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MAD2B与TCF4相互作用及其对毛乳头细胞功能的影响
目的 探讨MAD2B基因过表达对毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)生物学功能的影响.方法 构建真核表达载体pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4质粒,在Lpofectamine TM 2000脂质体的介导下转染毛乳头细胞,荧光显微镜下观察转染效率,使用Western blot检测目的蛋白的表达,并验证两种蛋白的相互作用,比较细胞增殖状况,Wnt通路信号强度,毛乳头分泌胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth-promoting factors,HGF)的变化情况.结果 成功构建pIRES2-MAD2B和plRES2-TCF4重组质粒,且转染后发现MAD2B和TCF4蛋白过表达于毛乳头细胞.免疫共沉淀实验结果提示在凝集生长的毛乳头细胞中存在相互作用的MAD2B和TCF4蛋白质复合物.在MAD2B过表达于毛乳头细胞之后,发现Wnt途径信号通路强度下调.CCK-8实验结果提示MAD2B过表达后细胞增殖活性下降,与对照组比较有统计学差异(P＜0.05)；同时实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照组相比,IGF-1、VEGF、HGF mRNA的表达有所下降(P＜0.05).结论 免疫共沉淀提示MAD2B与TCF4在毛乳头细胞中存在相互作用,MAD2B过表达后可能通过抑制Wnt信号通路而对毛乳头细胞增殖和其旁分泌因子IGF-1、VEGF、HGF产生抑制作用.
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外源性人端粒酶逆转录酶基因转染对正常人毛乳头细胞的影响
目的 研究外源性人端粒酶逆转录酶( human telomerase reverse transcriptase,hTERT) 基因转染对体外培养正常人毛乳头细胞的影响.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导人体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.检测转染细胞内hTERT基因的整合和表达情况,初步分析转染细胞的生物学特性.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,传代次数增加,已连续传至35代.检测证实转染细胞内hTERT 基因在 DNA、mRNA和蛋白质水平均有表达,且此转染细胞具有体外培养正常毛乳头细胞的生物学特性.结论 外源性 hTERT 基因转染可以延长体外培养正常人毛乳头细胞的寿命且可保持其正常的生物学特性.
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硫酸软骨素、硫酸肝素对毛乳头细胞粘附及生长的影响
目的 探讨细胞外基质在毛囊生长发育中的作用，寻找毛乳头细胞（DPC）生长的调节因素。方法 用两步酶消化法分离培养DPC,并通过免疫组化α-平滑肌肌动蛋白（Actin）染色证实。测定硫酸软骨素A，硫酸软骨素C及硫酸肝素对DPC粘附及生长的影响。结果 两步酶消化法分离培养DPC效率高，纯度高，方法简单易行。硫酸软骨素A和硫酸肝素明显促进DPC粘附及生长，而硫酸软骨素C作用不明显。结论 某些细胞外基质可调节DPC的生长，从而影响毛囊的生长发育。
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正常人毛乳头细胞和真皮鞘细胞的生长特性观察
目的观察毛乳头细胞和真皮鞘细胞在体外培养条件下的生长特性.方法采用胶原酶消化法培养正常人头皮毛囊的毛乳头细胞和真皮鞘细胞,在体外进行传代培养,测定毛乳头细胞不同时相点的细胞数,并观察表皮细胞生长因子、氢化可的松+胰岛素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对毛乳头细胞和真皮鞘细胞增殖的影响.结果毛乳头细胞、真皮鞘成纤维细胞和真皮成纤维细胞的生长呈现3个时相,即停滞期、指数生长期和缓慢生长期.3种细胞都有4 d的停滞期,5～11 d为指数生长期,之后呈现出缓慢生长.EGF对3种细胞都有明显的促进作用(P<0.001),尤其是对真皮鞘成纤维细胞的作用更强.氢化可的松和胰岛素、GM-CSF对3种细胞的作用不明显.毛乳头细胞、真皮鞘细胞和成纤维细胞的倍增时间分别为60、59.2、76.8 h.结论 EGF对毛乳头细胞、真皮鞘细胞和成纤维细胞具有显著促生长作用,可能与它们存在着EGF的受体有关.
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人毛囊细胞来源双层皮肤替代物的构建和组织学特征
目的 探索人毛囊细胞构建的双层皮肤替代物的组织学特征.方法 用毛乳头细胞、真皮鞘细胞分别与外根鞘细胞构建复合壳多糖双层皮肤替代物,分析其体外和移植至大白鼠后的组织学特征.结果 毛囊来源细胞构建的皮肤替代物中表皮细胞排列更紧密、角化突出,真皮内可见与表皮相连的上皮细胞柱及球形膨大细胞团形成.结论 毛囊细胞是构建皮肤替代物的良好细胞来源.
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人毛乳头细胞在不同传代时期某些细胞因子表达的变化
目的 观察毛乳头细胞在体外培养条件下的生长特性,为毛囊重建提供参考资料.方法 采用二步酶消化法分离正常人头皮毛囊的毛乳头细胞,在体外进行传代培养,用免疫组化方法观察不同传代毛乳头细胞生长因子表达的差异.结果 高代培养毛乳头细胞逐渐丧失其凝集性生长的特性,生长因子的表达逐渐消失.结论 毛乳头细胞的生长及其特性的保持受许多因素的影响,体外培养的毛乳头细胞与体内有差异.低代毛乳头条件培养基可恢复毛乳头细胞部分生长特性.
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毛乳头细胞凝集性生长对诱导毛囊样结构形成能力的影响
目的以细胞外基质成分纤维连接蛋白促进培养的人头皮毛乳头细胞凝集性生长行为,观察毛乳头细胞的凝集性生长对诱导毛囊形成能力的影响.方法传代培养的人头皮毛乳头细胞经细胞外基质纤维连接蛋白预处理后,促进形成凝集性生长团,再与毛囊上皮细胞共同移植于裸鼠皮下,分别于8、12周进行组织学检查,观察毛囊形成及分化程度.结果8周后纤维连接蛋白预处理的毛乳头细胞组可见有毛囊样结构形成,未处理组仅见松散细胞团;12周后两组均可见有毛囊样结构形成,但纤维连接蛋白预处理组较未处理组诱导形成毛囊样结构分化更成熟;真皮成纤维细胞组未见有毛囊样结构形成.结论毛乳头细胞的凝集性生长特性对其诱导毛囊形成的能力有密切的关系,细胞呈凝集性生长后,其生物学功能增强.
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人毛乳头细胞HSPC016基因在毕赤酵母中的表达和鉴定
目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的真核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定.方法用PCR从pET-28a(+)/HSPC016中扩增出195 bp目的基因,克隆至酵母表达载体pPIC9K质粒,经酶切鉴定后转化毕赤酵母菌GS115,G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导表达后进行Western blot检测和目的蛋白N-端氨基酸测序鉴定.结果用PCR成功扩增出目的基因;pPIC9K/HSPC016转化GS115用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白相对分子量约为7.2×103,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约18%;Western blot检测具有良好的免疫反应性;N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致.结论HSPC016基因能通过酵母表达载体pPIC9K及宿主菌GS115进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因在真核细胞水平表达的生物学意义奠定了基础.
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人毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因cDNA文库的构建
目的构建毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的消减cDNA文库.方法分别提取凝集性生长和非凝集性生长状态下毛乳头细胞中的总RNA,应用SMART cDNA合成技术和抑制性消减杂交技术分离毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的cDNA片段并建立消减cDNA文库;利用PCR对随机挑选的100个白色菌落进行插入片段的验证,对其中证实有插入片段的30个克隆进行cDNA斑点杂交验证.结果所构建的消减cDNA文库扩增后得到320个阳性克隆,随机挑选的100个阳性克隆中95%的均有长度在100～600 bp的插入片段,cDNA斑点杂交验证显示27个(90.0%)克隆为阳性.结论结合SMART cDNA合成技术,应用抑制性消减杂交成功地构建了毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选和克隆毛乳头细胞凝集性生长相关基因奠定了基础.
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毛乳头细胞生长相关基因的筛选
研究表明,位于毛囊基底部的特殊间质成分--毛乳头在毛囊的生长发育、周期调控及维持毛发生长中起主导作用.毛乳头的功能障碍是导致毛囊周期失衡和脱发现象的主要起始因素.因此研究毛囊的生长发育、调控机制应不能脱离毛乳头细胞的功能状态.
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人毛乳头细胞HSPC016基因在大肠杆菌中的表达和鉴定
目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的原核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定.方法采用PCR技术从pcDNA3.1(+)/HSPC016中扩增出195bp目的基因,克隆至pMD18-T载体,双酶切回收纯化目的片段后连接至同样酶切回收的表达载体pET-28a(+)质粒中.重组质粒经酶切及测序鉴定后转化工程菌E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,UVP图像扫描分析并对目的蛋白进行N-端氨基酸测序鉴定.结果采用PCR技术成功地从pcDNA3.1(+)/HSPC016中扩增出195bp目的基因,序列分析显示HSPC016基因ORF由195bp组成并与GenBank公布序列完全一致.原核表达载体pET-28a(+)/HSPC016转化工程菌E.coli BL21并经诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白Mr约为7 200,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约20%.N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致.结论 HSPC016基因能通过原核载体pET-28a(+)及工程菌E-coli BL21进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因表达的生物学意义奠定了基础.
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毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究
目的探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性.方法采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞,进行毛囊组织工程重建,或用游离细胞混合移植于裸鼠,组织学观察毛囊形成情况. 结果毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤,在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构,移植于裸鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊.低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊,并有肉眼可见的毛发纤维产生.结论毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力,通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用,可诱导毛囊形成.
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毛乳头细胞促进组织工程皮肤血管化的实验研究
目的 探讨毛乳头细胞对表皮干细胞与同种异体脱细胞真皮基质构建的组织工程皮肤血管化的影响. 方法 取门诊包皮环切术患者皮肤,用于表皮细胞培养；取孕19、20周引产胎儿头部皮肤,用于毛乳头细胞培养；患者及家属均知情同意.以中性蛋白酶联合胰蛋白酶消化、分离表皮细胞,Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞；以Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头,常规成纤维细胞培养液培养.以同种异体脱细胞真皮基质为支架,在真皮基质的真皮乳头侧种植毛乳头细胞,基底膜侧种植表皮干细胞构建实验组组织工程皮肤替代物;对照组组织工程皮肤替代物不种植毛乳头细胞.取6～8周龄BALB/C-nu裸鼠60只,随机分成实验组和对照组(n=30)；实验动物背部制造1 cm×1 cm大小全层皮肤缺损模型,将两组组织工程皮肤替代物移植修复创面,2周后观察移植皮肤成活率.术后2、4周,取移植皮肤替代物标本,行HE及免疫组织化学染色,观察移植皮肤替代物CD31表达水平,并计算两组标本血管密度. 结果 Ⅳ型胶原分选后表皮细胞同时表达角蛋白19、β1整合素,提示为表皮干细胞.由毛乳头培养出的细胞表达α平滑肌肌动蛋白,提示为毛乳头细胞.动物移植术后2周,实验组移植皮肤成活率为93.3％ (28/30),对照组为80.0％ (24/30),比较差异有统计学意义(x2=2.31,P=0.00).HE染色观察示实验组表皮层达12层,表皮细胞体积较大；对照组表皮层达4～6层,表皮细胞体积较小.实验组术后2、4周,血管密度分别为(38.56±2.49)个/mm2和(49.12±2.39)个/mm2,对照组分别为(25.16±3.73)个/mm2和(36.26±3.24)个/mm2,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 毛乳头细胞可促进移植皮肤替代物血管形成,利于表皮层重建,提高组织工程皮肤移植成活率.
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角质形成细胞培养基培养毛乳头细胞的实验研究
目的 毛乳头细胞被广泛用于组织工程毛囊和皮肤构建.探讨用含血清的角质形成细胞培养基(keratinocyte medium,KM)和普通培养基(normal medium,NM)培养毛乳头细胞的生物学特性差异,以及KM培养的毛乳头细胞是否可用于组织工程毛囊研究. 方法 采用两步酶消化法从除皱术时切下的头皮标本中分离培养毛乳头,接种后分别采用KM和NM培养毛乳头细胞并传代.记录毛乳头早贴壁时间及细胞迁出时间,接种5 d时统计毛乳头贴壁率.倒置显微镜下观察两组细胞形态学变化,计数第3代细胞每皿聚集体个数;记录细胞大传代次数;细胞融合成膜后取第3代细胞行MTT法检测细胞增殖;免疫荧光染色和ALP染色观察α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和ALP在两组细胞中的表达,并统计ALP蓝色阳性区域面积. 结果 KM组毛乳头早贴壁时间及细胞迁出时间分别为24h及64h,早于NM组的48 h及80h.5 d时KM组及NM组毛乳头贴壁率分别为54.17%及36.78%.NM组细胞体积较KM组大.NM组第3代细胞每皿形成(3.06±1.12)个聚集体,KM组每皿形成(9.25±1.73)个聚集体,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).KM组细胞融合后细胞膜片行HE染色可见细胞呈多层性;NM组细胞不能多层性生长,未行HE染色观察.NM组细胞多可传7代;KM组多可传15代.MTT检测显示KM组细胞增殖迅速,7 d后KM组吸光度值明显高于NM组,差异有统计学意义(P<0.05).免疫荧光染色显示,两组第3代细胞α-SMA均为阳性.ALP染色显示,NM组第6代细胞中仅少量细胞表达ALP,阳性区域面积为(987±146)μm~2;KM组第14代细胞ALP染色仍为阳性,阳性区域面积为(8 757±558)μm~2;两组比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论 毛乳头细胞在含血清的KM中增殖迅速,聚集生长明显,传代次数增多;用含血清KM培养毛乳头细胞用于组织工程毛囊构建是可行的.
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层粘连蛋白、纤维粘连蛋白在体外传代的毛乳头细胞中表达的研究
目的通过测定体外传代培养的毛乳头细胞中的层粘连蛋白(LM)、纤维粘连蛋白(FN)表达的变化,探讨LM、FN在体外毛乳头细胞的聚集、粘附、生长中是否具有重要作用.方法取正常人头皮以两步酶分离法获得毛乳头进行培养,分别对1、3、6、9代毛乳头细胞做LM和FN免疫组化S-P染色,检测其表达情况.结果培养的毛乳头细胞的胞浆中LM和FN在第1、3、6、9代免疫组化染色均为强阳性;毛乳头细胞培养到第9代,其细胞形态已发生变异,失去典型的梭形形态,已没有凝聚性生长的特性,并且细胞生长非常缓慢,已不适宜再传代.结论传代毛乳头细胞的LM、FN表达持续强阳性,提示传代培养的毛乳头细胞具有持续分泌LM、FN的能力,但LM、FN在体外传代培养的毛乳头细胞的聚集、粘附、生长中不是主要的影响因素.
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从成纤维细胞生长现象探讨毛乳头细胞凝集性生长的成因
成纤维细胞和毛乳头细胞同属于真皮成分,有学者认为,毛乳头细胞是一种特殊化的成纤维细胞,但这种细胞缺乏特异的细胞标志,要将毛乳头细胞与成纤维细胞区别开,主要依赖于毛乳头细胞的一个特异性生长特征,即凝集性生长现象[1].
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BMP-4对毛乳头细胞增殖和迁移的影响
目的 探索BMP-4对体外培养的人毛乳头细胞增殖和迁移的影响.方法 将含不同浓度BMP-4的MSCM培养基培养毛乳头细胞48h后行MTT检测毛乳头细胞的增殖情况;将铺满90%培养皿底的毛乳头细胞划痕后以含不同浓度BMP-4的MSCM培养基培养,分别于0h,8h,24h和48h测量毛乳头细胞爬行的距离.结果 10%BMP-4能促进毛乳头细胞的增殖和迁移.结论 BMP-4对于毛囊形成及发育具有重要意义.
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海藻多聚糖硫酸酯对人毛乳头细胞增殖的影响
目的:实验旨在观察褐藻多聚糖硫酸脂对体外培养人毛乳头细胞增殖的影响.方法:采用两步酶消化法分离纯化人毛乳头细胞,取第5代细胞用于实验,选择8个浓度的海藻多聚糖硫酸酯作用于体外培养的人毛乳头细胞72h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性.结果:显示0.1 ～1.25mg/ml浓度范围的海藻多聚糖硫酸酯有明显的促进细胞增殖作用(P＜0.05).结论:海藻多聚糖硫酸酯在一定浓度范围内可促进毛乳头细胞增殖.
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人毛乳头细胞条件培养液对斑秃患者的治疗作用
目的:观察人毛乳头细胞(DPC)条件培养液对斑秃患者的治疗作用,探讨DPC分泌促进毛囊生长的活性物质.方法:收集体外培养低传代DPC培养上清,制成冻干粉,用于治疗50例斑秃患者,并分别选择其中26例和10例作去炎松组和空白组自身对照.结果:DPC条件培养液组、去炎松组和空白组治愈率分别为74%、54%、10%,有效率分别为96%、73%、30%,DPC条件培养液组其治愈率和有效率均明显高于去炎松组和空白组(P＜0.01).结论:人DPC条件培养液有促进斑秃患者毛囊生长的作用.
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毛囊黑素干细胞分化与移行调控机制的研究进展
毛囊作为一个重要的成体干细胞贮存区域,其富含的干细胞可分化形成毛囊及上皮的多种细胞,对维持毛发的周期性生长有重要作用[1].其中毛囊黑素干细胞起源于神经嵴,并迁移通过真皮和表皮终停留在毛囊,目前研究已经表明它的生理功能包括两方面,一方面向上移行进入表皮形成表皮黑素单元;另一方面,在毛囊生长期,毛囊黑素干细胞周期性向下进入毛母质形成毛囊黑素单元[2].毛囊黑素干细胞在形成毛囊黑素单元过程中,主要受比邻的毛囊干细胞、角质形成细胞、毛乳头细胞、周边的基底膜成分及内在的转录因子等调控,这些细胞和基质蛋白通过不同的通路调节了毛囊黑素干细胞的分化和移行.
