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西沙必利对大鼠失血性休克复苏后肠屏障功能障碍的影响
目的:观察西沙必利对大鼠失血性休克复苏后的肠屏障功能的影响.方法:108只Wistar大鼠随机分为假休克(ss)组、失血性休克复苏(Hs)组和失血性休克复苏后西沙必利治疗(HSC)组,染料法测定肠道传输,同位素标记生物微球法测量肠道血流量,应用荧光素异硫氢酸葡聚糖(FITC-D)和辣根过氧化酶(HRP)Ⅱ型两种分子探针测定小肠通透性,同时观察肠腔内细菌繁殖和腹腔内脏器细菌移位.结果:HSC组与HS组相比,肠道传输增快,肠道血流量增加,肠腔中细菌量减少,空肠和回肠通透性降低,2h肠系膜淋巴结、4h肝中细菌量明显降低(P<0.05或P<0.01).结论:失血性休克复苏后,早期应用西沙必利,可促进肠道传输,有助于改善肠道血液循环,从而改善肠屏障功能.
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七种常见宠物二级抗体的制备和HRP标记
目的 制备兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为宠物血清学检测系统的建立提供工具.方法 利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A 或protein G 亲和层析的方法进一步纯化宠物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗宠物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗宠物的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性.结果 纯化了狗、家猫、豚鼠、金仓鼠、松鼠、花鼠和龙猫7种宠物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗这7种宠物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗7种宠物的二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～15000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性.结论 成功制备了HRP标记的兔抗7种中国家庭中常见宠物的二级抗体,为宠物血清学检测体系的建立提供了工具.
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九种重要经济动物二级抗体的制备和HRP标记
目的 制备兔抗9种重要经济动物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为经济动物血清学检测系统的建立提供工具.方法 利用饱和硫酸铵沉淀粗纯抗体后,再利用protein A或protein G 亲和层析的方法进一步纯化动物血清IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法纯化兔抗经济动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性.结果 纯化了家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～15000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性.结论 成功制备了HRP标记的兔抗9种重要经济动物的二级抗体,为经济动物血清学检测体系的建立提供了工具.
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应用催化信号放大法检测Bcl-2、Bcl-XL蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其意义
在石蜡切片的免疫组化染色中,常因被检测的抗原遭到甲醛等常用固定剂的破坏而影响到免疫组化染色效果,为此,人们一方面通过对石蜡切片进行酶消化或热处理使免疫组化检测敏感性提高,另一方面通过提高检测系统的敏感性来克服这一限制.催化信号放大(catalyzed signal amplification, CSA)法是一种新颖的,此传统的ABC、LSAB、SP法更敏感的检测系统,在我们早期的研究中称其为生物素标记酪氨法(biotinatilyted tyramine, BT法)[1].该方法的特点是利用生物素化酪氨分子结合到HRP(辣根过氧化酶)的催化位点上来达到增强信号的目的.近来,我们利用该方法的高敏感性检测了一系列凋亡相关蛋白在各类非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表达和分布.Bcl-2和Bcl-XL均为Bcl-2家族成员,是目前比较公认的抗凋亡蛋白,在细胞凋亡过程中起着重要的调控作用.我们应用CSA法检测Bcl-2和Bcl-XL蛋白在NHL中的表达,以探讨其在NHL发生和发展机制中的作用.
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毛细管内均相辣根过氧化物酶(HRP)与核酸杂交偶联HRP催化化学发光比较研究
目的:了解毛细管内核酸偶联和游离辣根过氧化物酶(HRP)催化化学发光差异.方法:不同浓度HRP和经核酸杂交固定于毛细管内壁HRP催化化学发光反应.结果:①游离HRP催化化学发光线性检测范围窄(2.7×10<'-5>-1.3×10<'-6>mg/ml,R<'2>>0.96),下限为1.0×10<'-7>mg/ml;②2.0×10<'14>-2.0×10<'6>copies/ml的5μl单链DNA杂交后,1.0-10min时DNA浓度M对数(1g<'M>)与化学发光I值线性相关(R<'2>>0.99),且大于阴性I值平均数+3倍标准偏差(s.d);③5.0×10<'11>-5.0×10<'6>copies/ml的5μl PCR产物杂交后,10min内PCR产物对数1g<'M>与I值线性相关(R<'2>>0.97),且大于阴性I值平均数+3倍标准偏差(s.d).4.0-7.0min内1g<'M>与I值的R<'2>>0.99,3次平行检测标准偏差<5.0%.结论:毛细管内核酸杂交的HRP催化化学发光检测线性范围宽、灵敏度高、底物用量少,有望用于临床核酸分子杂交检测.
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血-脑屏障研究进展
一八八五年,德国人Paul Ehrlich第一次证明脑血管的通透性不同于非神性血管.其后研究者们相继认识到血和脑之间有屏障存在,谓之血-脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB).自植物酶辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase,HRP)问世以来,以其作为BBB通透性示踪剂使BBB研究取得很大进展.
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胆汁泡蛋白促成核活性及其在不同人群含量分布的研究
我们利用超速离心法结合电泳区带定位法提纯了一种相对分子质量为33.5×103的泡蛋白，通过本研究探讨泡蛋白的促成核活性并观察不同人群的含量分布。 一、 材料和方法 1. 材料：相对分子质量为33.5×103泡蛋白（本院已制备）。胆固醇、弗氏佐剂、金黄色葡萄球菌A蛋白交联的辣根过氧化酶（HRP-SPA）等购自Sigma公司。偏光显微镜（Olympus公司），离子交换柱DEAE-Sephadex A50（Pharmacia分装），12×8孔酶标板及酶标读数仪（华美公司）。新西兰大白兔由复旦大学医学院实验动物中心提供。 2. 泡蛋白促成核活性检测： 参照Kibe等［1］的方法制备Small模拟胆汁，总脂浓度100 g/L，胆固醇饱和度1.2，胆盐/磷脂4.4；采用朱雷明等［2］的方法配制综合模拟胆汁，含3.80 mmol/L未结合胆红素。分别取40 μg泡蛋白加入1 ml Small模拟胆汁及综合模拟胆汁作为实验组，对照组用人体白蛋白（n=6）。成核时间（NT）的测定根据Holan等［3］的方法，并计算成核活性。 3. 泡蛋白抗血清的制备及效价鉴定： 将0.4 ml弗氏完全佐剂在新西兰大白兔双侧足蹼均匀多点注射激发免疫反应，2周后取50 μg泡蛋白混匀乳化液多点免疫，第5、8周行加强免疫，10周后采血、收集抗血清；经DEAE-Sephadex A50纯化IgG；双向免疫扩散法检测效价。
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兼具酶催化活性的布洛芬人工抗原的制备与应用初探
目的:制备以辣根过氧化物酶为载体蛋白的布洛芬人工抗原,并快速测定其偶联比、酶催化活性,进而应用于尿液中布洛芬的检测.方法:利用活化酯法将布洛芬与载体蛋白辣根过氧化物酶偶联,制备布洛芬的人工抗原,采用生物质谱法完成人工抗原偶联比的测定,并对酶催化活性进行了验证.结果:布洛芬人工抗原偶联比为5,辣根过氧化物酶的催化活性未受到任何影响,可以应用于尿液中布洛芬的检测.结论:以酶作为载体蛋白的人工抗原兼具免疫原和酶催化的双重性质,为免疫分析提供了一种新的简单可行方法.
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肺腺癌肿瘤相关巨噬细胞的免疫组织化学双标染色方法优化
目的 通过对现有的免疫组织化学双重标记方法(双标)的改进,探索一种稳定且易于辨认的显色方法,便于在普通光学显微镜下观察肺腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况.方法 改进的免疫组织化学双标染色分别使用二抗链接的碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶作为底物显色酶,底物分别选用固红(AP-Red)和二氨基联苯胺(DAB),在显微镜下次序控制双标显色,观察肺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况.结果 免疫组织化学双重标记中第一标记AP-Red的红色与第二标记DAB的棕黄色反差大,背景低,易于分辨.两种颜色标记的同一部位呈现砖红色,易于表示双标部位.统计显示在肺腺癌组织标本中,以M2型肿瘤相关巨噬细胞为主,约占80%.结论 改进后的显色系统建立了简便、可靠的免疫组织化学双重标记新方法.标记结果可以清晰稳定显示肿瘤相关巨噬细胞在肺腺癌组织中分布情况,便于进一步研究其在肺癌发生、发展中的作用.
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siRNA沉默Twist1增强吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡的研究
目的 通过抑制Twist1来观察胰腺癌细胞对吉西他滨化疗敏感性的变化.方法 通过靶向人Twist1基因小干扰RNA(siRNA)抑制Twist1的表达;用Western法检测Twist1的表达、Annexin V/PI染色和流式细胞术检测吉西他滨诱导的细胞凋亡;通过Western blot检测caspase及可能的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和线粒体途径;用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内活性氧和线粒体膜的电位.结果 Twist1沉默显著增加了Panc-1细胞对吉西他滨的敏感性,JNK/线粒体的途径被激活,Twist1 siRNA诱导线粒体膜去极化同时显著上调线粒体分裂相关蛋白Fis1并降低融合相关蛋白Mfn1的表达.Twist1 siRNA提高了细胞内活性氧(ROS)的水平,与吉西他滨联合治疗进一步增加ROS.结论 siRNA介导的Twist1沉默在PANC-1细胞对吉西他滨化疗耐受中扮演了关键角色,Twist1沉默可能作为胰腺癌治疗的一种有效方法.
