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利用GCaMP6f蛋白对小鼠伏隔核神经元活动的钙离子成像
目的 在小鼠伏隔核表达GCaMP6f蛋白,并在束缚状态下,应用钙成像技术实时监测小鼠伏隔核内活化的神经元.方法 首先,包装并纯化aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato病毒,并通过感染原代神经元验证目的蛋白的表达和功能.然后,通过脑立体定位技术注射aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato病毒于小鼠伏隔核脑区,动物恢复21 d后,插入光纤,在其清醒状态下,给予束缚刺激,用钙成像技术实时记录伏隔核神经元的活化.结果 表达GCaMP6f的原代神经元在给予谷氨酸刺激后,神经元被活化,Ca2内流而产生绿色荧光;通过在体实验,给予小鼠束缚刺激,可在视野内检测到因伏隔核神经元活化而发出的绿色荧光信号;鼠脑切片同样可检测到位于胞质的绿色荧光信号与位于细胞核的病毒红色荧光标记共定位于相同细胞.结论 aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato腺相关病毒可成功用于在体活化神经元的实时监测.通过在小鼠伏隔核定点注射该病毒,给予束缚刺激,应用钙成像技术可实时记录到小鼠伏隔核的活化神经元.
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李氏5号方水提液对神经元游离钙浓度的影响
目的观察李氏5号方水提液(LQET)对神经元游离钙浓度的影响.方法取出生1天内的SD大鼠,分离培养海马神经元,用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长,细胞培养到第9～12天进行细胞内钙荧光测定.用荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞45min,借助共聚焦显微镜钙成像技术测定在30mmol/L的KCl作用下,不同干扰因素下培养的海马神经元胞浆游离钙荧光强度.结果正常条件下培养的神经元,细胞内游离钙浓度为75.67±8.65nmol/L,LQET使细胞内游离钙浓度提高到126.35±9.35nmol/L,但仍在正常上限范围内;L-型钙通道阻断剂硝苯地平预处理24h,30mmol/L KCl激活的细胞游离钙浓度降低到40.65±5.65nmol/L,与正常对照组比较差异显著.LQET与硝苯地平共同预处理后细胞游离钙浓度降低到90.75±10.15nmol/L,与单纯LQET预处理组和单纯硝苯地平组比较差异显著.10μmol/L NMDA能明显增加细胞内钙荧光强度,且能在某一强度稳定,NMDA受体阻断剂MK-801可显著阻断这一效应.LQET预处理后,NMDA导致的胞浆钙荧光强度的增强效应明显降低,MK-801预处理后,LQET降低NMDA增强细胞内荧光的效应显著降低.结论 LQET能通过L-型钙通道和NMDA受体对神经元细胞内钙浓度进行双向调定.
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醋酸铅对人和小鼠瞬时受体电位A1离子通道的抑制作用
目的：研究醋酸铅对瞬时受体电位A1（TRPA1）通道的影响。方法应用细胞内钙荧光成像系统检测原代培养的小鼠背根神经节（DRG）神经元上TRPA1（mTRPA1）通道和外源性表达在HEK293细胞上的人源TRPA1（hTRPA1）和mTRPA1通道介导的细胞外钙内流；应用双电极电压钳技术记录外源性表达在爪蟾卵母细胞上的hTRPA1通道介导的电流。结果醋酸铅3.0和10.0μmol·L-1对TRPA1介导的小鼠DRG神经元外钙内流的抑制率分别为（36.7±4.1）%和（79.4±3.1）%；醋酸铅浓度依赖性地抑制爪蟾卵母细胞上hTRPA1通道介导的电流，醋酸铅0.3，1.0，3.0，10.0和30.0μmol·L-1对+80 mV处电流的抑制率分别为（1.0±0.7）%，（11.6±0.8）%，（57.7±3.2）%，（93.6±2.6）%和（93.2±2.7）%，其IC50为2.4μmol·L-1。结论 TRPA1通道是铅的内源性作用靶点，低浓度醋酸铅可抑制TRPA1通道。
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TRPV1介导甲醛激活初级传入伤害性感受器细胞的作用
福尔马林致痛模型是化学伤害性刺激引起急性和持续性痛常用的动物模型.本研究旨在细胞和整体水平上证明TRPV1受体是否参与甲醛溶液(甲醛是福尔马林溶液的主要成分)对初级伤害性感受器细胞的激活过程.运用电流钳记录的92个背根神经节细胞中,大约有34%的中、小细胞对甲醛溶液敏感,产生动作电位的发放,其产生动作电位的潜伏期是(367.34±32.96)s,并且单个动作电位复极化相具有伤害性感受器细胞的特征性,如动作电位间期较长、复极化相有"驼峰"以及较长的后超极化相.在同时给予FRPV1受体抑制剂Capsazepine(CPZ)时,甲醛溶液诱发背根神经节细胞产生的放电可以被阻断,但对细胞膜去极化不能完全阻断.在激光共聚焦钙成像中记录的160个背根神经节细胞中,有32%的细胞对甲醛溶液敏感,可以产生胞内钙离子浓度的升高,同时加入CPZ后,67%的这些甲醛敏感性细胞的胞内钙浓度升高可以被抑制.在电压钳状态下,甲醛溶液可以诱发背根神经节细胞产生内向电流,大约有41%的细胞对甲醛溶液敏感,实验证明甲醛溶液诱发产生内向电流的幅度呈剂量依赖.当同时给予CPZ时比TRPA1受体选择性抑制剂HC-030031抑制内向电流的幅度明显.利用行为学技术方法证明足底注射CPZ可以明显抑制福尔屿林溶液所致的第一相全程和第二相内仅第25～25 min的自发缩足反射.以上结果提示,甲醛溶液选择性地激活一个亚群的初级传入伤害性感受器细胞,甲醛激活的动作电位的发放主要参与福尔马林诱发的第一相伤害性感受的产生.本实验进一步证明甲醛激活初级伤害性感受器细胞可能是通过TRPV1受体和/或TRPA1受体参与介导的.
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基因编辑技术和光遗传学技术联合钙成像在疼痛研究中的应用进展
背景 疼痛的机制以及环路十分复杂,涉及外周、脊髓和脊髓上多个水平,并且相互交叉、抑制或促进,要解决疼痛的问题,就要清晰认识疼痛环路和机制.目的 随着基因编辑技术和光遗传技术的发展,联合在体的光纤和显微成像记录技术,推进这些方法的联合使用,为探究复杂的外周、脊髓和脊髓以上水平疼痛环路提供新的机会.内容 综述迄今在疼痛研究领域的钙成像技术,以及基因编辑技术、光遗传学技术,联合在体的光纤和显微成像记录技术的研究进展,并介绍脊髓水平在体的光纤和显微镜固定问题的解决,并阐明其在疼痛研究中的潜在应用价值.趋向 上述方法的联合使用为探究复杂的外周、脊髓和脊髓以上水平疼痛环路和机制,提供了一个前所未有的机会.随着技术的不断进步,相信人们终将解决有关疼痛的未知问题.
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黄芩素对大鼠胰岛素分泌的作用及机制研究
目的 研究黄芩素(baicalein)促进大鼠胰岛素分泌及其离子通道作用机制,探究其治疗糖尿病的作用及机制.方法 运用胶原酶P消化Wistar♂大鼠的胰腺组织,继而使用Histopaque1077梯度离心,消化离心后可以得到纯度较高的大鼠胰岛,DispaseⅡ消化胰岛获取单个细胞.应用胰岛素分泌实验监测不同黄芩素浓度(20、50、100μmol·L-1)干预下胰岛素分泌情况.应用钙成像技术记录黄芩素干预时,单个β细胞内Ca2+浓度变化.应用膜片钳技术记录不同药物浓度干预下,单个β细胞的电压依赖性钾电流(Kv).结果 胰岛素分泌实验显示,16.7 mmol·L-1葡萄糖条件下,黄芩素浓度依赖性促进胰岛素分泌.钙成像技术证实,一定浓度的黄芩素升高了β细胞内Ca2+浓度.膜片钳技术表明,黄芩素浓度依赖性抑制了单个β细胞的Kv电流.结论 黄芩素可以通过抑制单个 β细胞的Kv电流,升高 β 细胞内Ca2+浓度,终促进胰岛素分泌.
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多巴胺对大鼠胰岛素分泌的影响及机制研究
目的 研究多巴胺(dopamine,DA)对大鼠胰岛素分泌的影响及可能机制.方法 ♂ SD大鼠的胰腺经过胶原酶P消化、Histopaque 1077梯度离心后得到纯化的胰岛,Dispase Ⅱ将胰岛消化为单个细胞.应用胰岛素分泌实验来验证DA对胰岛素分泌的作用,通过膜片钳技术和钙成像技术记录β细胞内向性钙电流、动作电位时程和细胞内Ca2+浓度,研究DA对大鼠胰岛素分泌的作用机制.结果 在2.8 mmol·L-1的葡萄糖中,DA对胰岛素的分泌没有产生明显的影响;在16.7 mmol·L-1的葡萄糖中,DA呈浓度依赖性抑制胰岛素的分泌.DA干预后,抑制了胰岛β细胞上内向性钙电流,缩短动作电位时程,减少了细胞内Ca2+浓度.结论 DA通过抑制β细胞上内向性钙电流,进而缩短了动作电位的时程,降低细胞内Ca2+浓度,终抑制胰岛素的分泌.
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功能性多神经元钙成像技术及其在神经药理学中的应用前景
功能性多神经元钙成像(functional multineuron calcium imaging,fMCI)是一种通过记录神经元内Ca~(2+)信号变化,从空间时间模式上监测大量神经元动作电位的光学记录技术.该文综述了fMCI技术及其在神经药理学研究中的应用前景,fMCI为解析脑的各种功能活动和基于神经网络的某些中枢神经系统药物机理研究提供了强有力的工具.
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双光子显微镜用于在体监测小鼠视交叉上核Ca2+动态变化的方法学研究
目的 通过颅底暴露手术联合双光子荧光成像技术实现在体记录视交叉上核(SCN)神经元钙离子活动信号并研究其活动规律的新型方法.方法 对麻醉小鼠实行颅底暴露手术,通过双光子荧光显微镜对已注射钙指示剂的活体小鼠SCN核团钙信号进行实时动态测定.结果 成功建立一套小鼠颅底暴露SCN核团手术方法,术后应用双光子显微镜清晰地检测到SCN核团钙离子荧光信号,也能够实现稳定的在体细胞钙离子成像,并发现不同自发反应细胞中钙离子活动规律差异.结论 通过颅底暴露手术,利用双光子显微镜成功实现了实时监测SCN区域神经元钙离子信号.
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APETX2对氯化锂-匹鲁卡品诱导痫性发作大鼠的影响及机制探究
目的 探索APETX2对氯化锂-匹鲁卡品诱导痫性发作大鼠的行为学影响及可能的机制.方法 成年雄性SPF级SD大鼠18只,侧脑室置管后随机分为:癫痫组(9只)、APETx2组(9只),癫痫造模后观察2组癫痫大发作潜伏期及发作强度;APETx2处理原代培养海马神经元,动态观察其对钙成像的影响.结果 APETx2组的SD大鼠癫痫潜伏期延长,大发作程度减轻;APETx2处理原代培养海马神经元钙内流下降.结论 APETx2可抑制氯化锂-匹鲁卡品诱导SD大鼠痫性发作,减少酸诱导海马神经元钙离子浓度增加可能为机制之一.
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豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞改良分离法
目的 探索一种能提供更多数量并更长时间保留豚鼠单离Ⅰ型前庭毛细胞细胞活性的分离方法.方法 将耳廓反射正常的杂色豚鼠48只随机分为胶原酶Ⅳ+常用分离法组(A组)、胰蛋白酶+常用分离法组(B组)、胶原酶Ⅳ+改良分离法组(C组)和胰蛋白酶+改良分离法组(D组),每组12只,分别用0.25%胶原酶Ⅳ和0.05%胰蛋白酶结合文献报道常用液体和改良液体外加机械分离法分离豚鼠前庭Ⅰ型毛细胞,通过光镜、膜片钳、胞内钙成像等方法观察、鉴定和评价Ⅰ的活性.结果 A组平均每耳分离出存活单离Ⅰ型前庭毛细胞25个,3 h后存活细胞约14个,6 h后存活细胞约8个,3 h静息膜电位平均为-55±10 mV,胞内钙离子浓度平均为105±15 nmol/L;B组平均每耳分离开存活单离Ⅰ型前庭毛细胞40个,3 h后存活细胞约19个,6 h后存活细胞约6个,3 h静息膜电位平均为-60±10 mV,胞内钙离子浓度平均为95±10 nmol/L;C组平均每耳分离出存活单离Ⅰ型前庭毛细胞24个,3 h后存活细胞约为17个,6 h后存活细胞约11个,3 h静息膜电位平均为-55±10 mV,胞内钙离子浓度平均为95±15 nmol/L;D组平均每耳分离出Ⅰ型前庭毛细胞42个,3 h后存活细胞约30个,6 h后存活细胞约23个, 3 h静息膜电位平均为-60±10 mV,胞内钙离子浓度平均为90±10 nmol/L,且胞内钙离子浓度更稳定.结论 与传统的胶原酶Ⅳ酶解加机械分离法相比,以胰蛋白酶酶解结合改良式液体外加机械分离技术分离方法简便易行,能提供足够量的存活时间较长的豚鼠单离Ⅰ型前庭毛细胞,适用于对细胞活性要求较高的实验如膜片钳电生理研究等.
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松节提取物银松素甲基醚的研究
目的:通过对松节提取物的研究,探讨其镇痛抗炎药理作用的途径.方法:使用Olympus显微镜及CCD数码相机配备冷却系统进行钙成像测定.采用双元图像采集(340和380nm的激发,510nm发射)和伪彩色图像进行了监测.在实验过程中每5秒监测一次.运用显微外科技术获取SD大鼠DRG体,胶原酶消化急性分离DRG体获得DRG细胞.载玻片上孵育16-20小时,使用双波长染料Fura-2Am,浸泡30分后,进行钙成像测定.结果:发现其有效成分之一,银松素甲基醚(C15H14O2)使部分 DRG细胞内钙离子浓度显著升高,并且测得了适浓度.结论:传统中药松节的镇痛抗炎作用可能通过有效提取物之一银松素甲基醚实现.
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过表达人全长tau蛋白通过增加胞内钙信号激活钙神经素导致海马神经元树突棘的缺失
目的：观察过表达人全长tau蛋白对原代海马神经元胞内钙信号和神经元形态的影响及其机制。方法：通过钙成像观察过表达人全长tau蛋白的神经元胞内钙离子浓度的变化。采用免疫荧光染色观察过表达tau蛋白的神经元树突及树突棘的变化。免疫印迹观察过表达tau蛋白的神经元内钙神经素的蛋白变化。结果：过表达人全长tau蛋白的神经元胞内基础钙水平显著高于对照组（P＜0．05），神经元树突棘数量明显较少，树突生长减慢。同时，钙神经素蛋白含量增加，钙神经素酶活性升高。使用钙神经素阻断剂FK506或CsA作用于神经元，可逆转过表达tau蛋白对神经元树突棘的损伤作用。结论：过表达人全长tau蛋白通过增加胞内钙信号而激活钙神经素，导致海马神经元树突棘的丢失。
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外周伤害性感受神经元在体特异性表达GCaMP6f蛋白方法的构建及细胞内钙活动的监测
目的:建立在外周伤害性感受器特异性表达GCaMP6f蛋白的方法,并在疼痛刺激条件下,应用钙成像技术实时监测小鼠伤害性感受神经元的细胞内钙活动.方法:包装并纯化rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒,并通过立体定位注射该病毒于SNS-Cre小鼠L4/L5背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)内.动物存活3～4周,然后制备L4/L5整节DRG标本,检测GCaMP6f蛋白表达情况,并观察疼痛刺激条件下诱致的伤害性DRG神经元的钙反应情况.结果:SNS-Cre小鼠L4/L5 DRG内注射rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒后,荧光显微镜观察显示GCamp6f病毒特异性地表达在中、小型的DRG神经元.给予DRG神经元高钾刺激(KCl 30 mmol/L)可以诱致神经元胞内的钙离子水平显著上升.进一步给予伤害性DRG神经元特异性标志物TRPV1受体的激动剂Capsaicin(1 μmol/L),结果显示其可以诱致GCamp6f蛋白标记的DRG神经元呈现显著的钙反应.结论:本研究建立的SNS-Cre小鼠DRG在体注射rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒特异性标记伤害性DRG神经元的方法是成功的,该方法的成功建立对于活体特异性监测伤害性DRG神经元的功能活动提供了重要工具.
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肿瘤坏死因子-α对大鼠颈动脉体球细胞胞内钙的影响
目的:研究肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(tumor necrosis factor receptor type Ⅰ,TNFR-Ⅰ)在大鼠颈动脉体(carotid body,CB)中的表达,以及TNF-α对CB球细胞胞内钙离子浓度([Ca2+],)的影响.方法:Western Blot和免疫荧光双重染色检测TNFR-Ⅰ在大鼠CB中的表达,用钙成像技术检测TNF-α对大鼠CB球细胞[Ca2+]i的影响.结果:Western Blot结果显示,TNFR-Ⅰ阳性条带出现在55kD处,与其分子量一致.免疫荧光双重染色结果显示,TNFR-Ⅰ强烈表达在大鼠CB球细胞中.钙成像结果显示,外源性给予TNF-α可引起球细胞[Ca2+]；迅速升高.结论:大鼠CB球细胞表达TNFR-Ⅰ,可以感受促炎性细胞因子TNF-α的刺激.
关键词： 颈动脉体 肿瘤坏死因子-α 肿瘤坏死因子Ⅰ型受体 钙成像 -
功能性SDF-1受体在非洲爪蟾胚胎发育中的表达研究
本文目的在于探索骨髓基质细胞源因子-1(SDF-1)的功能性受体在非洲爪蟾胚胎发育过程中的表达状况,进而探讨SDF 1在胚胎发育中的作用.采用胚胎细胞分散培养及钙成像技术对不同发育时期及胚胎不同部位的分散培养细胞进行了检测,结果证明:在主要由神经板、神经嵴细胞和基板迁移而来的胚胎头部组织中,其功能性受体表达量远高于背部及尾部组织(P＜0.001),并从胚胎14～2l期呈上升趋势,在2l～35期保持高表达率.结果提示,此功能性受体在胚胎期的表达密度与成体相应区域的器官结构复杂程度呈正相关,说明SDF-1及其受体在爪蟾的生长发育中起作用.
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细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用
钙位于元素周期表中第2列,属于碱土金属.钙离子是一种重要的二价阳离子,它和许多其它阳离子的物理学性质非常相似,但具有独特的生物学功能.表现在,钙离子不仅是电流的载体,作为二价阳离子维持胞内外电化学梯度,而且还是一种重要的细胞内第二信使,参与肌细胞收缩、腺细胞分泌、神经递质释放、受精、细胞分化和程序死亡等过程.事实上,真核生物几乎所有的细胞分子事件都有钙离子的参与.
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苯丙氨酸及其衍生物对未成熟神经元胞质游离钙的影响
目的:探讨苯丙酮尿症患者脑损伤的病理生理机制,分析苯丙氨酸和胞质游离钙有无关系.方法:用钙成像技术检测氨基酸及其衍生物对胚鼠皮层未成熟神经元胞质游离钙浓度的影响.结果:高浓度苯丙氨酸降低胞质游离钙,苯乙酸使胞质内钙浓度降低后升高后又降低,苯乳酸使胞质内钙降低更明显.使用无钙离子无钠离子的细胞外液,苯乳酸降低胞质内钙的作用无明显影响;使用Thapsigargin阻断内质网上钙泵,苯乙酸虽仍能降低胞质内钙,但没有降低后又升高的现象.当苯丙氨酸、苯乙酸和苯乳酸相同浓度时,苯乙酸、苯乳酸较苯丙氨酸的作用更强.结论:结合我们以前的观察结果,苯丙氨酸可能激活plasma membrane Ca2+-ATPase,促进神经元胞质内钙外排,进而导致神经元胞质内钙浓度降低.
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Ghrelin对原代培养大鼠海马神经元内Ca2+浓度影响
目的 探讨胃促生长素(ghrelin)对SD大鼠海马神经元细胞内Ca2+浓度影响及可能的机制.方法 原代培养的SD大鼠海马神经元细胞,随机分为空白对照组(A组)、4 nmol/L ghrelin组(B组)以及YIL718+4 nmol/L ghrelin组(C组).A组细胞不做任何特殊处理;B组细胞在大鼠海马培养14 d后,用含有4 nmol/L gh-relin的培养液继续孵育24 h;C组细胞在4 nmol/L ghrelin处理大鼠海马神经元0.5h前,加入10 μmol/L的YIL718进行处理.然后采用confocal结合Fluo-4 AM荧光钙成像技术实时记录海马神经元细胞内Ca2+浓度及谷氨酸诱导的胞内钙Ca2+浓度.同时结合实时定量反转录聚合酶链反应技术对ghrelin可能引起的基因表达的变化进行分析.结果 与A组相比,4 nmol/L ghrelin处理24 h可升高胞内Ca2+的水平(F=5.671,q=4.489,P＜0.01),但可抑制谷氨酸诱导的细胞内Ca2+水平的升高(F=19.770,q=8.038,P＜0.001);YIL718预处理可消除ghrelin的影响(q=3.180,P＜0.05).Ghrelin可抑制海马神经元kcnj2 mRNA的表达(t=4.101,P＜0.05).结论 ghrelin可能通过激活GHS-R1a调节海马神经元细胞内游离Ca2+的浓度,提示ghrelin/GHS-R1a通路对海马神经元的活动有调控作用.Ghrelin抑制谷氨酸诱导的神经元细胞内Ca2+浓度升高,可能是其抑制海马依赖性记忆形成的细胞基础.
