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炎症性肠病患者硫嘌呤甲基转移酶 与嘌呤类药物毒副反应的关系
背景:嘌呤类药物广泛用于炎症性肠病(IBD)患者的诱导缓解和维持治疗,然而毒副反应的频繁发生使其临床应用受到限制.有研究显示检测硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性和基因型能预测硫唑嘌呤(AZA)相关的毒副反应.目的:评价TPMT活性和基因型与AZA治疗IBD的毒副反应的关系.方法:收集2008年10月～2010年12月于上海仁济医院确诊并接受AZA治疗(每日1kg)的78例IBD患者.采用高效液相色谱法(HPLC)检测TPMT活性,以直接测序和PCR法检测TPMT基因型.分析TPMT活性和基因型与AZA毒副反应的关系.结果:共19例患者发生毒副反应,包括4例血液学毒副反应.78例IBD患者的平均TPMT活性为(36.10+10.11) nmol 6-MTG·gHb-1·h-1.低TPMT活性组与高TPMT活性组发生总毒副反应和血液学毒副反应的OR值分别为6.82(95％ CI:0.58～79.91)和12.00(95％ CI:0.84～172.22),但差异均无统计学意义.仅1例患者发生TPMT*3C杂合子突变,突变率为1.3％,且该例患者发生了血液学毒副反应.结论:IBD患者的TPMT活性降低和基因突变与嘌呤类药物的总毒副反应和血液学毒副反应可能相关,但其临床实际应用价值有待进一步研究.
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DNA甲基转移酶1蛋白在人胃癌黏膜组织中的表达及其临床意义
背景:肿瘤组织存在DNA甲基化紊乱,包括与细胞增殖周期密切相关的癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化等.DNA甲基转移酶(Dnmt)参与甲基化的形成(主要是Dnmt3a和Dnmt3b)和维持(主要是Dnmt1),但目前对胃癌Dnmt蛋白的表达情况仍知之甚少,更缺乏其与肿瘤生物学行为和临床参数关系的研究.目的:探讨癌区、癌旁和外周正常黏膜组织中Dnmt1蛋白表达的差异及其临床意义.方法:收集38例胃癌患者标本,取癌区、癌旁和外周正常黏膜组织各1～2块,应用免疫组化SP法分析各黏膜组织中Dnmt1蛋白的表达,并探讨其与胃癌浸润和转移的关系.结果:在38例胃癌黏膜组织中,Dnmt1蛋白的表达阳性率为81.6%,显著高于相应癌旁(39.5%)和正常黏膜组织(10.5%)(P＜0.001).阳性切片中可见Dnmt1蛋白表达弥散分布于肿瘤或腺体的细胞质和细胞核,染色较均匀.Dnmt1蛋白表达与胃癌患者的年龄、肿瘤分化程度和有无淋巴结转移无明显相关性(P＞0.05),与性别呈一定的相关性(P=0.007).结论:Dnmt1蛋白过表达在人胃癌的发生和发展中起一定作用.
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巯嘌呤甲基转移酶检测在炎症性肠病治疗中的作用
巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)是硫唑嘌呤(AZA)/6-巯基嘌呤(6-MP)代谢的关键酶之一,而AZA/6-MP广泛用于难治性炎症性肠病(IBD)的治疗.TPMT的活性/基因型与AZA/6-MP的疗效和不良反应相关.进行TPMT活性/基因型检测有可能预测骨髓抑制等不良反应的发生.并能指导个体化治疗.
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DNA甲基化和组蛋白修饰的关键酶在胃癌中存在相互作用
目的 研究胃癌细胞和组织中DNA甲基转移酶1(DNMTl)、果蝇zeste基因增强子人类同源基因2(EZH2)和组蛋白去乙酰化酶1(HDACl)的表达及三者的相互作用.方法 实时定量PCR和Western印迹检测MKN28、SGC7901、BGC823、AGS 4株胃癌细胞和正常胃上皮细胞GES-1以及10对新鲜胃癌组织和相应的正常胃组织中DNMT1、EZH2、HDAC1的mRNA和蛋白表达水平；免疫共沉淀检测高分化(MKN28)、中分化(SGC7901)、低分化(BGC823)胃癌细胞和正常胃上皮细胞GES-1及中分化、中-低分化、低分化胃癌组织和正常胃组织中DNMT1、EZH2和HDAC1是否形成复合物.结果 与正常胃上皮细胞和胃组织相比,DNMT1、EZH2和HDAC1在胃癌细胞株和胃癌组织中均高表达,免疫共沉淀检测发现DNMT1、EZH2和HDAC1三者在高、中、低分化胃癌细胞株以及中、中-低、低分化胃癌组织中均形成复合物,但在正常胃上皮细胞和胃组织中不形成复合物.结论 DNMT1、EZH2和HDAC1在胃癌中高表达,并且三者存在相互作用,这可能是胃癌中DNA甲基化与组蛋白修饰存在相关性的重要机制.
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shRNA干扰DNA甲基转移酶1表达沉默可抑制人食管鳞状细胞癌KYSE30细胞的增殖并诱导凋亡
目的:探讨DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)基因表达沉默对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC) KYSE30细胞增殖和凋亡的影响.方法:设计并构建携带有特异性针对DNMT1基因的DNMT1-shRNA及阴性对照-shRNA重组载体.采用脂质体法将各shRNAs转染至KYSE30细胞中,通过嘌呤霉素来筛选稳定转染的细胞株;蛋白质印迹法检测各转染组细胞中DNMT1蛋白的表达情况;RT-PCR法检测KYSE30细胞中DNMT1基因沉默后对抑癌基因视黄酸受体β(retinoic acid receptor beta,RARβ)mRNA表达水平的影响;MTT法检测DNMT1基因沉默后对KYSE30细胞增殖的影响;FCM法检测对细胞凋亡的影响.结果:筛选获得稳定转染至KYSE30细胞且干扰效果好的DNMT1-shRNA2;蛋白质印迹法显示DNMT1-shRNA2能够显著抑制KYSE30细胞中DNMT1蛋白的表达;同时RT-PCR检测发现,采用DNMT1shRNA2干扰DNMT1的表达后能使抑癌基因RARβ mRNA重新表达;并且,KYSE30细胞增殖能力下降,凋亡率增加(P值均＜0.01).结论:DNMT1基因表达沉默能够诱导KYSE30细胞中抑癌基因RARβ的重新表达,这可能是抑制KYSE30细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡的主要作用机制.
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EZH2和DLC1在乳腺癌组织和细胞中的表达及相关性
目的:研究果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer ofzeste homolog 2,EZH2)和肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1,DLC1)在乳腺癌组织及细胞中的表达水平,并探讨二者之间的相互关系.方法:首先采用免疫组织化学法检测120例乳腺癌组织及63例癌旁正常组织中EZH2和DLC1蛋白的表达情况;随后分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测20例乳腺癌以及癌旁正常组织,以及乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞及正常乳腺上皮细胞HBL100中EZH2和DLC1 mRNA及蛋白的表达水平.通过脂质体法将特异性针对EZH2基因的siRNA转入MDA-MB231细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测MDA-MB231细胞中EZH2及DLC1 mRNA和蛋白表达水平的变化.结果:免疫组织化学检测结果提示,EZH2蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于其在癌旁正常组织中的阳性表达率(P=0.000),DLC1蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率明显低于其在癌旁正常组织中的阳性表达率(P=0.008).乳腺癌组织中EZH2和DLC1蛋白的阳性表达率与肿瘤大小及淋巴结转移密切相关(P值均＜ 0.05).实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测结果显示,EZH2 mRNA和蛋白在乳腺癌组织和乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞中的表达水平均明显高于癌旁正常组织和正常乳腺上皮细胞HBL100 (P值均＜0.01),而DLC1 mRNA和蛋白的表达水平均明显低于癌旁正常组织和正常乳腺上皮细胞HBL100 (P值均＜0.01).沉默MDA-MB231细胞中EZH2基因表达后,DLC1 mRNA及蛋白的表达水平均明显上调(P值均＜ 0.05).结论:EZH2与DLC1在乳腺癌中的表达呈负相关,抑制EZH2的表达可以恢复DLC1的表达,提示EZH2可能通过抑制DLC1的表达促进肿瘤的发生和发展.
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抗药基因MGMT在人脑星形细胞瘤组织中的表达
6位甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGM T)主要功能是转移并接受DNA双链中鸟嘌呤O6位上异常的烷基,使受损的DNA恢复正常[1].我们检测了MGMT基因在人脑胶质瘤的表达情况,探讨MGMT表达对人脑星形细胞瘤的意义.
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雷公藤甲素对乳腺癌细胞P53、P73基因甲基化的影响以及对细胞增殖的抑制作用
目的 研究雷公藤甲素( triptolide,TP)对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖的影响及其与P53、P73基因表达和甲基化状态的关系.方法 用不同浓度(10、20、40 ng/ml) TP处理MCF-7细胞,采用MTT法检测TP对MCF-7细胞增殖的作用；RT-PCR检测MCF-7细胞甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表达；甲基特异性PCR检测TP对MCF-7细胞P53、P73基因甲基化的影响；蛋白质印迹分析检测MCF-7细胞中P53、P73蛋白的表达.结果 TP剂量依赖性地抑制MCF-7细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01),其半数抑制浓度(IC50)约为20 ng/ml,高浓度(40 ng/ml)时抑制率达(70.1±3.52)％.TP可明显抑制MCF-7细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表达(P＜0.05,P＜0.01).TP处理MCF-7细胞后P53启动子区的甲基化降低,TP(20 ng/ml)处理后P53 mRNA的表达升高,而在高浓度(40 ng/ml) TP作用下表达明显上调(P＜0.01)；TP处理MCF-7细胞后P73基因启动子区的甲基化则明显降低,且TP( 10 ng/ml)处理后P73 mRNA的表达亦明显增强(P＜0.05),并呈剂量依赖性.蛋白质印迹分析检测TP(20 ng/ml)处理MCF-7细胞后,P53、P73蛋白的表达均增强.结论 TP可通过抑制甲基转移酶括性和抑制P53特别是P73基因启动子区甲基化促进P53、P73的表达,并且能够抑制MCF-7细胞的增殖.
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慢病毒介导的靶向沉默HPV16E7-shRNA对SiHa细胞DNA甲基转移酶表达的影响
目的 探讨慢病毒携带的靶向人乳头瘤病毒16(HPV16)E7基因的短发夹干扰RNA(shRNA)对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞中4种甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)表达水平的影响.方法 构建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重组质粒,用BLOCK-iTTM Lentiviral RNAi Expression System试剂盒进行慢病毒包装,分别转染293T细胞48、72 h后收集病毒上清液.分别用含靶向HPV 16 E7-shRNA重组质粒的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(shRNA组)、含空白质粒(即不含靶向HPV16 E7-shRNA序列)的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(阴性对照组)、完全培养基(空白对照组)培养SiHa细胞.感染0、48、96 h后,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3组SiHa细胞中HPV16 E7和4种甲基转移酶mRNA的表达,Western印迹检测4种甲基转移酶的蛋白表达.结果 感染0h时,shRNA组、阴性对照组、空白对照组SiHa细胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(均P＞0.05);感染48、96 h时,3组细胞间HPV16 E7和4种DNMT mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(均P＜0.05).shRNA组HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表达水平在48 h时的沉默效率分别为71.13％、50.53％、13.72％、46.27％和17.92％,96 h时分别为83.50％、74.2％、47.8％、64.7％和48.9％;而阴性对照组和空白对照组各时间点表达水平差异无统计学意义(均P＞0.05).慢病毒感染48、96 h时,3组细胞间上述4种DNMT蛋白表达量差异有统计学意义(均P＜0.01).shRNA组4种DNMT蛋白表达水平随感染时间的延长而逐渐下降,感染48 h时DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白表达抑制率分别为84％、37.2％、59.8％、49.3％,96 h时分别为73.1％、68.7％,55.5％、65.5％.结论 靶向沉默HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞E7基因能够干扰DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA及蛋白的表达.
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瘢痕疙瘩及其成纤维细胞p16基因甲基化状态和相关基因表达研究
目的 探讨瘢痕疙瘩中成纤维细胞p16基因甲基化在其发生发展中的作用.方法 分离、培养来自瘢痕疙瘩皮损和健康人皮肤原代成纤维细胞;免疫组化法检测瘢痕疙瘩皮损中p16表达情况;实时荧光定量PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中p16、DNA甲基转移酶mRNA表达;亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP法)检测瘢痕疙瘩皮损及培养的原代成纤维细胞p16基因甲基化状态.结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞中p16基因mRNA表达低于健康人皮肤成纤维细胞(相对表达量2-△△Ct分别为0.64±0.18和1.92±0.23,t=10.54,P＜0.05).瘢痕疙瘩成纤维细胞三种DNA甲基转移酶(DNMT)基因mRNA表达水平(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B分别为2.58±0.23、4.87±0.46、1.57±0.12)与健康人皮肤成纤维细胞(分别为1.13±0.21、2.38±0.32、0.57±0.16)相比均存在高表达,两组比较,t值分别为11.22、10.81、12.45,均P＜0.05.瘢痕疙瘩组织和瘢痕疙瘩原代成纤维细胞内p16启动子区甲基化程度分别为1.81％±0.46％和3.15％±0.94％,明显高于健康人皮肤组织(0.90％±0.35％,F=14.23,P＜0.01)和原代成纤维细胞(0.17％±0.29％,F=37.62,P＜0.01).结论 瘢痕疙瘩成纤维细胞中p16基因甲基化及其低表达与瘢痕疙瘩的失控性生长可能相关,DNA甲基转移酶在其发病中可能起一定作用.
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SLE患者DNA甲基转移酶1单核苷酸多态性分析
目的 比较SLE患者DNMT1基因的单核苷酸多态性,探讨DNMT表达异常在SLE发病中的意义.方法 选取SLE患者11例,正常人对照12例.外周血单一核细胞DNA提取后应用PCR结合测序方法检测并分析DNMT1基因的部分外显子exon1～exon7及相应的内含子的单核苷酸多态性,并做进一步基因型分析.结果 SLE患者中DNMT1外显子7与8之间内含子7存在21397位T→C(胸腺嘧啶→胞嘧啶)的改变,CC的纯合子较正常人对照组明显增加(X~2=4.10,P＜0.05).结论 SLE患者DNMTl基因存在单核苷酸多态性,可能是DNMTI基因表达异常的遗传成分之一.
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成人急性淋巴细胞白血病巯嘌呤甲基转移酶基因多态性研究
目的研究我国成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者及健康汉族人群巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因多态性.方法从78例成人ALL患者和154例健康汉族人外周血提取白细胞基因组DNA,采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)和PCR结合限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术对TPMT*2、TPMT*3A、TPMT*3B和TPMT*3C的等位基因频率进行分析.结果在成人ALL患者和健康汉族人中仅检测到6例TPMT*3C杂合子,没有检到TPMT*2、TPMT*3A和TPMT*3B.成人ALL患者TPMT总的突变型等位基因频率(1.28%)与健康汉族人群(1.30%)相近.结论TPMT*3C可能是中国成人ALL和健康汉族人群主要的突变型等位基因,预先检测TPMT基因型对使用巯嘌呤类药物治疗的中国成人ALL患者有临床裨益.
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HRM技术检测炎症性肠病患者TPMT的基因多态性
目的 应用HRM技术检测炎症性肠病(IBD)患者TPMT基因多态性,进而探索IBD患者TPMT基因型与硫唑嘌呤(AZA)致骨髓抑制的关系.方法 采用聚合酶链反应-高分辨熔解曲线(PCR-HRM)与Sanger法序列测定相结合的方法,对82例IBD患者和53名健康志愿者TPMT基因第7、10外显子进行检测.结果 IBD患者中TPMT*1/*3C杂合子4例,健康对照者中TPMT*1/*3C杂合子2例.未检测出TPMT*3A和TPMT*3B型突变.IBD患者4例出现骨髓抑制的患者中,1例是TPMT*1/*3C杂合子;其余3例为TPMT野生型.结论 TPMT*3C(A719G)基因突变在中国的IBD患者中较TPMT*3A(G460A/A719G)、TPMT*3B(G460A)发生率高,而存在此基因突变的IBD患者对硫唑嘌呤不能耐受,导致骨髓抑制.然而TPMT基因突变只能解释部分AZA治疗IBD导致骨髓抑制的病例.
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肾移植受者红细胞硫嘌呤甲基转移酶活性与硫唑嘌呤所致不良反应的关系
目的 探讨肾移植受者红细胞中硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性与硫唑嘌呤导致的血液毒性和肝脏毒件等不良反应的关系.方法 应用高效液相色谱法(HPLC)测定98例肾移植受者红细胞中TPMT活性,分析TPMT活性在服用硫唑嘌呤期间发生不良反应与未发生不良反应受者中的差异.结果 98例受者红细胞中TPMT活性范围在15.00～65.02 U,＜24 U者占8.2%(8例),24～50 U者占77.5%(76例),＞50 U者占14.3%(14例),未发现有TPMT活性缺乏者.76例未发生不良反应组的受者TPMT活性范围在19.21～61.54 U,平均(40.48±9.66)U.7例发生血液毒性的受者,其TPMT活性范围在15.00～39.16 U,平均(27.80±10.70)U,明显低于未发牛不良反应组,差异有统计学意义(Z=-2.655,P＜0.05);15例发生肝脏毒性的受者,其TPMT活性范围在20.74～65.02 U,平均(36.47±10.90)U,与未发生不良反应组比较,差异无统计学意义(Z=-1.658,P＞0.05).结论 硫唑嘌呤所致的血液毒性与TPMT活性水平低下有关,活性低下的肾移植受者应避免使用硫唑嘌呤或减少起始剂量,从而减轻或避免该药产生的严重毒副作用.而硫唑嘌呤所致的肝脏毒性是否与TPMT活性较高相关,还需进一步研究证实.
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DNMT1和HDAC1在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义
目的：研究DNA甲基转移酶（DNMT）1和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）1在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织及上皮性卵巢癌组织中的表达，分析二者与卵巢癌组织多种临床病理参数关系及相关性。方法运用免疫组织化学方法检测15例正常卵巢组织、20例良性卵巢肿瘤组织及30例上皮性卵巢癌组织中DNMT1和HDAC1的表达情况。分析二者的表达与卵巢癌临床病理参数的关系，以及2种蛋白在卵巢癌组织中表达的相关性。结果上皮性卵巢癌组织中DNMT1和 HDAC1的表达高于正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织，差异有统计学意义（犘＜0．05）；卵巢癌组织中DNMT1和 HDAC1的表达与是否绝经和病理类型无关，而与组织学分级、临床分期有关；DNMT1和 HDAC1二者在卵巢癌组织中的表达呈正相关。结论 DNMT1和HDAC1的高表达在卵巢癌发生、发展中有重要作用。二者具有协同作用是卵巢癌发生发展的主要原因，可以为卵巢癌的早期筛查提供理论依据。
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肝细胞与肝癌细胞中磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2表达及活性的比较
目的比较研究原代培养的大鼠肝细胞与大鼠肝癌细胞内磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2(phosphatidylethanolamine N-methyltransferase 2,PEMT2)表达水平和活性,了解PEMT2与细胞生长、增殖的关系.方法利用免疫细胞化学及蛋白质免疫印迹方法观察PEMT2蛋白的表达,以[3H-CH3]SAM 放射性同位素掺入法测定了PEMT2的活性,流式细胞仪分析了两种细胞的细胞周期中DNA的含量变化,并进行了比较.结果大鼠原代培养肝细胞内具有明显的PEMT2表达,且活性高,而大鼠肝癌细胞内PEMT2的表达很少,活性较低.细胞周期显示正常肝细胞的G1期明显高于肝癌细胞,S期则明显低于肝癌细胞.结论肝细胞PEMT2的表达与其生长增殖密切相关.
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DNA甲基转移酶在宫颈癌组织中的表达及其与HPV的相关性分析
目的 探讨5种DNA甲基转移酶(DNMTs)在宫颈癌组织中的表达情况及其与高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的关系.方法 应用荧光定量PCR、Western blotting、免疫组化检测40例官颈癌组织、对应癌旁组织及20例正常宫颈组织中DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT31的表达情况,应用质谱法检测HPV感染情况.结果 宫颈癌组织中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3l的阳性表达率分别为90.0％、85.0％、70.0％、80.0％,在癌旁组织内的阳性表达率分别为87.5％、85.0％、72.5％、77.5％,均明显高于正常宫颈组织内的阳性表达率(分别为25.0％、15.0％、20.0％和30.0％),而DNMT2在宫颈癌和癌旁组织中阳性表达率仅为12.5％和17.5％,明显低于正常官颈组织(约85.0％),且DNMT1、DNMT3a、DNMT3b与HPV阳性呈显著正相关(r值分别为0.709、0.538和0.536,P＜0.05).结论 宫颈癌组织中DNMT的表达谱发生明显改变,且HPV高危亚型感染与DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达升高密切相关.
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组蛋白甲基化:肿瘤治疗的新靶标
暴露在核小体表面的N-末端尾部可发生共价修饰,这些共价修饰可以影响组蛋白和DNA结合的紧密程度,从而影响DNA的表达,被称之为"组蛋白密码".近来大量的研究表明,组蛋白末端的赖氨酸和精氨酸残基的异常甲基化与肿瘤的发生、发展、预后有着密切的关系.应用组蛋白甲基转移酶/去甲基转移酶抑制剂调控组蛋白的甲基化水平,能够抑制肿瘤细胞的生长并诱导凋亡.
