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六种血清型沙门菌PFGE指纹图谱研究
目的 用PFGE方法绘制不同血清型的沙门菌指纹图谱,并且进行同源性分析.方法 首先将从食品中检测出6中不同血清型的沙门菌菌株制成琼脂模块,再提取菌株的DNA,用限制性内切酶Xba Ⅰ对细菌DNA进行酶切,用Bio-rad CHEP MAPPER绘制出菌株的PFGE指纹图谱,后用Quantity OneTM图像分析软件进行同源性分析.结果 所有的菌株的同源性均用相似性系数(矩阵)和百分数表示.结论 用PFGE绘制菌株的指纹图再用Quantity OneTM图像分析软件进行分析,是确定食源性致病菌沙门菌同源性的一种有效的方法.
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维生素A和锌营养水平与小鼠胚胎HOX基因表达的相关性
目的研究不同维生素A、锌营养水平与小鼠胚胎HOX C4(3.5)基因表达的相关关系.方法昆明种雌鼠随机均分为3组:缺乏组喂饲无维生素A和低锌饲料;补充组:开始时饲料同缺乏组,母鼠受孕第7天改为富含维生素A和锌的饲料;正常组自始至终喂饲正常饲料.动物喂养至出现明显维生素A、锌缺乏症状后进行交配.受孕第12天取出相应数量孕鼠处死,取样测生化指标;取胚胎测定HOX C4(3.5)基因mRNA表达量.结果缺乏组、补充组和正常组母鼠血清维生素A水平均值分别为0.44 μmol/L、1.03 μmol/L和1.40 μm ol/ L,股骨锌含量均值分别为124.3 mg/kg、152.1 mg/kg和193.8 mg/kg,差异有显著性. 胚胎HOX C4(3.5)基因表达也显著升高.结论小鼠机体维生素A 和锌营养水平与胎鼠HOX C4(3.5)基因表达呈高度正相关,各项指标相关系数为0.78～0 .99.
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RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响
目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达；转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率；转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)％比(88.52±9.24)％、(86.75±7.38)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)％比(7.98±5.52)％;(55.62±1.18)％比(8.27±3.45)％;(66.30±1.26)％比(8.63±3.58)％;均P＜0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)％比(9.82±0.69)％、(10.14±0.96)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P＞0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.
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Id蛋白与肿瘤关系的研究进展
DNA结合和分化抑制剂(inhibitor of DNA binding and differentiation,Id)是螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)转录因子亚家族的一个成员,4个Id成员与碱性螺旋-环-螺旋(basic hehx-loop-helix,bHLH)蛋白形成二聚体,但缺乏碱性DNA结合结构域,因此,Id-bHLH异源二聚体不能结合DNA,故Id蛋白是bHLH转录因子的显性负调节子.Id蛋白也能与非HLH蛋白相互作用,如Rb、Ets、同源盒家族转录因子Pax、小鼠Id相关蛋白1(MIDA-1),并抑制其活性.现已证实Id在肿瘤细胞中通常过表达,并且与肿瘤细胞增生、分化、凋亡、侵袭等密切相关.
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Gsh2基因沉默对胰腺癌SW1990细胞Hedgehog通路成员表达的影响
目的 探讨Gsh2基因沉默对胰腺癌SW1990细胞Hedgehog (Hh)通路关键成员Shh、Gli1基因表达的影响.方法 构建3个靶向Gsh2的shRNA(Gsh2-shRNA),应用双酶切法插入质粒pLKO.1puro,以未插入shRNA的空载质粒作为阴性对照.重组质粒经扩增后,抽提质粒DNA,通过双酶切后电泳分离和测序鉴定.然后转染胰腺癌SW1990细胞,应用实时RT-PCR法检测转染细胞Gsh2 mRNA表达,筛选沉默效果佳的插入Gsh2-shRNA重组质粒.选择佳重组质粒转染胰腺癌SW1990细胞,采用实时RT-PCR法和蛋白质印迹法检测转染细胞的Gsh2、Shh、Gli1 mRNA和蛋白表达量.结果 3个重组质粒经双酶切电泳及测序鉴定后证实插入的Gsh2-shRNA片段正确,符合预期.以转染空载质粒细胞的mRNA表达量为1,重组质粒Gsh2-shRNA-1、Gsh2-shRNA-2、Gsh2-shRNA-3转染细胞后Gsh2mRNA表达量分别为0.41 ±0.02、0.22 ±0.043、0.53 ±0.03,以Gsh2-shRNA-2的沉默效应佳.以转染空载质粒细胞的mRNA或蛋白表达量为1,转染Gsh2-shRNA-2细胞的Gsh2、Shh、Gli1 mRNA相对表达量分别为0.12 ±0.02、0.97 ±0.13、0.19 ±0.03;蛋白表达量为0.55±0.12、0.74 ±0.06、0.53 ±0.09.转染Gsh2-shRNA-2细胞的Gsh2、Gli1 mRNA及蛋白表达量较转染空载质粒细胞显著下调,差异均有统计学意义(P值均＜0.01),而Shh mRNA及蛋白表达量的差异无统计学意义.结论 Gsh2基因沉默可抑制胰腺癌SW1990细胞Hh通路成员Gli1的表达,而不影响Shh基因的表达.
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胰腺十二指肠同源框-1基因真核表达载体的构建和转染
目的应用阳离子脂质体介导含有大鼠胰腺十二指肠同源框-1(PDX-1)基因的真核表达载体转染胰腺导管上皮细胞. 方法利用逆转录聚合酶链反应技术克隆大鼠PDX-1基因,酶切后插入经相同酶切及磷酸化处理的含绿色荧光蛋白(GFP)的空白载体pEGFP-C2,构成重组质粒,再进行HindⅢ、BglⅡ双酶切筛选、鉴定并测序;阳离子脂质体介导转染后,荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率从而对转染条件进行优化. 结果限制性酶切分析证实重组后的载体成功载入PDX-1基因;克隆的目的片断经序列测定与Genebank公布的序列一致;转染条件优化后重组载体在胰腺导管上皮细胞中有效表达. 结论在国内首次成功克隆了大鼠PDX-1基因,并构建了含有PDX-1基因的真核表达载体;通过优化转染条件提高了转染效率, 为将表达PDX-1基因的胰腺导管上皮细胞作为组织工程的种子细胞提供了实验依据.
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重组exendin-4对遗传性胰岛素抵抗糖尿病大鼠糖耐量的影响
目的研究重组exendin-4对遗传性胰岛素抵抗糖尿病(OLETF)大鼠血糖和胰岛素分泌的影响以及与转录因子胰十二指肠同源盒因子(pdx-1)mRNA表达的关系.方法将雄性OLETF大鼠随机分成对照组及EX4 A、B、C组.对照组腹腔内注射生理盐水,EX4 A、B、C组分别腹腔内注射5、20、100μg/kg的exendin-4,每日1次.1周后行口服葡萄糖耐量试验及胰岛素释放试验.半定量RT-PCR检测胰腺pdx-1 mRNA表达.结果EX4注射组糖耐量改善,空腹、120 min血糖及高峰血糖均明显降低,胰岛素分泌明显增高,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B细胞功能指数(HOMA-B)EX4各组分别为98.18±29.14、73.74±22.19、135.86±58.62,与对照组(36.88±15.14)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).而胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(ISI)EX4 A、B组与对照组比较,差异无统计学意义.pdx-1 mRNA EX4各组分别是0.40±0.15、0.56±0.15和0.65±0.17,均明显高于对照组的0.24±0.13(P＜0.05).结论exendin-4能促进OLETF大鼠胰岛素分泌,改善大鼠糖耐量及B细胞功能,并上调pdx-1 mRNA的表达.
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胃黏膜肠化生中CDX2及SOX2的表达及其甲基化状态
DNA的异常甲基化修饰在多种肿瘤的发生中起重要作用.尾型同源盒转录因子2(caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)是肠上皮特异性转录因子,仅在成人肠道中表达而在胃中不表达.与之相反,性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2)仅在胃及胃以上的消化道上皮中表达.胃黏膜的肠化生(intestinal metaplasia,IM)被认为是肠型胃癌的癌前病变.本研究检测了胃黏膜不同程度IM标本中CDX2和SOX2启动子区甲基化的情况,并探讨其与基因表达的关系.
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同源盒基因与肿瘤
同源盒(HOX)基因广泛存在于原核、真核生物、动物、植物和人,具有高度保守性,在细胞功能上具有关键作用.因此,HOX基因在肿瘤中的分子机制是研究的一大热点.本节结合近几年的文献,就HOX基因在肿瘤发生中可能的分子机制作一综述.
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散在型多指(趾)畸形中HOXD13基因分析
目的 通过对中国福建地区汉族散在的多指(趾)、短指畸形患者中HOXD13基因的分析,了解其是否存在基因突变.方法 采集2012年12月至2013年4月在福建医科大学附属第一医院整形外科接受治疗的多指(趾)和短指畸形患者6例,以及其父母、祖父母、外祖父母和本科室医务人员在内的正常志愿者40例外周血标本,常规提取基因组DNA;采用聚合酶链反应、琼脂糖凝胶电泳方法及DNA序列分析法,对6例散在型患者及40例正常志愿者HOXD13基因进行分析.结果 6例患者均无家族史,其中5例HOXD13基因第1外显子发生c.291C ＞T(p.A60A)杂合同义突变,1例短指患者及40例志愿者均未发现有HOXD13基因突变.结论 中国汉族散在型多指(趾)畸形的出现,可能与HOXD13基因的高频杂合同义突变c.291C＞T(p.A60A)有关.
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SD大鼠MSX-2基因真核表达载体的构建与功能鉴定
目的 构建SD大鼠颅颌面发育相关基因MSX-2与PcDNA 3.1融合的高效真核表达载体,为研究MSX-2基因的功能奠定基础.方法 根据SD大鼠MSX-2基因的核苷酸序列,设计并合成引物,采用PCR技术,扩增编码MSX-2基因,TA克隆到PMD18-T载体上,再亚克隆到真核表达载体PcDNA 3.1的BamHI和Xhol位点.对该重组体进行酶切鉴定,以及测序验证.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot检测重组MSX-2基因的RNA和蛋白表达情况.结果 重组真核表达载体PcDNA3.1-MSX-2经PCR扩增、酶切鉴定均显示有476bp左右的特异性基因片断,证明MSX-2基因正向插入真核表达载体中;碱基序列的测定证明重组质粒中含有SD大鼠的MSX-2基因序列.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot可检测到重组MSX-2基因的mRNA和蛋白的特异表达.结论 成功构建SD大鼠MSX-2基因的高效真核表达载体,为进一步研究MSX-2基因的功能及基因治疗奠定了基础.
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胎儿生长受限的遗传学机制研究进展
临床确诊胎儿生长受限时胎儿多已发育成型或者已经娩出,寻找一种能够准确对其进行早期预测的方法将会给临床带来极大帮助.遗传学机制在胎儿生长受限的发生发展中起着重要作用,检测双亲及胎儿的遗传学改变可为宫内胎儿生长发育状况和出生后疾病风险度的评估研究提供重要线索.本综述将详细阐述胎儿生长受限可能的遗传学机制的新进展.
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HOXA10基因与子宫内膜异位症发病关系的研究进展
子宫内膜异位症(endometriosis,EM)在育龄期妇女中的发病率高达10%～15%,且近年来的发病率呈升高的趋势.EM为良性病变,但具有与恶性肿瘤相似的生物学行为,严重影响着妇女的身心健康和生育功能,目前发病机制仍不清楚,"在位内膜决定论"是较公认的发病学说<'[1]>.随着对EM基因表达及其调控的深入研究,有学者发现,EM可能是一种表观遗传性疾病,同源盒(homeobox,HOX)基因HOXA10的异常表达及异常甲基化模式与其发病及不孕密切相关.本文将就HOXA10基因与EM的研究进展做一综述.
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Csx/Nkx2.5基因在胚胎心脏的表达及在先天性心脏病中的突变检测
目的了解Csx/Nkx 2.5基因在胚胎心脏发育过程中的表达情况及在先天性心脏病(先心病)患者中的突变情况.方法采用免疫组化方法检测Csx/Nkx 2.5基因表达,采用PCRSSCP-银染和DNA测序技术检测Csx/Nkx 2.5基因突变.结果Csx/Nkx 2.5基因在心房、小梁网中高表达.16周后心房表达趋于稳定,小梁网的表达稍有下降.在心室的表达早期较弱,逐渐升高,13至16周增加幅度大,16周后表达趋于稳定.心外膜不表达.在126例先心病患儿、16例先心病胎儿和30例正常人中发现编码21位氨基酸密码子的第3位碱基的三种多态性:A、G、A/G.结论Csx/Nkx 2.5基因在胚胎心脏发育过程中的表达有严格的时空规律,说明该基因在心脏发育过程中发挥重要作用.本研究中,无论是散发性或家族性先心病病例,均未检测到与先心病有关的突变.
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HOX基因参与造血调控的研究进展
同源盒(Homeobox,Hox)基因编码一类转录因子,参与造血细胞的发育调控,其结构与功能的改变影响着造血细胞的增殖分化,本文就此综述如下.
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乳腺肿瘤组织中同源异型盒基因BP1mRNA表达的定量检测
目的:探讨乳腺肿瘤组织中同源异型盒基因BP 1 mRNA的表达水平及其临床病理意义.方法:采用实时荧光定量RT PCR技术检测82例乳腺肿瘤组织中BP 1 mRNA的拷贝数,并进行相关统计分析.结果:82例乳腺肿瘤标本中,有56例呈BP1阳性表达,阳性率为68.29%.不同病理组织分级的乳腺癌标本中BP 1基因的初始拷贝数分别为(1.84±0.08)×105、(1.31±0.78)×105和(5.41±0.90)×104拷贝/μgRNA,随着组织学分级的升高,BP 1基因mRNA表达量呈下降趋势,P＝0.0037.结论:BP 1基因在一定程度上参与了乳腺癌的发生和发展,并可能成为乳腺癌早期诊断及治疗的新分子标志物和重要的研究靶点.
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靶向同源盒A10特异性干扰性小RNA序列的筛选及功能鉴定
目的 筛选有效干扰同源盒( HOX) A10基因表达的特异性干扰性小RNA( siRNA)序列并鉴定其功能,为利用RNA干扰技术靶向HOXA10防治肿瘤提供实验依据.方法 设计合成3对针对HOXA10基因不同位点的siRNA序列,应用阳离子脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞,采用反转录-聚合酶链反应( RT-PCR)检测HOXA10 mRNA表达,以HOXA10与β-actin灰度比值(ODR)表示相对表达水平.筛选出抑制HOXA10效果佳的siRNA序列,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)和流式细胞术分别检测该siRNA干扰HOXA10后对A549细胞增殖和凋亡的影响.结果 3对siRNA均能抑制HOXA10的表达,其中siRNA1抑制HOXA10 mRNA的表达为明显,ODR为(20.190±1.698) ％;siRNA1对A549细胞的增殖抑制率可达(69.793±2.092)％;siRNA转染后细胞凋亡率显著提高,siRNA1诱导A549凋亡作用为明显,凋亡率为( 29.593±2.670)％.结论 筛选出的siRNA1序列可有效沉默HOXA10基因的表达,并能有效抑制A549细胞增殖、促进其凋亡.
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靶向同源盒基因A7的小干扰RNA筛选及功能鉴定
目的 体外设计、合成及筛选高效沉默同源盒基因A7 (HOXA7)表达的小干扰RNA(siRNA),并研究沉默HOXA7对人类肺腺癌细胞株LETP-a-2增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成三对针对HOXA7基因的siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)和一对阴性对照(siRNAnc),分别用阳离子脂质体介导转染LETP-a-2细胞.实验分6组:细胞对照组、脂质体对照组、siRNAnc组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA 3组,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测各组HOXA7 mRNA和蛋白表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术分别检测沉默HOXA7后LETP-a-2细胞增殖、凋亡情况.结果 siRNA成功转染LETP-a-2细胞,三对siRNA均能有效沉默HOXA7表达,其中以siRNA2沉默HOXA7的效果佳,在mRNA和蛋白水平沉默率分别为(57.344±4.743)％和(52.219±0.550)％；三对siRNA沉默HOXA7后均能抑制LETP-a-2细胞增殖并促进其凋亡,其中以siRNA2组效果明显,48 h细胞增殖抑制率可达(48.144±4.992)％,凋亡率达(26.613±0.612)％.结论 筛选出高效沉默HOXA7的siRNA2能有效抑制LETP-a-2细胞增殖并促进其凋亡,提示HOXA7可能成为肿瘤基因治疗的新靶点.
关键词： 基因 同源盒 RNA干扰 肺腺癌LETP-a-2细胞 -
同源盒基因Pax-6在鼠晶状体上皮细胞中的表达分析
目的观察体外培养的小鼠晶状体上皮细胞(LEC)内同源盒基因Pax-6的表达,探讨维持晶状体上皮细胞特性的基因因素.方法体外培养小鼠原代、传1代、传2代及传3代LEC,利用免疫组织化学法和免疫印迹法,检测细胞中Pax-6基因的蛋白表达情况,利用逆转录聚合酶链反应法检测细胞中Pax-6基因的mRNA表达情况.结果在原代、传1代及传2代培养的LEC中均可检测到Pax-6基因蛋白和 mRNA的阳性表达,传3代培养的LEC中仅检测到Pax-6基因蛋白的微弱表达.阴性对照均未见Pax-6基因的表达.结论体外培养的小鼠LEC中具有Pax-6基因,该基因的正常表达是维持LEC特性的必要条件.
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同源盒基因Msx-1、Msx-2和Dlx-2在小鼠下颌第一磨牙发育阶段的表达
目的观察同源盒基因Msx-1、Msx-2和Dlx-2 mRNA在小鼠下颌第一磨牙发育阶段的表达.方法取胎龄E11～E18和新生P1～P3小鼠的头或下颌,制备5 μm连续冠状切片.体外转录合成地高辛标记的Msx-1、Msx-2和Dlx-2 RNA探针.原位杂交后观察Msx-1、Msx-2和Dlx-2在小鼠下颌第一磨牙中的表达.结果在牙胚发育过程中,Msx-1转录信号始终只在间质细胞中观察到,在上皮细胞中呈阴性.Msx-2和Dlx-2在牙源性上皮和间质中均表达,在磨牙发育起始期二者表达相似,但在随后的牙胚发育过程中,它们出现不同的表达特征.结论牙胚发育过程中,Msx-1、Msx-2和Dlx-2有不同的表达特征,可能共同参与调控上皮和间质间的相互作用.
