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抗DR5单抗增强顺铂诱导HeLa细胞凋亡作用的研究
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL )主要通过死亡受体5(death receptor, DR5)诱导肿瘤细胞凋亡.本文旨在探讨顺铂对HeLa细胞表面DR5分子表达影响及抗DR5单抗mDRA-6对顺铂诱导HeLa细胞凋亡增强作用.用间接免疫荧光染色结合流式细胞术分析DR5分子表达;MTT法检测HeLa细胞毒作用;用AnnexinV/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率;荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学改变.结果:正常HeLa细胞表面DR5表达量为30.01%,顺铂不能上调HeLa细胞表面DR5表达;mDRA-6可以明显提高顺铂对HeLa细胞的细胞毒作用,且存在剂量效应关系,IC50值约为12.5 μg/ml.研究结果表明,mDRA-6能够明显增强顺铂对HeLa细胞的细胞毒及细胞凋亡作用.
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抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用
探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对人肝癌细胞系HepG2致凋亡的作用.常规培养人肝癌细胞系HepG2,流式细胞术定量分析检测HepG2细胞表面DR5的表达.MTT法检测mDRA-6的细胞毒性作用;Annexin V-FITC/PI双色标记HepG2细胞,流式细胞术定量分析检测细胞凋亡率;在荧光显微镜下观察mDRA-6对HepG2细胞形态变化的影响.结果显示,HepG2细胞表面有DR5表达,其平均表达百分率为40%.MTT法检测显示在40 mg/L mDRA-6浓度下可杀伤42%的细胞;Hoechst33258染色证实杀伤作用是通过细胞凋亡实现的经流式细胞术检测显示,3 mg/L的mDRA-6作用HepG2细胞6 h导致24.61%的细胞发生凋亡;在荧光显微镜下可观察到mDRA-6诱导导致HepG2细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征.上述结果表明,mDRA-6能够诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡.
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藤黄酸联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导 配体诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的 效果和机制
背景与目的:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能选择性地杀伤肿瘤细胞,但多种肿瘤对其耐药.该研究旨在探讨藤黄酸(gambognic acid,GA)与TRAIL联合对人结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的影响及GA联合TRAIL抗结肠癌的作用机制.方法:建立人结肠癌HT-29细胞裸鼠皮下移植瘤模型,测定TRAIL和(或)GA对裸鼠移植瘤的影响,采用H-E染色观察肿瘤组织形态结构改变,TUNEL法检测细胞凋亡状况;HT-29细胞经过siRNA干扰Nrf2表达后,通过AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,RT-PCR法检测Nrf2、Bcl-2、Bax和DR5 mRNA的表达水平.结果:联合应用GA显著促进了TRAIL对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制(抑瘤率达67.0％)和诱导凋亡作用,下调了组织中Nrf2、Bcl-2的表达,增强了Bax和DR5的表达;与阴性对照siRNA相比,Nrf2干扰能明显上调TRAIL诱导HT-29细胞的凋亡率,提高ROS含量,下调Nrf2和Bcl-2表达,上调Bax和DR5表达.结论:GA可能是通过下调Nrf2表达,使ROS水平升高而激活线粒体凋亡途径与死亡受体途径,从而逆转人结肠癌HT-29细胞体内外对TRAIL的耐药性.
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DR5来源的反义多肽FR-11的合成及其抑制TRAIL介导细胞凋亡的活性研究
目的:筛选出能影响配体TRAIL功能的死亡受体DR5来源的反义多肽.方法:依据蛋白质密码理论,编写可按参数要求进行氨基酸序列匹配比对的生物学软件,利用该软件对TRAIL(序列Ⅰ)和DR5(序列Ⅱ)进行比对,寻找两序列间的反义同源盒匹配序列.结合蛋白质和配体一受体复合物的结构信息,进一步理论筛选相互作用区域,合成可能与TRAIL作用的小分子活性肽.采用ELISA结合和竞争实验,分析所合成多肽与TRAIL的结合;在TRAIL诱导细胞凋亡实验中,分析与死亡受体竞争结合TRAIL的程度,观察多肽影响TRAIL介导细胞凋亡的生物活性.结果:经软件初筛选和理论分析,共合成10条多肽.通过ELISA结合实验筛选到一条多肽(命名为"FR-11"),能与TRAIL发生浓度依赖性的特异结合,并能抑制DR5与配体TRAIL的结合.该多肽与TRAIL97～103aa的匹配率大干50%,计算机模拟三维结构显示该序列位于DR5的胞外区,是与TRAIL结合的关键区域.细胞学实验表明:FR-11肽能够抑制TRAIL介导的SW1990细胞和L929细胞的凋亡,这种抑制作用呈FR-11浓度依赖性,而在TRAIL浓度较低时更为明显,提示能抑制TRAIL与死亡受体的结合.结论:根据蛋白质密码理论设计的软件能筛选出影响配体-受体相互作用的功能反义多肽;某些多肽能模拟受体与配体发生结合,具有抑制配体介导的生物活性.
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细菌双杂交系统在细胞外蛋白质相互作用中的应用
目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性.方法:应用Stratagene BacterioMatch two hybrid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合表达质粒.重组质粒分别相应共转化报告菌株XL1-Blue MRF,报道基因产物以抗羧苄青霉素和β-半乳糖苷酶活性作为转录激活的指标.结果:pTRG-TRAIL与pBT-DR4,pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后在高浓度羧苄青霉素(500 μg/ml以上)筛选下宿主菌呈转录激活状态,pTRG-TRAIL与pBT-OPG 组共转化后在低浓度羧苄青霉素(250 μg/ml以下)筛选下宿主菌呈转录激活状态,用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆.对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2,pBT-DR4、pBT-DR5或pBT-OPG与pTRG-Gal11 4组共转化后呈阴性.结论:所用的双杂交序列皆为编码这些蛋白质的细胞外区域,而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证,所以细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究.
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槲皮素通过SIRT1/ROS/DR5途径提高TRAIL 抗前列腺癌活性的研究
目的 探讨槲皮素是否与肿瘤坏死因子诱导凋亡配体(TRAIL)有协同抗前列腺癌效应并研究其机制.方法 噻唑蓝(MTT)实验检测前列腺癌细胞系PC3的细胞活力;流式细胞术检测PC3细胞的凋亡和活性氧簇(ROS)的产生;Western blot实验检测PC3细胞去乙酰化酶-1(SIRT1)、死亡受体5(DR5)表达水平及半胱天冬酶-8(caspase-8)、半胱天冬酶-3(caspase-3)活化水平.结果TRAIL联合槲皮素对P3的细胞活力抑制率和凋亡诱导率显著高于TRAIL单治疗组[(64.7±5.2)％比(16.9±1.4)％,P<0.05;(34.7±2.6)％比(9.1±0.8)％,P<0.05].TRAIL联合槲皮素治疗组SIRT1表达水平显著低于TRAIL单治疗组,同时TRAIL联合槲皮素治疗组DR5表达水平、ROS水平及cas-pase-8、caspase-3活化水平均显著高于TRAIL单治疗组.另外,TRAIL+槲皮素+SIRT1质粒组及TRAIL+槲皮素+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组PC3的细胞活力抑制率和凋亡诱导率均显著低于TRAIL联合槲皮素组[(23.4±1.9)％,(21.5±1.8)％比(64.7±5.2)％,P<0.05;(12.5±1.2)％,(11.3±1.1)％比(34.7±2.6)％,P<0.05].结论 槲皮素通过SIRT1/ROS/DR5途径提高TRAIL抗前列腺癌活性.
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川楝素对TRAIL抗肝癌活性及其机制研究
目的 观察川楝素对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗肝癌活性影响并研究其机制.方法 将HepG2人肝癌细胞分为对照组、川楝素组、TRAIL组、川楝素+TRAIL组及川楝素+TRAIL+DR5小干扰RNA (DR5 siRNA)组,CCK-8法检测HepG2细胞活力,流式细胞术检测HepG2细胞的凋亡和线粒体膜电位,Western blot实验和流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5表达水平及Caspase-8、Caspase-3活化水平.结果 TRAIL+川楝素组HepG2相对细胞活力(0.42±0.04),显著低于TRAIL单治疗组(0.84±0.07,P＜0.05)和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组(0.76±0.06,P＜0.05).TRAIL+川楝素组HepG2细胞凋亡率(32.7±2.4)％,显著高于TRAIL单治疗组[(9.3±0.9)％,P＜0.05]和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组[(13.8±1.1)％,P＜0.05].川楝素处理对HepG2细胞Bcl-2家族蛋白的表达无明显影响,但能显著提高HepG2细胞表面DR5表达水平.TRAIL+川楝素组HepG2细胞的相对线粒体膜电位(0.26±0.02),显著低于TRAIL单治疗组(0.78±0.06,P＜0.05)和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组(0.68±0.05,P＜0.05).TRAIL+川楝素组HepG2细胞Caspase-8表达水平(0.37±0.04),显著高于TRAIL单治疗组(0.11±0.04,P＜0.05)及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组(0.14±0.02,P＜0.05);TRAIL+川楝素组HepG2细胞Caspase-3表达水平(0.42±0.04),显著高于TRAIL单治疗组(0.13±0.02,P＜0.05)及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA组(0.17±0.02,P＜0.05).结论 川楝素可上调肝癌细胞死亡受体5(DR5)表达,提高TRAIL抗肿瘤活性.
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TRAIL和ACNU对实验性大鼠脑胶质瘤的治疗作用
[目的] 观察TRAIL和嘧啶亚硝脲(ACNU)对实验性大鼠脑胶质瘤的治疗作用,并探讨TRAIL和ACNU联合在诱导细胞凋亡中的作用机制.[方法] 制备Wistar大鼠C6细胞胶质瘤动物模型,并随机分成4组:TRAIL+ACNU治疗组(A组)、ACNU治疗组(B组)、TRAIL治疗组(C组)、生理盐水对照组(D组).观察动物的生存状况及肿瘤大体情况,测量肿瘤的体积、计算肿瘤的抑制率;观察TRAIL R2/DR5免疫组织化学表达变化情况;电镜观察肿瘤细胞变化:流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况.[结果] A组与B组的大鼠生存较好,而C组与D组的大鼠生存差.肿瘤体积分别为A组(19.00±2.59)mm3 B组(68.76±5.56)mm3、C组(230.31±13.94)mm3、D组(238.84+10.64)mm3.除C组和D组相比无显著差异外,4组间两两比较均有显著差异(P<0.05).电子显微镜观察,A组和B组可见明显凋亡小体,C组与D组少见.肿瘤细胞凋亡率A组(20.38%±1.62%)大于8组(14.85%±2.41%),差异有显著性(P<0.05):C组(0.44%±0.21%)与D组(0.35%±0.24%)相比较差异无显著性(P>0.05).[结论]ACNU引起肿瘤细胞凋亡,并可诱导大鼠脑胶质瘤细胞表达DR5,使其对TRAIL诱导的凋亡敏感,TRAIL和ACNU体内联合应用具有协同作用.
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TRAIL及其受体在肝脏疾病中的作用研究进展
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是近年来发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族成员之一,越来越多的证据表明TRAIL及其受体介导的细胞凋亡在多种肝脏疾病的发生发展中有着重要作用,TRAIL及其受体的发现为肝脏疾病的治疗提供了新的研究方向.
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苦参碱对人肝星状细胞系LX-2凋亡影响的研究
肝纤维化是肝病研究领域的一大热点,目前认为诱导活化的肝星状细胞(HSC)凋亡是治疗肝纤维化的有效方法.肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族的新成员[1].
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重组人可溶性DR5 蛋白的表达、制备及其生物活性检测
目的:纯化毕赤酵母GS115菌株表达的重组人可溶性死亡受体5(DR5)蛋白,并研究其对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)所诱导细胞凋亡的阻断效应.方法:大量扩增可溶性DR5酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株,收集上清,利用ProBondTM亲和层析柱纯化获得重组可溶性DR5蛋白,用SDS-PAGE、Western Blot检验纯化产物的特异性和纯度.用MTT法检测纯化的可溶性DR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡作用的阻断效应.结果:转化阳性的毕赤酵母GS115菌株可成功表达分子量为26 kD的可溶性DR5蛋白,经ProBondTM亲和层析柱纯化,SDS-PAGE、Western Blot鉴定,结果显示获得了高纯度的重组人可溶性DR5蛋白,蛋白产量达20μg/ml;体外活性检测结果显示,纯化的可溶性DR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的Hela细胞的凋亡,阻断率高达53.6%.结论:经纯化后的重组人可溶性DR5蛋白可有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应.
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DR4和DR5在人胃癌细胞系中的表达及其启动子区甲基化水平
目的 探讨DR4和DR5在胃癌发病中的作用及分子机制,为胃癌治疗提供新思路.方法 分别采用RT-PCR、Western blot和甲基化特异性-PCR(MS-PCR)检测四种胃癌细胞株(AGS、SGC7901、MKN28、MGC803)内DR4和DR5 mRNA表达水平、蛋白表达水平及启动子区甲基化水平,同时以自胃溃疡患者切除胃黏膜分离的细胞为对照.结果 除MGC803细胞DR5外,余胃癌细胞中DR4、DR5 mRNA及蛋白表达水平均显著低于胃溃疡细胞(P均＜0.05),且其启动子区有高甲基化现象.结论 DR4和DR5表达水平降低在胃癌发病中具有重要作用,其分子机制可能为启动子区高甲基化.
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内毒素诱导的葡萄膜炎大鼠眼内DR5的表达研究
目的 观察内毒素诱导的葡萄膜炎动物模型眼内DR5的表达,研究炎症细胞的凋亡与TRAIL/DR5表达的关系.方法 选取SD大鼠随机分为3组:空白对照组、生理盐水注射组、内毒素注射组.其中内毒素注射组是将内毒素注射到大鼠后足底制成葡萄膜炎动物模型.空白对照组无任何操作,生理盐水注射组以及内毒素注射组又根据注射后不同时间分为6h、12 h、24 h、48 h4个亚组.在注射后不同时间摘除眼球,通过透射电镜观察虹膜毛细血管炎症细胞和内皮细胞的超微结构变化;运用免疫组织化学法检测内毒素诱导后不同时间DR5蛋白在炎症细胞上的表达.结果 透射电镜显示:空白对照组以及生理盐水注射组虹膜组织中毛细血管内皮细胞可见微绒毛、较多的吞饮小泡,未见有明显的结构、形态异常.内毒素注射6h组的毛细血管内皮细胞的吞饮小泡数目开始减少,浸润的中性粒细胞和淋巴细胞出现了染色质边集的表现;24 h组吞饮小泡数目减少明显,大量的中性粒细胞和淋巴细胞出现了染色质浓缩、线粒体空泡样变的凋亡表现.免疫组织化学结果显示:DR5蛋白在空白对照组以及生理盐水注射组大鼠的虹膜色素上皮层呈阴性着色;内毒素注射组中,DR5蛋白在虹膜组织的炎症细胞上呈阳性着色,从6h组炎症细胞就出现,24 h组DR5在炎症细胞中的着色数量及着色强度达到高,光密度值达到0.085 9±0.019 6,与6h组、12 h组、48 h组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 TRAIL及其受体DR5可能参与了内毒素诱导的葡萄膜炎中炎症细胞的凋亡.
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反复自然流产与绒毛中TRAIL及其受体的表达相关性分析
目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL及其受体在不明原因早期反复自然流产患者(URSA)绒毛中的表达.方法:实验组15例,为妊娠45～60d的URSA患者;对照组15例,为健康的人工流产患者.2组分别取绒毛组织采用免疫组化法检测TRAIL及其受体的表达.结果:实验组绒毛组织中TRAIL及其受体DR4、DR5蛋白表达较强,诱骗受体DcR1及DcR2蛋白与正常对照组相比表达较少.结论:TRAIL及其受体参与维持母胎界面的免疫耐受,其表达失衡可能导致绒毛细胞凋亡紊乱,是造成自然流产的机制之一.
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非竞争ELISA法测定抗DR5单克隆抗体功能性亲和常数
目的:测定抗DR5单克隆抗体功能性亲和常数.方法:采用非竞争性ELISA固相法,经确定佳抗原包板浓度、佳抗原包板时间及佳抗原与抗体结合反应时间后,得到DR5与抗DR5的两株单克隆抗体的抗原抗体结合反应曲线,计算抗DR5两株单抗的亲和常数.结果:抗DR5(366EC)的功能性亲和常数在2.63×109M-1水平,抗DR5(mDRA-6)的功能性亲和常数在1.004×109.结论:抗DR5与DR5结合能力较强,为今后进行免疫学检测和开发进行肿瘤靶向治疗提供了理论基础.
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抗人DR5单抗对人肝癌细胞系的凋亡作用
目的:探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对人肝癌细胞系的凋亡诱导活性.方法:常规培养人肝细胞HL7702,单克隆抗体对细胞的杀伤活性用MTT法检测、对细胞的凋亡作用采用Hoechst 33258染色荧光显微镜下观察细胞形态变化及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析技术.结果: MTT的结果显示抗体的量和细胞杀伤率之间有明显的线性关系,随着抗体浓度的增加,细胞的杀伤率就增加;荧光显微镜下mDRA-6诱导导致细胞呈现典型的细胞凋亡的形态性特特征;流式细胞术检测显示, 2 mg/L的mDRA-6作用人肝肝癌癌细胞系SMMC-7721细胞6 h,细胞凋亡率为35%. 结论:mDRA-6能够诱导人肝癌细胞系凋亡, mDRA-6具有诱导细胞凋亡的活性.
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吉西他滨作用于肝癌HepG2细胞后对DR5、caspase-8、caspase-9和caspase-3表达的影响
目的 研究吉西他滨作用于HepG2细胞后DR5、caspase-8、caspase-9、caspase-3的表达,以期探讨吉西他滨诱导HepG2细胞凋亡的机制.方法 应用MTT法和流式细胞仪体外研究吉西他滨对HepG2细胞增殖的影响；采用免疫细胞化学及Western blot法,观察吉西他滨作用于HepG2细胞24 h后DR5、caspase-8、caspase-9、caspase 3的表达情况.结果 吉西他滨对肝癌HepG2细胞的抑制作用呈时间和浓度依赖性；吉西他滨作用于HepG2细胞24 h后,细胞表面DR5及caspase-8、caspase-9、caspase-3的表达均增强.结论 吉西他滨诱导肝癌HepG2细胞凋亡的机制可能与其能够上调DR5及caspase-8、caspase-9、caspase-3的表达有关.
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TRAIL及其受体在乳腺癌组织中的表达及意义
目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体(DR4、DR5、DcR1、DcR2)在乳腺癌组织的表达及意义.方法 用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测60例乳腺癌及对应的正常乳腺组织中TRAIL及其受体的表达.结果 乳腺癌组织中TRAIL、DcR1、DcR2表达均低于正常乳腺组织(P＜0.05),且TRAIL及其受体的表达与乳腺癌的分期、分级等无关(P＞0.05).结论 TRAIL及其受体在乳腺癌凋亡过程中起着重要的作用,TRAIL及其诱骗受体低表达同乳腺癌的发生关系密切.
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Caspase-8和DR5在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用
目的 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)能诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无诱导凋亡作用.大多数神经母细胞瘤细胞株对TRAIL的诱导凋亡作用耐受与其Caspase-8表达缺失有关,也与细胞表面TRAIL受体的表达和分布有关.该文主要探讨Caspase-8及TRAIL受体DR5的表达在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞株SKNDZ凋亡中的作用及其发生机制.方法 应用RT-PCR方法检测IFN-γ作用前后SKNDZ细胞Caspase-8的表达;应用Western-Blot方法检测化疗药作用前后SKNDZ细胞DR5的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪(FCM)检测TRAIL、IFNγ+TRAIL、化疗药+TRAIL及化疗药+IFNγ+TRAIL对SKNDZ细胞生长及凋亡的影响.结果 SKNDZ细胞不表达Caspase-8,IFNγ作用后的SKNDZ细胞Caspase-8表达明显增加.对照组未检测到DR5蛋白表达,而阿霉素和依托泊苷处理后检测到DR5蛋白表达.表达Caspase-8的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用仍不敏感,而同时表达Caspase-8和DR5的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感.阿霉素/依托泊苷+IFNγ+TRAIL组早期凋亡率为:(17.9±3.6)%、(14.8±3.3)%,与IFNγ+TRAIL组(3.9±1.2)%比较,差异有显著性(F=26.233,P＜0.01).结论 同时表达Caspase-8和DR5的SKNDZ细胞恢复了对TRAIL的敏感性,Caspase-8和DR5在TRAIL诱导SKNDZ细胞凋亡中起着十分关键的作用.
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益气除痰方治疗脾虚型肺癌作用机制探讨
目的:从内质网应激(ERS)角度探讨益气除痰方治疗脾虚型肺癌的作用机制.方法:将60只成功建模的脾虚Lewis肺癌小鼠随机分为模型组,顺铂注射液(1 mg/kg)阳性对照组及益气除痰方低(2 g/kg)、中(4 g/kg)、高(8 g/kg)剂量组,联合用药组(益气除痰方4 g/kg+顺铂注射液1 mg/kg),每组10只.给药14 d后处死小鼠,检测肿瘤体积和质量;HE染色观察肿瘤组织病理学改变;免疫组织化学法、Western blot法检测肿瘤组织中CHOP、DR5蛋白表达.结果:与模型组比较,除益气除痰方低剂量组外各给药组肿瘤体积、肿瘤质量显著降低(P＜0.01),各给药组肿瘤组织中肿瘤细胞大量坏死,内质网应激蛋白CHOP、DR5表达显著升高(P＜0.01),其中以联合用药组作用佳.结论:益气除痰方和化疗对肺癌具有不同程度的抑制作用,联合用药效果更好,其作用机制可能与上调内质网应激蛋白CHOP、DR5表达介导细胞凋亡有关.
