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实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白的表达
目的 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2 mRNA水平.方法 建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第1、2、3、4周取断端组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2 mRNA水平.结果 在对照组,创伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在1周开始增高,在第2周达到高峰后下降,第4周即可恢复正常.而实验组,受枪伤的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在第3周表达高,与对照组相比,升高较慢,表达量也偏低(P＜0.05).结论 BMP-2 mRNA SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平的影响.枪击伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平与对照组相比升高较慢,表达量也偏低.
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醛固酮对豚鼠耳蜗离子通道蛋白的早期作用
目的 检测醛固酮作用早期豚鼠耳蜗离子通道蛋白基因的表达改变情况.方法 使用RT-PCR方法检测醛固酮腹腔注射后6小时豚鼠耳蜗中Na-K ATP酶β1、β3亚单位及钠离子通道蛋白α亚单位(ENaC α subunit)基因表达的改变情况.结果 在豚鼠耳蜗中Na-K ATP酶β1、β3亚单位的表达情况无明显改变,钠离子通道蛋白α亚单位则出现明显上调.结论 醛固酮在豚鼠耳蜗中可能通过基因组作用方式发挥作用.
关键词： 醛固酮 耳蜗 离子通道蛋白 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) -
血管紧张素转化酶相关性羧肽酶在人及啮齿动物胰腺的表达
目的 近几年发现的血管紧张素转化酶相关性羧肽酶(ACE2),是血管紧张素转化酶(ACE)的相关酶,新近被证实是SARS相关冠状病毒的一个功能性受体.我们的先前实验发现SARS患者的血糖水平比对照组显著升高,提示SARS冠状病毒可能侵袭胰腺并导致胰腺损伤.本文研究ACE2在人、大鼠和小鼠内外分泌腺的表达,为探讨糖尿病及SARS病毒感染后血糖升高的机制提供依据.方法 通过免疫组化的方法检测ACE2在人、大鼠和小鼠胰腺的表达.分别提取人和大鼠胰腺组织的RNA,通过RT-PCR的方法检测ACE2在人、大鼠的表达.结果 免疫组化:ACE2在人、大鼠、小鼠的胰腺内外分泌腺均有表达,ACE2在内分泌腺的表达均强于外分泌腺.RT-PCR:在人和大鼠的胰腺RNA经逆转录后均扩增出ACE2基因片段,提示ACE2在人和大鼠胰腺中均有表达.结论 ACE2在胰腺内分泌腺表达,提示SARS病毒能通过胰岛细胞膜上的ACE2受体侵入胰岛细胞,引起胰岛细胞损伤.
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补充验证试验在抗-HCV检测中的应用
目的探讨补充验证试验在一般人群抗-HCV检测中的应用.方法应用重组免疫印迹实验(RIBA)对血清抗-HCV酶联检测结果阳性者进行抗-HCV确认,并应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV RNA.结果2002～2003年福州市部分人群血清抗-HCV酶联检测的阳性率为0.593%,低于贵州出入境人群和部分地区无偿献血员的抗-HCV检出率,而与长沙和南京地区无偿献血员的检出率相近.抗-HCV酶联检测阳性者经RIBA确认后,仅1例阳性,6例为阴性,另有5例结果为不确定.5例不确定者的血清经RT-PCR检测HCV RNA,结果均为阴性.结论RIBA和RT-PCR作为抗-HCV酶联检测的补充试验有助于抗-HCV检测结果的确认和解释,可在抗-HCV检测中推广应用.
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重组乳酸杆菌中A组轮状病毒VP7基因表达
目的 扩增A组轮状病毒VP7基因,构建pEDM27/5-VP7重组质粒,转化乳酸杆菌并分析VP7蛋白的表达及活性.方法 通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得目的 基因VP7,纯化后与pEDM27/5载体进行连接,转化乳酸杆菌,乳糖进行诱导表达,分别于4,8,12 h后,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹技术(Western blot)对产物进行分析测定.结果 A组轮状病毒经RT-PCR扩增后,1%琼脂糖电泳检测可见一条约1.0 kb的特异性条带,与预期目的 基因(VP7基因)大小相符;SDS-PAGE和Western-blot杂交分析发现,经乳糖诱导4,8,12 h后分别可见一条分子量约为28 kD蛋白带表达,经扫描分析,诱导后表达蛋白分别约占菌体总蛋白的2.30%,5.12%,5.38%,且随着时间变化而持续表达增加,并能与抗A组轮状病毒VP7蛋白特异结合.结论 重组乳酸杆菌持续表达免疫活性A组轮状病毒VP7蛋白,为进一步研究乳酸杆菌作为轮状病毒基因工程疫苗的表达载体提供了基础依据.
关键词： A组轮状病毒 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 乳酸杆菌 基因转化 -
天津市婴幼儿病毒性腹泻诺如病毒检测
目的 研究天津市秋冬季婴幼儿腹泻患儿中诺如病毒感染的流行情况及其基因型别.方法 2008年10-12月收集天津市儿童医院住院部310例疑似病毒性腹泻的婴幼儿粪便标本,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测粪便中诺如病毒核酸,并将部分阳性株的PCR产物进行测序,采用序列分析软件分析测序结果,推断其毒株型别.结果 310份腹泻标本中,诺如病毒RT-PCR阳性37份(GII型37份,GI型0例),检出率为11.94%;23份PCR产物送往测序,经Genebank Blast及系统进化树分析,所有诺如病毒均为诺如病毒基因组Ⅱ型,其中GII-4/2006b占95.65%(22/23),GII-3占4.35%(1/23);感染诺如病毒的患儿多为1岁以下,且11月份检出率高.结论 诺如病毒是天津市秋冬季婴幼儿病毒性腹泻的重要病原体,2008年诺如病毒以GII-4/2006b型毒株流行为主.
关键词： 诺如病毒 腹泻 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 基因型 -
KDR mRNA在卵巢上皮性浆液性肿瘤中的表达及临床意义
目的:检测上皮性卵巢浆液性肿瘤中KDR mRNA的表达及其临床意义.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增KDR基因,以β-actin基因作为内对照,结合凝胶图像扫描,以KDR/β-actin作为KDR相对表达量进行分析.分析卵巢上皮性浆液性肿瘤70例.结果:卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤中KDR mRNA的表达高于卵巢良性浆液性瘤及正常卵巢.在卵巢浆液性癌中,KDR mRNA的表达与FIGO分期、腹腔细胞学检查结果、有无淋巴结转移、有无盆腔粘连有关.结论:KDR在卵巢癌的发生、发展及转移中起重要的作用.
关键词： 卵巢肿瘤 KDR 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) -
胃癌患者外周血中CK20 mRNA的检测及其临床意义
目的:检测胃癌患者外周血中CK20 mRNA的表达情况,并探讨其存在的临床意义.方法:应用逆转录聚合酶链反应,检测66例胃癌、良性胃病患者38例及对照组40例外周血中的表达.结果:对照组40例及良性胃病组38例外周血中CK20 mRNA均为阴性表达.胃癌组外周血中阳性表达率为34.8%,胃癌患者外周血中的阳性表达率与肿瘤组织学类型、TNM分期具有相关性(P＜0.05),与肿瘤的部位、病人性别无明显相关性(P＞0.05).手术后复查阳性表达率上升为60%,系手术操作所致.结论:胃癌患者外周血中的阳性表达可作为肿瘤细胞血行播散的标志,有助于胃癌预后的判断.手术操作可促使肿瘤细胞释放入血,胃癌手术中应采用"不接触肿瘤的游离技术"以减少癌细胞的播散.
关键词： 胃癌 细胞角蛋白20 mRNA 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) -
蛋白酶激活受体在鼠肥大细胞的表达
目的 检测蛋白酶激活受体(PARs)在鼠肥大细胞的表达.方法 用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription poly-merase chain reaction,RT-PCR)、流式细胞术及免疫荧光细胞染色分析方法,在mRNA水平和蛋白质水平检测PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4在鼠肥大细胞P815和MC/9的表达.结果 肥大细胞P815和MC/9在mRNA水平和蛋白质水平均表达PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4.结论 肥大细胞表达PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4,为进一步研究肥大细胞PARs的功能奠定了基础.
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老年大鼠海马组织中神经生长因子及其受体基因表达的变化
目的：观察老年大鼠海马组织中NGF及其受体基因表达的变化。方法：采用RT-PCR法，半定量分析2年龄大鼠海马组织中NGF及其受体p75 mRNA含量的变化。结果：与正常成年（3月龄）大鼠相比，2年龄大鼠海马组织NGF mRN A含量显著下降，而NGF受体p75 mRNA的表达无明显改变。结论：老年鼠海马NG F基因表达明显下降，而其受体p75的表达变化不明显。提示衰老可能与NGF基因表达量减少有关。
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原发性胆囊癌Flt-4的表达与肿瘤恶性特征的相关性分析
目的 探讨原发性胆囊癌组织中Flt-4 在mRNA 和蛋白水平的表达及其与肿瘤恶性特征的关系.方法 选取2000 年8 月至2010 年8 月我院手术切除病理明确的19 例原发性胆囊癌和13 例胆囊腺瘤样息肉新鲜组织标本,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化染色在mRNA 和蛋白水平检测Flt-4 在原发性胆囊癌和胆囊腺瘤样息肉的表达情况,并分析Flt-4 免疫组化阳性表达的病例与胆囊癌肝浸润、淋巴转移、病理分级和Nevin 分期等恶性特征的相关性.结果 在胆囊癌和胆囊腺瘤样息肉组织中Flt-4 mRNA 阳性表达率为73.68%(14/19)和7.69%(1/13);两组相比差异显著(P<0.05).免疫组化染色Flt-4 蛋白阳性表达率为68.42%(13/19)和7.69%(1/13);两组相比差异有统计意义(P<0.05).Flt-4 的阳性表达率在胆囊癌肝浸润、淋巴转移和Nevin IV、V 期组明显高于无肝浸润、无淋巴转移和Nevin I、II、III 期组(P<0.05),而在高、中和低分化组三者的阳性表达率无显著差异(P>0.05).结论 原发性胆囊癌组织中Flt-4 在mRNA 和蛋白水平均存在高表达,Flt-4 的阳性表达同胆囊癌肝浸润、淋巴转移和Nevin 分期明显相关,但与病理分级无明显相关.
关键词： 原发性胆囊癌 flt-4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 免疫组化 -
实时荧光定量RT-PCR技术在肿瘤研究中的应用
实时荧光定量RT-PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,广泛应用于医学等领域.全文就其原理、优越性及其在肿瘤研究中的应用及发展前景作一简要叙述.
关键词： 实时荧光定量 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 肿瘤 -
密骨方对去势后骨质疏松性骨折模型大鼠骨痂BMP-3mRNA表达的研究
目的 应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测密骨方在去势后骨质疏松性骨折模型大鼠骨折愈合过程中的骨形态发生蛋白(BMP)-3mRNA水平.方法 建立Wistar大鼠去势后骨质疏松性骨折的动物模型和BMP-3mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第2、4、6周取断端组织,通过荧光定量RT-PCR检测标本中BMP-3mRNA水平.结果 大鼠骨组织BMP-3mRNA表达水平:在时间上的总体比较呈递减的趋势并有显著性差异(F=153.19,P<0.05);组别的总体比较是模型组<实验组<对照组,并有显著性差异(F=262.23,P<0.05);在时间与组别的交互比较也存在显著性差异(F=81.50,P<0.05);任两组间都有统计学差异(P<0.05).结论 中药密骨方对去势后骨质疏松性骨折大鼠模型的骨折愈合有促进作用.
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P73基因在鼻咽癌组织中表达的意义
目的:研究鼻咽癌组织中P73基因的表达及其临床意义.方法:运用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)及单链构象多态性分析技术(SSCP)检测P73mRNA的表达及P73基因的突变情况.运用免疫组化SABC技术检测P73蛋白的表达情况.结果:47例鼻咽癌组织中29例P73mRNA表达阳性,15例鼻咽粘膜慢性炎症组织中3例P73mRNA表达阳性.鼻咽癌组织中P73mRNA的表达与鼻咽粘膜慢性炎症组织相比,其差异具有显著性(P<0.05).鼻咽癌组织中P73mRNA的表达与TNM分期存在密切关系,Ⅲ～Ⅳ期患者P73mRNA的阳性表达率较Ⅰ～Ⅱ期高(P<0.05).P73基因在所检测的标本中未发现有突变.免疫组化技术检测证实鼻咽癌中存在P73蛋白的过表达(P<0.05).结论:鼻咽癌组织中存在P73基因的过表达现象,P73基因的异常表达与鼻咽癌的发生发展存在一定的关系.
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IHC、FISH和RT-PCR检测对EML4-ALK重排的一致性
棘皮动物微管结合蛋白-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-like4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)在肺癌中已成为第二个重的驱动致癌基因,在4%~6%的肺腺癌中EML4-ALK已经成为第一个可以靶向治疗的融合基因位点.伴随着ALK分离探针荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)试剂盒的上市,克唑替尼已经被批准治疗ALK阳性的进展期非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC).然而,一种靶向药物的成功主取决于一种敏感且特异的筛选实验方法来检测分子药物作用的靶点.以作者的经验看,用RT-PCR来检测EML4-ALK,比用FISH和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)方法更敏感,结果更可靠.尽管通过FISH检测ALK已经经过大量的临床实验验证,然而该方法在技术层面仍存在许多具有挑战性的问题,而通过IHC和RT-PCR方法检测ALK仍需临床进一步的探索.
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原发性肝癌多药耐药基因的表达与化疗敏感预测的相关性研究
目的 探讨原发性肝癌多药耐药基因的表达与化疗敏感预测的相关性.方法 取64例肝癌切除组织行ATP-TCA法肿瘤体外药敏试验,以RT-PCR法半定量检测肝癌多药耐药基因表达情况,分析多药耐药基因的表达与化疗敏感预测的相关性.结果 1.原发性肝癌5种耐药基因的表达率分别为:MDR1 90.63%、MRP96.88%、GST-π 96.88%、LRP 90.63%、TOPO Ⅱ 96.88%,各耐药基因的表达率间无显著相关.2.多药耐药基因MDR1、MRP、GST-п、LRP、TOPO Ⅱ的表达量在肝癌组织分别为1.17±0.47、1.59±0.33、1.18±0.48、1.03±0.48、1.00±0.31,在癌旁组织分别为1.11±0.38,1.32±0.44,1.04±0.42,0.96±0.32,1.19±0.28,除TOPOⅡ外,癌旁组耐药基因mRNA表达量低于肝癌组的表达量,两者间的差别无显著性(P>0.05).3.多药耐药基因的表达与疗效的关系显示:在有效组中MDR1、MRP、GST-п LRP mRNA的表达量低于无效组,且在MDR1、MRP、LRP存在显著差别(P<0.05).TOPOⅡmRNA的表达量有效组高于无效组,但差异无显著性(P>0.05).4.ATP-TCA法肿瘤体外药敏试验临床敏感预测准确率为77.27%(17/22),对抗药性的预测准确率为100%(2/2);临床符合率为79.17%.5.MDR1的表达量与MIT、VP-16、EPI、TAX的IC50值正相关;MRP的表达量与MIT、VP-16、EPI的IC50值正相关;GST-π的表达量与5-FU、CDDP、OXA、GEM的IC50值正相关;LRP的表达量与5-FU、CDDP、OXA、EPI、GEM的IC50值正相关;TOPO Ⅱ的表达量与CPT的IC50值正相关.6.多药耐药基因预测化疗的准确率为72.70%.结论 在肝癌存在实现化疗敏感预测基因化的可行性,可通过监测多药耐药基因的表达来预测化疗的效果,选择相关的化疗药物.
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微小RNA-101通过USP22抑制人肝癌MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能
目的 研究微小核糖核酸(miR)-101对人肝细胞癌(肝癌)MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能的影响及其相关机制.方法 MHCC97H肝癌细胞株分别转染miR-101 mimics和negative control mimic,分别作为M101组、NCM组,并设立未转染对照(control)组,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞miR-101含量.Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力.Western-blot法检测3组细胞vimentin、α-catenin、E-cadherin和USP22表达水平.双荧光素酶实验检测miR-101与USP22的关系.结果 M101组miR-101的表达水平明显上调,表达水平约为control组的761倍(P<0.05).M101组迁移细胞数量明显低于control组的[(15.7±1.6)个比(94.1±1.8)个,P<0.05].M101组侵袭细胞数量明显低于control组的[(9.1±0.4)个比(51.6±0.9)个,P<0.05].M101组细胞vimentin蛋白表达量明显降低,α-catenin及E-cadherin蛋白表达量明显升高,USP22蛋白表达量明显降低.双荧光素酶检验结果显示USP22为miR-101的下游靶基因.结论 miR-101可能通过降低下游靶基因USP22水平影响EMT相关蛋白表达,抑制MHCC97H肝癌细胞的上皮-间质转化功能.
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CK19 mRNA在甲状腺肿瘤中的表达及意义
目的 探讨CK19 mRNA在甲状腺癌和甲状腺良性肿瘤中的表达情况及意义.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测42例甲状腺手术新鲜标本的CK19 mRNA的表达.用光密度扫描仪测定并计算样品的CK19/β-actin比值,代表CK19 mRNA表达的相对含量,并与术后病理检查结果比较.结果 在甲状腺癌中CK19 mRNA阳性率为95.0%,在甲状腺良性肿瘤中CK19 mRNA阳性率为45.5%,两者的阳性率比较有统计学意义(P＜0.01),且恶性肿瘤组CK19 mRNA的表达率高于良性肿瘤组.表达CK19 mRNA病例的半定量观察结果显示,恶性肿瘤组的CK19 mRNA表达明显高于良性肿瘤组,两者的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CK19 mRNA在甲状腺肿瘤的表达可视为恶性肿瘤的标志,在良恶性甲状腺肿瘤的鉴别中具有重要应用价值.
关键词： 甲状腺肿瘤 甲状腺癌 CK19 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) -
病毒性肝炎患者血清庚型肝炎RNA的检测
目的:了解A～C型及非A～非E型病毒性肝炎患者庚型肝炎病毒(HGV)的感染情况.方法:对103名病毒性肝炎患者采用ELISA和RT-PCR检测HGV-RNA,根据不同病原类型和不同临床类型的肝炎患者对庚型病毒的感染情况进行分析.结果:不同病原肝炎患者中,乙型肝炎患者HGV-RNA的阳性率为33.3%,明显高于其他类型的肝炎患者(P＜0.01),在不同临床类型的肝炎患者中,慢性肝炎患者HGV-RNA的阳性率为32.6%,明显高于其他临床类型的肝炎患者(P＜0.01).结论:HGV是病毒性肝炎的病原之一,在病毒性肝炎患者中感染率较高,并常与其他类型的肝炎病毒合并感染.
关键词： 病毒性肝炎 庚型肝炎病毒 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) -
风疹病毒感染三种实验诊断方法应用分析
目的 通过比较风疹病毒感染中IgM抗体、病毒核酸和病毒分离等三种检测方法的检测结果,分析其在风疹病毒感染实验室诊断中的应用.方法 来源于2009年～2011年中风疹疫情暴发和医院门诊的47份临床诊断为风疹病毒感染患者血液和咽拭子标本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中风疹病毒IgM抗体、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测咽拭子中的风疹病毒核糖核酸(RNA)和病毒分离比色法免疫学实验(VICI)分离培养检测风疹病毒,对其结果进行比较.结果 IgM抗体和病毒核酸阳性率分别为78.7%和76.6%,两者差异无统计学意义(χ2=0.06,P>0.05);VICI检测阳性率为36.2%,与前两者比较差异显著(χ2分别为17.41和15.62,P<0.01);IgM检测在出疹4天后阳性率可达100%,而核酸检测在出疹3天内阳性率为100%,病毒分离在出疹3天内阳性率可达68.42%.结论 风疹IgM抗体及病毒核酸检测阳性率相当,ELISA检测IgM抗体操作简便,适用于出疹后期明确病原,而RT-PCR特异敏感,适用于感染早期病原诊断;而VICI实验步骤繁琐、所需时间长,阳性率较低.
