ICC在光镜下表现出自胞体发出2-4条长突起,并与邻近ICC突起相互连接成网络状;激光共聚焦显微镜下观察到ICC表面酪氨酸激酶受体c-kit表达呈阳性;膜电位钳制在-60 mV的条件下,ICC上可以记录到自发而节律性内向电流,即起搏电流.在胃和小肠ICC之间以及单个ICC和ICC网络之间,电流幅度、频率有差异.在传统的全细胞膜片钳模式下,通过增加电极内液中EGTA浓度使细胞内游离钙降低时,可以激活ICC的内向电流;在细胞外给予钙调蛋白抑制剂W-7时,可以激活ICC内向电流的同时明显增加起搏电流的幅度.结论:小鼠胃和小肠ICC产生的起搏电流频率与小鼠胃和小肠自律运动的频率非常接近;网络ICC产生的起搏电流比单个ICC稳定、幅度高、频率快;ICC内游离钙浓度的降低是产生起搏电流的重要因素;钙调蛋白在ICC内参与起搏电流的抑制性调节.
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钙调蛋白激酶Ⅱ信号途径与肥厚心肌心律失常
多种心血管疾病均可引起心肌肥厚,严重者可导致恶性室性心律失常,引起心源性猝死.室性心律失常发生与肥厚心肌电重构有密切关系,肥厚心肌更易发生早期后除极(EAD)或延迟后除极(DAD).Ca2+作为第二信使,通过其浓度在空间和时间上的变化将信号转化为广泛多样的生物化学效应,如维持细胞电生理的稳定状态等.Ca2+/CaM依赖的CaMK Ⅱ途径可以通过多种方式调节胞内钙的浓度,其功能异常可能引起肥厚心肌胞内钙稳态失衡,进而引起心律失常.调整CaMK Ⅱ的异常活性为临床防治肥厚心肌心律失常提供了新的生物学靶向性治疗途径.
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PF4对MO7e细胞系的趋化作用及其作用机制
血小板四因子(PF4)是由4个相同的亚基组成的同源四聚体,是CXC趋化因子家族成员.已经证实PF4具有多种生物学作用,如抑制血管新生、放疗和化疗保护、调节造血、抑制巨核细胞集落形成、参与止血血栓、免疫反应等.
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心房肌胞内钙浓度变化对心房颤动患者小电导钙激活钾通道电流的影响
目的:SK通道存在于心肌细胞上,其中SK2亚型主要表达在心房.SK2通道对胞内游离钙离子高度敏感,可快速将钙离子浓度的变化转换成细胞膜电位变化.本实验应用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞SK2电流,观察心房肌细胞SK2电流在窦性患者和心房颤动患者之间的差别,以及电极液中不同的钙浓度对两组细胞SK2电流的影响.方法:将接受体外循环手术的患者分为两组:心房颤动组和窦性心律组.以心房肌细胞为研究对象,用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞电流,观察窦性组与房颤组SK2通道电流的差异以及两组细胞SK2电流对电极液中钙敏感性的不同.结果:在全细胞穿孔膜片钳模式下,电极液中游离钙离子浓度为5×10-7 mol/L时,记录到房颤组SK2通道电流明显大于窦性组,尤其是在超极化水平.膜电位在-130 mV时,窦性组与房颤组的SK2通道电流密度分别为(-2.92±0.35)pA/pF(n=6),(-6.83±0.19) pA/pF(n=3,P＜0.05).在电极液游离钙离子浓度分别为0 mol/L、5×10-7 mol/L、10-6moL/L,膜电位为-130 mV时,窦性组SK2通道电流密度分别为(-1.43±0.33)pA/pF(n=7),(-2.92±0.35) pA/pF(n=6),(-10.11±2.15)pA/pF(n=8,P＜0.05);房颤组SK2通道电流密度分别为(-2.17±0.40) pA/pF(n=4)(-6.83±0.19)pA/pF(n=3)(-14.47±2.89) pA/pF(n=4)(P＜0.05).结论:人心房肌细胞SK2通道具有电压不敏感、内向整流、apamin敏感的特性.电极液中钙浓度相同的情况下,房颤组的SK2电流密度明显大于窦性组,SK2通道电流对钙离子的敏感性高于窦性组,提示SK2通道钙敏感性增加可能与心房颤动的发生发展密切相关.
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共聚焦激光扫描显微镜技术在研究大鼠海马神经元胞内钙超载中的应用
目的观察抑制性氨基酸牛磺酸对兴奋性氨基酸谷氨酸所致胞内钙超载的影响.方法选择Fluo-3/AM对培养的海马神经元进行着色后,用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)实时扫描,动态显示海马神经元二维图像,以计算机相应软件对胞内钙的荧光强度变化进行分析统计.结果在0.5 mmol/L谷氨酸作用下,胞内钙荧光强度迅速升高(P＜0.001);0.5 mmol/L谷氨酸与3 mmol/L牛磺酸共同作用于海马神经元时,胞内钙荧光强度明显降低(P＜0.001);灌流液中去除牛磺酸后,胞内钙荧光强度上升(P＜0.001).结论抑制性氨基酸牛磺酸可抑制由兴奋性氨基酸谷氨酸所致神经元的胞内钙超载;CLSM以其独特的优势,在高清晰度地显示海马神经元形态的同时,也可动态地观察活细胞在不同环境下胞内钙的快速变化以及定量分析.该技术在动态观察和二维图像的高分辨率上比传统测钙方法有更大的优越性.
关键词： 共聚焦激光扫描显微镜 Fluo-3 牛磺酸 胞内钙 大鼠海马神经元 -
胞内钙平衡在培养的牛主动脉内皮细胞低氧和复氧损伤中的作用
本文通过建立培养的牛主动脉内皮细胞体外低氧复氧模型,观察低氧和复氧时胞内钙浓度的改变与存活率的关系.结果显示,随低氧时间延长内皮细胞存活率下降,低氧后再复氧存活率进一步降低.低氧时无钙溶液孵育降低细胞的存活率,但复氧时无钙溶液孵育则增加细胞的存活率.低氧2 h胞内钙浓度从99 nmol/L降至69 nmol/L,无钙时胞内钙进一步降低,低氧4 h再复氧40 min,胞内钙浓度恢复至正常.提示细胞内钙浓度平衡的维持是细胞行使正常功能的一重要条件,低氧时胞内钙浓度的降低及复氧时胞内钙浓度的快速恢复可能在细胞损伤中起一定作用.
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不同浓度丹参酮对大鼠脑片缺氧缺糖损伤的保护作用
目的:探讨不同浓度丹参酮对大鼠脑片缺氧缺糖损伤的保护作用及其机制.方法:建立大鼠脑片缺氧缺糖损伤模型,设立对照组、缺氧缺糖损伤组、丹参酮20 mg·L-1组和丹参酮200 mg·L-1组.利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色定量比色、乳酸脱氢酶(LDH)、免疫组化、电镜评价不同浓度丹参酮对脑损伤的保护作用.同时激光共聚焦显微镜测定脑片胞内钙变化.结果:不同浓度丹参酮(20、200 mg·L-1)抑制脑片OGD损伤所致的TTC染色降低,减少LDH释放,减轻神经元凋亡,改善神经元超微结构的病理损伤.OGD损伤增加bax和bcl-2蛋白表达和胞内钙离子浓度.不同浓度丹参酮(20、200 mg·L-1)进一步上调bcl-2蛋白表达,降低bax蛋白表达,同时抑制胞内钙离子浓度.与丹参酮20 mg·L-1相比,丹参酮200 mg·L-1作用较强. 结论:不同浓度丹参酮具有脑保护作用,能够抑制缺氧缺糖损伤导致的大鼠脑片神经元损伤及其凋亡过程,且丹参酮对于胞内钙离子的调控可能是其发挥保护作用的重要机制之一.
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中药对胞内钙调节的研究现状评述
1 引言钙是人体内不可缺少的重要元素之一,是维持机体细胞功能和信号传导中必需的离子.细胞外的Ca2+是细胞摄取Ca2+的贮存池.胞内钙有3种存在形式,即贮存钙、结合钙和游离钙.贮存钙是胞内钙存在的主要方式,指贮存于线粒体、内质网、高尔基体等细胞器中的高浓度钙.细胞器通过对钙的贮存与释放,发挥对细胞质中游离钙的调节平衡作用,对刺激做出反应和防止游离钙浓度的过高或过低对细胞造成损害.结合钙是指在细胞质中和可溶性胞质蛋白及膜的内表面结合的钙,同样对维持钙的胞内稳态有积极作用,细胞核的钙就属于结合钙.细胞中的钙稳态,是细胞功能进行的前提.一旦细胞内的钙稳态被各种刺激打破,Ca2+则充当第二信使触发或者调控多种细胞内事件,使细胞执行一系列特定的功能[1].因此维持细胞内的钙稳态,及保持细胞核内的钙稳态,是保持机体细胞发挥正常稳定的生理功能基础.本文就近年来国内有关中药对细胞中的钙离子调节影响细胞信号转导研究现状做一综述,为从事这方面的工作提供一定的依据.
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植物雌激素α-ZAL和17βE2对大鼠单个心室肌细胞缩舒功能和胞内钙瞬时变化的影响
目的:比较植物雌激素α-ZAL和17βE2对大鼠心肌细胞缩舒和胞内钙瞬变的影响.方法:从成年雌性大鼠心脏分离单个心肌细胞,应用美国Ionoptix视频跟踪计算机图像分析系统在0.5Hz 的电刺激下测定离体单个心肌细胞的收缩参数,其中包括大收缩幅度(PS)、大收缩幅度时间(TPS)、90%舒张幅度时间(TR90)和大收缩速率(+dL/dttmax)及大舒张速率(-dL/dttmax);同时用Fura2/AM钙荧光指示剂测定胞内钙浓度的变化.结果:10-9～10-5mol/L 17βE2能使PS产生浓度依赖性的增加,大增加35%,高浓度的17βE2对TPS有显著影响(P<0.05),能够使ΔFFI大增加25%;而10-9～10-5mol/L α-ZAL无论是心肌细胞缩舒功能还是胞内钙含量均无明显变化.且α-ZAL和17βE2对心室肌细胞静息状态下胞内钙浓度和胞内钙的荧光衰减率均无显著影响.结论:α-ZAL对心室肌细胞的作用与17βE2有很大不同,17βE2对心肌细胞缩舒有直接刺激作用,增强心肌收缩可能是通过胞内钙释放与胞外钙内流所介导;而α-ZAL无这种作用,它可能是通过抑制胞外钙内流和其抗氧化反应达到保护心室肌细胞的作用.
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溶血磷脂酸对心肌细胞胞内钙的影响
目的 探讨溶血磷脂酸(LPA)心肌细胞胞内钙的影响.方法 分离成年Wistar大鼠的心肌细胞,应用Fluo-4/AM荧光染料,采用逐步钙负荷的方法诱导钙促钙释放.观察不同浓度(0.1、1、5、10、20 μmol/L)的LPA对心肌细胞钙促钙释放的影响,并在不同起搏频率(0.25、0.5、1.0 Hz)下观察LPA(10 μmol/L)对心肌细胞胞内钙曲线峰值及其变异性的影响.结果 0.1 μmol/L的LPA并不影响钙促钙释放次数;从1μmol/L开始及更高浓度(5、10、20 μmol/L)可以促进心肌细胞发生钙促钙释放,但这种效应并没有表现出浓度依赖性.同时,LPA(10μmol/L)能显著增加心肌细胞在起搏状态下的胞内钙曲线峰值和0.25、0.5 Hz起搏频率下的变异性.结论 LPA能促进心肌细胞钙促钙释放,并破坏起搏状态下心肌细胞的钙稳态.
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过表达人全长tau蛋白通过增加胞内钙信号激活钙神经素导致海马神经元树突棘的缺失
目的：观察过表达人全长tau蛋白对原代海马神经元胞内钙信号和神经元形态的影响及其机制。方法：通过钙成像观察过表达人全长tau蛋白的神经元胞内钙离子浓度的变化。采用免疫荧光染色观察过表达tau蛋白的神经元树突及树突棘的变化。免疫印迹观察过表达tau蛋白的神经元内钙神经素的蛋白变化。结果：过表达人全长tau蛋白的神经元胞内基础钙水平显著高于对照组（P＜0．05），神经元树突棘数量明显较少，树突生长减慢。同时，钙神经素蛋白含量增加，钙神经素酶活性升高。使用钙神经素阻断剂FK506或CsA作用于神经元，可逆转过表达tau蛋白对神经元树突棘的损伤作用。结论：过表达人全长tau蛋白通过增加胞内钙信号而激活钙神经素，导致海马神经元树突棘的丢失。
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甘草提取物体外选择性诱导几种人肿瘤细胞凋亡
目的：从体外诱导人肿瘤细胞凋亡的角度研究传统中药甘草的抗癌作用。方法：采用 Hoechst33342染色观察染色体凝聚和流式细胞仪检测凋亡峰两种方法检测细胞凋亡。分别以 Fluo-3和 Rh123为荧光探针，用流式细胞仪测定胞内游离钙和线粒体膜电位 (△Ψ m)变化。用免疫组化方法检测原癌基因 c-fos、 c-jun与 c-myc表达量的变化。结果：甘草选择性诱导胃癌 MGC-803、肝癌 HepG2、肺癌 NSCLC与宫颈癌 Hela等几种人肿瘤细胞凋亡。甘草处理的 MGC-803、 HepG2和 NSCLC细胞均观察到胞内游离钙升高和△Ψ m的下降。有趣的是，甘草不能诱导胃癌 BGC-823细胞凋亡，但其胞内钙和△Ψ m与凋亡细胞株具有同样变化规律。原癌基因 c-fos、 c-jun与 c-myc的蛋白产物在甘草处理的 MGC-803细胞中明显上调。结论：甘草抗癌活性与诱导肿瘤细胞凋亡有关，胞内钙升高、△Ψ m下降和 c-fos、 c-jun与 c-myc蛋白表达上调参与甘草诱导肿瘤细胞凋亡的调控。
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神经肽Y经Ca2+/CaM依赖的钙调神经磷酸酶途径诱导心肌细胞肥大
目的 观察神经肽Y(NPY)诱导心肌细胞肥大效应,及Ca2+/CaM依赖的钙调神经磷酸酶(CaN)途径在其中起的作用.方法 用NPY(10、100nmol)刺激心肌细胞,用环胞索A(CsA)特异性抑制CaN活性.测定心肌细胞蛋白合成速率(3H-Leu掺入量)、CaN-蛋白表达、c-jun mRNA表达、CaN酶活性、细胞内游离钙含量.结果 (1)在100nmol NPY作用下,心肌细胞3H-Leu掺入量及c-jun mRNA表达量均较对照组显著增高(P<0.05,P<0.001).NPY+CsA组和对照组相比无显著差别.(2)在100 nmol NPY作用下,NPY组心肌细胞内CaN酶比活力、CaN-α表达、胞浆及核内钙含量较对照组显著增高(P<0.05,P<0.05,P<0.001,P<0.001).结论 NPY可刺激心肌细胞肥大,CaN信号途径在其中起重要作用.
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机械拉伸对人肺上皮细胞粘附及[Ca2+]i的影响
目的探讨周期性拉伸应变对人肺上皮细胞H727的力学性质及其[Ca2+]i的调控作用.方法应用微管吸吮系统测定细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积,用荧光探针Fluo-3/AM测定拉伸应变对人肺上皮细胞H727[Ca2+]i的影响.结果在应变为15%,频率为40次/min的拉伸刺激下,与其静态对照组相比,细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积均增加;拉伸5 min后,[Ca2+]i比对照组有明显增加,用三七总皂苷阻断胞内Ca2+离子通道后,细胞对应变的响应仍表现出[Ca2+]i的升高,但与未加三七总皂苷的实验组相比,[Ca2+]i响应应变后的升高由原来的3.4倍的增加降低为1.5倍的增加.结论在人肺上皮细胞H727响应周期性拉伸应变的过程中,[Ca2+]i的升高既有胞外钙内流的参与,也有胞内钙库的释放作用,其中胞外钙通过跨膜通道的内流起主要作用.
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九节龙皂甙对Hela细胞生长的抑制作用
目的观察九节龙皂甙(Ardiusilloside)对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用.方法九节龙皂甙6.25 mg*L-1处理Hela细胞0～72 h,在不同时间点采用光镜观察Hela细胞形态,以琼脂糖凝胶电泳检测Hela 细胞凋亡DNA的梯形带;应用特异性Ca2+荧光探测剂Fluo-3/AM在LSCM条件下检测不同时期细胞内Ca2+分布情况.结果光镜下体外培养的Hela 细胞在九节龙皂甙作用24 h开始出现细胞质皱缩和细胞核凝缩等凋亡的形态学特征.60、72 h均检测出DNA梯形带等凋亡的生物化学特征.诱导Hela 细胞48、60、72 h内Ca2+严重超载且维持在较高浓度水平.结论九节龙皂甙对体外培养的Hela 细胞具有明显的抑制作用且诱导Hela 细胞凋亡发生;细胞凋亡时细胞内[Ca2+]增加且维持在较高水平.
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陡脉冲电场对细胞凋亡的影响及机理的研究
我们使用自行设计的陡脉冲施加装置,对贴壁生长的人肝癌细胞(SMMC-7721)和人正常肝细胞(HL-7702)施加脉冲电场.研究在陡脉冲电场作用下细胞的凋亡及其相关的机理.结果表明,电压值超过200 V以上的陡脉冲电场可以诱发肿瘤细胞凋亡,250 V的电场比200 V电场作用下肿瘤细胞的凋亡程度更大;而正常细胞对电场刺激的敏感程度低于肿瘤细胞.激光共聚焦显微镜测定陡脉冲电场作用下细胞内游离钙浓度变化结果表明,细胞外无钙条件下,150 V电场作用下胞内钙离子浓度未发生明显变化,200 V电场作用下,胞内钙离子浓度明显下降,250 V电场作用下胞内钙离子浓度陡然下降,下降幅度比200 V电场作用时大.细胞外有钙条件下,150 V电场作用下胞内钙离子浓度未发生明显变化,200 V和250 V电场作用下胞内钙离子浓度略有下降.提示胞内钙离子浓度变化可能是陡脉冲作用下肿瘤细胞凋亡的机制.
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Capsazepine抑制培养海马神经元网络线粒体转运
capsazepine(CZP)是辣椒素的合成类似物,也是野香草型瞬时感受器电位通道1(TRPV1)的选择性抑制剂.TRPV1在体内有广泛的表达谱,使CZP有广泛的作用位点.除此之外,以往的研究结果表明CZP除了作用于TRPVI外还有更复杂的信号通路.本课题研究了CZP对体外培养的大鼠海马神经元网络内线粒体转运的作用并分析其可能机制.结果显示:20 μmol/L的CZP可有效抑制原代培养海马神经元网络中的线粒体转运.CZP急性作用不引起胞内钙离子浓度的升高,也不引起细胞的凋亡.胞外更换为无外钙记录液,或者将GSK3g抑制剂SB415286与CZP共孵育,均不影响CZP对线粒体转运的抑制作用.然而,将BAPTA-AM与CZP共孵育,抑制了CZP对线粒体转运的抑制作用.本研究结果表明,CZP直接通过胞内钙信号通路影响神经元的线粒体转运,与胞外钙流或转运蛋白的磷酸化无关.
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脊髓电压依赖性钙通道在病理性痛中的作用
胞内钙离子浓度的升高在神经系统的很多过程中都发挥重要的作用,例如递质在突触部位的释放,神经元兴奋性的调节以及突触可塑性和基因转录等过程.胞内钙离子浓度的升高主要有三条途径:其一,通过激活电压依赖性钙通道(Voltage-dependent calcium channels,VDCC,亦称Voltage-gated calcium channels,VGCC)使胞外钙离子进入细胞内;其二,通过激活通透钙离子的离子门控型受体如NMDA受体等,使胞外钙离子进入细胞内;其三,是通过激活细胞内内织网上的三磷酸肌醇(IP3)受体或ryanodine受体使胞内钙库中的游离钙离子进入胞浆内.
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降钙素基因相关肽对心肌细胞缺血缺氧状态下胞内钙的影响
目的观察降钙素基因相关肽(CGRP)对急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下胞内钙的影响. 方法急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下,以Fluo-3 作为钙指示剂,用共聚焦显微镜测定胞内钙的变化. 结果急性缺血缺氧时, 心肌细胞胞内钙浓度降低,加入CGRP后,钙浓度恢复;先加入CGRP,再在缺血缺氧的条件下, 胞内钙浓度基本保持不变. 结论 CGRP可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内钙浓度降低.
