首页 > 文献资料
-
PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial
目的: 建立一种快速、特异、敏感的分子生物学诊断方法对腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH及ial进行检测.方法:分别应用常规培养生化血清学鉴定方法、普通PCR、巢氏PCR(nested-PCR)方法, 对71例腹泻患者粪标本进行检测. 痢疾杆菌致病基因ipaH及ial的扩增产物经电泳分离.结果: 在71例腹泻患者粪标本中, 常规培养生化血清学鉴定方法分离出福氏痢疾杆菌24例, 宋内痢疾杆菌23例, 志贺痢疾杆菌1例, 沙门菌23例. 采用普通PCR法检测痢疾杆菌粪标本48例, ipaH基因均阳性(100%);ial基因阳性34例(70.8%), 余14例为阴性. 对该14例粪标本进而采用巢氏PCR法进行ial基因扩增, 其中12份标本阳性. 48例痢疾杆菌粪标本中46例ipaH和ial基因为双阳性(46/48). 沙门菌粪标本23例中ipaH及ial基因表达均为阴性. 以上两种方法的诊断一致性检验Kappa = 0.937, 差异有统计学意义(P<0.05). 71例腹泻患者粪标本采用PCR和巢氏PCR法扩增得到的ipaH和ial基因特异片段与基因库中发表的标准菌株序列比较, 一致性为100%.结论:建立了快速诊断腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial的PCR检测方法, 具有简便、快速、特异和敏感的特点.
-
PCR检测与细菌培养方法在细菌性痢疾监测中的应用比较
目的 通过与PCR检测比较,确定细菌培养方法对细菌性痢疾疾病负担的低估程度.方法 从2002年细菌性痢疾监测研究获得的10 105份腹泻标本中随机选取337份,采用针对ipaH基因的PCR方法检测其志贺菌感染,并同传统细菌培养方法进行比较.结果 337份腹泻标本中检测到ipaH基因212份,检出率为62.9%;而粪便培养阳性为39份,检出率为11.6%(P＜0.001).Logistic回归分析显示影响PCR检出的因素依次为细菌培养结果(OR=15.5;95% CI:2.0-119.0),具有发热症状(OR=2.8;95% CI:1.2-6.2),菌痢流行季节的腹泻(OR=2.4;95% CI:1.4-4.3)及女性病例(OR=1.8;95% CI:1.1-3.0).结论 与PCR检测相比,传统细菌培养方法使得菌痢的发病率在相当大的程度上被低估.
-
肠侵袭性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用
目的 为建立肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)的DPO-PCR快速检测方法.方法 本研究以EIEC ipaH基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸(DPO)引物,建立了EIEC DPO-PCR检测方法.结果 退火温度范围在47℃～67℃内都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与EIEC的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为1.17×102 cfu/mL.利用该检测方法对采集的230份样品进行检测,共计检出3份EIEC阳性样品,与国标法(GB 4789.6-2003)检测结果一致,显示了良好的实用性.结论 该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性.
-
实时荧光PCR检测志贺菌特异基因ipaH
目的:建立一种灵敏、快速检测志贺菌的实时荧光PCR方法,研究志贺菌在腹泻病人中的感染情况.方法:针对志贺菌特异性基因ipaH设计引物、探针,应用培养分离的志贺菌进行验证,同时检测360例临床标本并与培养法进行对照.结果:应用实时荧光PCR方法,10株志贺菌检测结果均为阳性,10株非志贺菌结果均为阴性;检测灵敏度达到4 cfu/test.360例临床标本中实时荧光PCR方法检测出29例阳性,培养法检测出12例阳性.结论:实时荧光PCR法检测志贺菌具有灵敏度高、快速方便的特点,可用于检测腹泻病人志贺菌感染.
-
环介导等温扩增技术快速检测志贺菌
目的 建立能快速、特异检测志贺菌的环介导等温扩增技术.方法 针对志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)设计4条引物,建立环介导等温扩增检测方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,与PCR法进行比较,并进行了猪肉模拟样品和实际样品检测.结果 环介导等温扩增技术特异性高.灵敏度高于PCR法,对细菌纯培养物的检测灵敏度为101 cfu/ml,对猪肉模拟样品检测灵敏度102 cfu/g.而PCR法的灵敏度分别为102 cfu/ml和104 cfu/g.采用环介导等温扩增技术在34份实际样品中检测出5份ipaH基因阳性.结论 初步建立能快速、灵敏、特异地检测志贺菌的环介导等温扩增技术.其在食源性疾病监测和应急检测中具有重大意义,值得推广应用.
-
萧山区2007年-2010年宋内志贺菌的病原分子生物学特征
目的:了解2007年-2010年萧山区分离的宋内志贺菌的病原分子生物学特征,并分析其流行规律.方法:对130株宋内志贺菌进行生化反应和血清分型鉴定,利用PCR方法检测侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因.使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行同源性分型分析,并使用BioNumerics进行聚类分析以确定菌株间的亲缘关系.结果:130株菌株均为宋内志贺菌,均具有ipaH基因.PFGE分型将菌株分成90个型别,相似性72.4％～97.9％,主要分为A、B、C三个克隆群.结论:PFGE分型结果表明2007年-2010年萧山区的宋内志贺菌来源具有多样性,A、B、C三个克隆群的菌株占据主导地位,应引起重视.
-
LAMP技术应用于志贺菌及侵袭性大肠埃希菌ipaH基因快速检测
目的:建立一种适合基层实验室快速检测志贺菌及侵袭性大肠埃希菌(EIEC)的实验方法.方法:根据志贺菌及EIEC共同含有的侵袭性质粒抗原ipaH基因序列设计4条引物,应用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal am-plification)方法,分别对8株背景明确的不同血清型志贺菌标准株、34株志贺菌地方分离株、1株EIEC实验标准株、7株大肠埃希菌本室保存标准株、3株大肠埃希菌暴发株、10株其他肠道实验对照株进行检测,验证该方法的特异性及低检测限,通过肉眼目测与电泳检测比较结果.结果:本方法中共计42株志贺菌、1株EIEC及1株44147大肠埃希菌,经用LAMP方法检测,均为绿色并电泳有相应阶梯状条带为阳性结果,而9株其他大肠埃希菌及10株其他肠道实验对照株均呈橙色并电泳无相应阶梯状条带为阴性结果.至于1株44147大肠埃希菌为何也检测出ipaH基因,我们怀疑该菌株要么是EIEC中的一种,要么是在长期进化过程中从别处获得该基因,这尚待今后做进一步探讨.本方法具有较好的特异性,其低检测限为53 cfu/反应,自然光下通过肉眼即可判断结果,从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右.应用本方法对24份不同临床病人样本进行实际考核,3份痰液、1份胸积水、2份粪便及18份尿样经检测ipaH基因均为阴性,该结果与分离培养/普通PCR检测结果相符.结论:本次建立的LAMP方法,能快速、特异地检测志贺菌/EIEC,较适合基层实验室应用.
-
福氏志贺菌4C亚型生物学特性研究及ipaH基因检测
目的:了解福氏志贺菌4C亚型(F4c)的生物学特性及毒力情况.方法:以生化反应、噬菌体裂解试验、血清分型鉴定菌种;按K-B法进行药敏试验;采用PCR技术检测ipaH基因;同时观察对动物的侵袭力.结果:该菌型具有志贺菌属的基本特点,靛基质等试验传代后有变化,能被Ent噬菌体溶原化而出现型抗原变异现象,ipaH基因和动物侵袭力试验阳性,对四环素、TMP等耐药.结论:F4c是一个少见的血清型,生物学特性与F2a相近,一定条件下能出现型抗原和生化特性变异.
-
LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较
目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较.方法 以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)为靶序列,设计6条特异性引物(内引物、外引物和环引物各2条),优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较.结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带.检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101 cfu/ml、6.8× 101 cfu/ml,PCR法分别为5.3× 102 cfu/ml和6.8× 102 cfu/ml.结论 利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段.
-
细菌培养与聚合酶链反应（PCR）检测在细菌性痢疾检测中的应用分析
目的：探讨细菌培养与聚合酶链反应（PCR）检测在细菌性痢疾检测中的应用效果。方法选择该院收治的800例腹泻患者，分别采用细菌培养与PCR法技术检测志贺菌。分析两种方法的检出率及患者一般情况对检出率的影响。结果 PCR检出率显著高于细菌培养，差异有统计学意义（P＜0．05）。PCR平均循环数在培养阴性、非脓血便、年龄大于5岁的病例中高，平均循环数在培养阳性、脓血便、年龄小于5岁病例中低。结论针对ipa H基因的PC R检测有利于准确评估人群中痢疾疾病。
