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腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达
目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),增强VSMC中gax基因的表达.方法采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax),经293细胞扩增,纯化制备高滴度病毒转染液;以病毒转染液常规转染VSMC后,应用RT-PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达.结果流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV-gax转染VSMC后,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高,转染后24小时即可达80%左右,高水平的表达可维持5天以上; AdCMV-gax转染前,PDGF-BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用,AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.结论腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC,并且表达为蛋白质.这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响.
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Ad-Gax转染对缺氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的影响
目的 观察Gax基因转染对缺氧性肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)凋亡及其相关基因表达的影响.方法 腺病毒介导Gax转染体外原代培养的PASMCs.透射电镜观察细胞凋亡形态;原位细胞凋亡检测法观察Ad-Gax转染前后在常氧和缺氧处理2 h、6 h、12 h、24 h、48 h大鼠PASMCs凋亡情况;免疫细胞化学法测PASMCs Bcl-2、Bax蛋白表达.结果 透射电镜观察到Ad-Gax转染后PASMCs产生凋亡现象.未转染缺氧刺激前后,均无或可见极少量的阳性细胞;Ad-Gax转染后,如无缺氧刺激,也无或仅可见少量的阳性细胞,予缺氧刺激后,阳性细胞显著增多,尤其在转染后24～48 h更明显.转染组常氧、缺氧2 h、6 h、12 h、24 h、48 h细胞凋亡百分率均显著高于未转染组(P＜0.01).Ad-Gax转染前,与常氧时比较,缺氧刺激PASMCs后,Bax蛋白表达略为升高但无统计学意义;而Bcl-2蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).Ad-Gax转染PASMCs后,缺氧刺激使Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.01),Bax蛋白表达显著增高(P＜0.01).转染组细胞凋亡率与Bcl-2/Bax比值呈负相关(r=-0.53,P＜0.01).结论 Ad-Gax转染可诱导缺氧性PASMCs凋亡,其机制可能是通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的表达,尤其是通过降低Bcl-2/Bax比值实现的.
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Gax基因双向调节低氧性肺动脉内皮细胞增殖及影响HIF-1α基因表达的研究
目的 观察Gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞(PAECs)增殖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达的影响,为进一步研究Gax基因调节低氧性肺动脉高压(HPH)的作用与机制奠定基础.方法 取大鼠肺动脉,用酶消化法获取PAECs并进行原代培养;PAECs分4组:未转染常氧对照组(常氧组)、未转染低氧处理组(低氧组)、Ad-βGal转染再行低氧处理组(Ad-βGal+低氧组)、Ad-Gax转染再行低氧处理组(Ad-Gax+低氧组).分别在常氧(21％ O2)和低氧(2.5％ O2)1 h、3h、6h和12 h各时相点,采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测PAECs增殖;使用RT-PCR和Weatem blot方法分别检测PAECs中HIF-1αmRNA和蛋白表达水平.结果 ①PAECs的3H-TdR掺入量:与常氧组同时相点比较,低氧组和Ad-βGal+低氧组均显著升高(P均＜0.01),在低氧6h达大值;Ad-Gax+低氧组与常氧组同时相点比较均显著升高(P均＜0.01),但与低氧组比较却均明显降低(P＜0.01、P＜0.05),到低氧6h降幅大;②在低氧处理6h,与常氧组比较,低氧组和Ad-βGal+低氧组HIF-1α mRNA和蛋白表达均明显上调;与低氧组或Ad-βGal+低氧组比较,Ad-Gax+低氧组HIF-1α mRNA和蛋白表达皆显著下调,差异有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01).低氧早期内皮细胞异常增殖加速,而此时增强Gax基因的表达可抑制细胞的异常增殖;随着低氧时间的不断延长,细胞增殖受到抑制,而此时增强内皮细胞中Gax基因表达却又促进细胞增殖,以此来维持细胞的数量.结论 Gax基因对维持内皮细胞数量的稳态具有双向调节作用.增强Gax基因的表达能下调低氧诱导的HIF-1α mRNA和蛋白表达,这可能与Gax基因抑制低氧性内皮细胞异常增殖的机制相关.
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同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定
目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定.方法:采用两步CaCl2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶Bst Ⅸ和Pac Ⅰ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax.利用GFP的表达鉴定Ad-Gax.结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010 pfu/L.结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础.
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缺氧诱导因子1α与Gax基因对自体静脉移植术后内膜过度增生的调控机制
自体静脉移植术后内膜过度增生是影响术后效果的重要原因,缺氧诱导因子1α(HIF-1α)与Gax基因可以抑制自体静脉移植术后内膜过度增生,可作为治疗移植静脉再狭窄的一个新手段,HIF-1α通过调控血管内皮生长因子的表达,对恢复血管内皮细胞的结构和功能起着重要的调节作用,而Gax基因通过影响细胞周期和诱导细胞凋亡两条途径来调节血管平滑肌细胞的增殖.
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Gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞增殖与ET-1、VEGF和eNOS蛋白表达的影响
目的 观察Gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞(PAEC)增殖及内皮素(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响.方法 取大鼠肺动脉,用酶消化法获取PAEC并进行原代培养;分4组:未转染常氧对照组(常氧组)、未转染低氧处理组(低氧组)、Ad-βGal转染再行低氧处理对照组(Ad-βGal+低氧组)、Ad-Gax转染再行低氧处理组(Ad-Gax+低氧组).分别在常氧(21％ O2)和低氧(2.5％O2)6 h后,采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测PAECs增殖和培养上清液中ET-1、VEGF和eNOS蛋白水平.结果 与常氧组比较,低氧组和Ad-βGal+低氧组PAEC的3H-TdR掺入量均显著升高(P＜0.01);与低氧组比较,Ad-Gax+低氧组PAEC的3 H-TdR掺入量均明显降低(P＜0.01).与常氧组比较,低氧组和Ad-βGal+低氧组PAEC上清中的VEGF和ET-1水平均显著升高(P＜0.01),而eNOS含量明显降低(P＜0.01);与低氧组比较,Ad-Gax+低氧组PAEC上清中VEGF和ET-1水平均明显降低(P＜0.01),而eNOS水平显著升高(P＜0.01).结论 低氧诱导PAEC异常增殖加速,而此时增强Gax基因表达可抑制细胞异常增殖;低氧上调PAEC中VEGF和ET-1含量,下调eNOS含量,而增强Gax表达可以逆转这种现象.
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gax基因对血管平滑肌细胞中p21基因表达的影响
目的:研究p21基因在gax基因抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中的作用. 方法: 以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax和p21表达的变化;应用RT-PCR检测p21 mRNA表达的变化;应用3H标记的胸腺嘧啶核苷( 3H-TdR)掺入试验观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响. 结果:①AdCMV-gax转染前,血小板衍化生长因子BB(PDGF-BB)下调gax蛋白的表达,AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax蛋白的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC的p21表达比未转染组显著增高.③AdCMV-gax转染使VSMC的3H-TdR掺入量均较未转染组显著降低. 结论:gax基因抑制VSMC增殖的机制与其增强p21表达有关.
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gax基因转染对血管平滑肌细胞中基质金属蛋白酶2和骨桥蛋白转录的影响
目的:探讨腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC)后,VSMC中基质金属蛋白酶2(MMP2)和骨桥蛋白基因转录的变化.方法:以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测Gax蛋白表达的变化,以RT-PCR技术检测VSMC中MMP2mRNA和骨桥蛋白mRNA的变化.结果:AdCMV-gax转染后:(1)VSMC中Gax蛋白的表达比转染前显著增高(P<0.01);(2)VSMC中MMP2mRNA和骨桥蛋白mRNA比未转染组均显著降低(P<0.05).结论:增强gax基因表达可抑制MMP2和骨桥蛋白的转录.
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低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞中Gax基因表达及细胞增殖的影响
目的探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因表达及细胞增殖的影响.方法以RT-PCR法、免疫细胞化学法和Western blot法测定经低氧处理后的大鼠PASMCs中Gax mRNA和蛋白表达.3H-TdR掺入法观察低氧处理后PASMCs增殖情况.结果RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot检测证实低氧(2.5%O2)处理后的PASMCs中Gax mRNA和蛋白的表达逐渐降低;与常氧组比较,低氧组Gax mRNA和蛋白的表达显著下降.3H-TdR掺入法测定结果示PASMCs3 H-TdR掺入量在低氧6 h开始增加,随着低氧时间延长,3H-TdR掺入量逐渐增加,至低氧24 h时3H-TdR掺入量高.结论低氧可下调大鼠PASMCs中Gax mRNA和蛋白的表达并诱导PASMCs增殖,提示Gax基因在低氧性PASMCs增殖过程中可能起着重要作用.
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腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响
目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化.方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's小室观察gax基因表达增强对VSMC迁移的影响.结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调Gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2 ng/ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由36.42%显著降低至22.83%(P＜0.05),随着PDGF-BB浓度的升高,gax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC迁移数较未转染组显著减少.结论增强gax基因表达,可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移.
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腺病毒介导gax基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖
目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC增殖的变化. 方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化;应用四唑盐(MTT)比色试验、3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入试验和流式细胞仪检测观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响.结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调Gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2 ng/ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由36.42%显著降低至22.83%(P<0.05),随着PDGF-BB浓度的升高,gax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC的MTT吸光度值和3H-TdR掺入量均较未转染组显著降低,G0-G1期的VSMC比例较未转染组显著增高(P<0.01),G2-M期和S期细胞比例显著降低(P<0.01). 结论增强gax基因表达可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC增殖.
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Gax基因对细胞增殖的负性调控及机制
生长终止特异性同源盒基因(growth arrest-specific homeobox gene,Gax 基因)是近年来发现的负性调控细胞增殖的一种转录因子.本文介绍Gax基因的发现和结构特征,详细阐述Gax抑制血管平滑肌细胞、血管内皮细胞及癌细胞增殖等生物学效应及其机制,展望Gax治疗疾病的潜在应用前景.
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Ad-Gax转染诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及其机制
背景与目的 细胞凋亡与肺癌的发生发展密切相关,诱导肺癌细胞凋亡是肺癌治疗的一大策略.本研究探讨生长终止特异性同源盒Gax(growth arrest-specific homeobox)基因转染对人肺腺癌A549细胞凋亡及凋亡相关基因蛋白表达的影响.方法 腺病毒介导Gax基因(adenovirus expressing Gax cDNA,Ad-Gax)转染A549细胞.以透射电镜观察细胞凋亡形态;原位细胞凋亡检测法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick endlabeling,TUNEL)观察转染前后A549细胞凋亡变化;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞化学法测定细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达.结果 透射电镜观察到Ad-Gax转染后A549细胞凋亡现象明显增强.无Ad-Gax转染时,无或仅见极少量的TUNEL染色阳性细胞;Ad-Gax转染后,TUNEL染色阳性细胞显著增多,尤其在转染后24小时更明显.Ad-Gax转染后12 h、24 h和48 h细胞凋亡率分别为12.57%、17.29%和15.03%,与未转染组(0.25%)比较有显著性差异(x2值分别为7.357、11.126、9.943,P值均小于0.01).未转染组、转染12 h、24 h和48 h组Bcl-2蛋白平均积分光密度值(AOD)分别是2.02±0.07、1.79±0.02、1.25±0.51和1.21±0.24,转染组Bcl-2蛋白AOD随转染时间的延长逐渐降低,与未转染组相比呈显著性差异(t值分别为6.651、7.089、7.438,P值均小于0.01).未转染组、转染12 h、24 h和48 h组Bax蛋白AOD分别是3.12±0.42、4.49±0.61、4.24±0.37和3.95±0.43,转染组Bax蛋白AOD升高,与未转染组相比差异显著(t值分别为7.469、7.287、6.473,P值均小于0.01).转染组A549细胞凋亡率与Bcl-2/Bax比值呈负相关关系(r=-0.49,P＜0.01).结论 Ad-Gax转染可诱导A549细胞凋亡,其机制可能是通过下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白的表达,尤其是通过降低Bcl-2/Bax比值实现的.
关键词： gax基因 人肺腺癌A549细胞 凋亡 凋亡相关基因 -
Gax基因转染对A549细胞增殖及原癌基因表达的影响
背景与目的在中国肺癌居各种恶性肿瘤之首位,寻求肺癌的基因疗法已成为人们努力的方向.本研究拟探讨生长终止特异性同源盒基因(growth arrest-specific homeobox,Gax)对A549细胞系增殖及其原癌基因c-fos、c-jun mRNA表达的影响.方法以腺病毒介导Gax基因(adenoviral transduction of the Gax gene,Ad-Gax)转染A549细胞,RT-PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中Gax mRNA和蛋白表达;RT-PCR测定转染前后细胞中c-fos、c-jun mRNA表达变化;MTT法检测Gax基因转染对A549细胞生长的抑制作用,计算24、48、72 h细胞抑制率.结果RT-PCR和免疫细胞化学证实Gax基因转染A549细胞后Gax能稳定表达,未转染组未发现Gax表达;RT-PCR证实转染组A549细胞中c-fos、c-jun mRNA比未转染组显著降低(t=7.755,P＜0.01;t=5.938,P＜0.01);MTT法检测显示转染组A549细胞在24、48、72h的抑制率分别是(47.35±5.36)%、(54.96±1.78)%、(65.39±5.11)%,随时间逐渐升高与未转染组同时间比较有显著性差异(x2=7.152、9.431、12.847,P＜0.01).结论Gax基因转染能抑制A549细胞的增殖,其分子机制可能与Gax下调c-fos、c-jun的表达有关.
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Gax基因过表达对低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及周期的作用
目的:探讨生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因转染在低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中过表达及其对细胞增殖和周期的作用.方法:腺病毒介导Gax基因(adenovirus expressing Gax cDNA,Ad-Gax)转染体外培养的PASMCs.在常氧(21% O2)和低氧(2.5% O2)2、6、12、24和48 h条件下,利用RT-PCR和免疫细胞化学法分别测定转染前后PASMCs中Gax mRNA和蛋白表达;用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞术检测各组PASMCs增殖和周期.结果:RT-PCR和免疫细胞化学法证实Ad-Gax转染后PASMCs中Gax能稳定过表达;MTT比色试验结果显示,未转染组常氧和低氧2、6、12、24和48 h时PASMCs吸光度值分别为0.38±0.02、0.44±0.11、0.48±0.05、0.59±0.07、0.67±0.03和0.75±0.18,低氧组比常氧组明显增加(P＜0.05);而转染组各时相吸光度值分别为0.17±0.04、0.15±0.02、 0.24±0.11、0.33±0.13、0.31±0.03和0.37±0.09,低氧组比未转染组同时相点组明显降低(P＜0.05、0.01).流式细胞仪检测结果表明,Ad-Gax转染对常氧条件下PASMCs的周期没有显著影响,但可使低氧处理后PASMCs的G0/G1比例较未转染组显著增高、S+G2/M比例显著降低(P＜0.01);结论:Gax基因过表达能够抑制低氧性PASMCs的增殖.
