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磁性阳离子高分子脂质体结合野生型p53投递系统的构建
目的 用合成的磁性阳离子高分子脂质体与野生型p53 (WTp53)基因质粒结合,构建靶向纳米载体投递系统,为进一步行静脉内皮细胞转染奠定基础.方法 应用大肠杆菌重组质粒扩增法扩增WTp53质粒DNA,合成的磁性阳离子高分子脂质体为羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐/胆固醇(OQCMC/Chol)包覆油溶性Fe3O4的载体粒子.在不同的pH值及不同的WTp53质粒DNA和载体粒子质量比的条件下,将WTp53质粒DNA与OQCMC/Chol超微磁性载体粒子进行混合,并分别进行DNA结合实验和沉淀实验.观察电泳结果,并用SPSS 13.0统计软件进行数据分析.在DNaseⅠ模仿体内酶的环境下,将其加入制备好的超微载体投递系统中,电泳后观察投递系统对DNA的保护作用.应用透析系统模拟体内环境,观察超微投递系统载体与基因分离情况,并利用紫外分光光度计测量超微载体投递系统累积缓释曲线.结果 应用透射电镜观察OQCMC/Chol超微磁性载体粒子和WTp53结合后的投递粒子.在pH 7条件下,wTp53质粒DNA和载体粒子质量比为1∶0.6,p53质粒DNA与OQCMC/Chol超微磁性载体粒子经过直接静电作用几乎100％结合,并证实该投递系统对DNA具有较好的保护作用.超微载体投递系统在7～12h左右有明显的突释波峰,到第54小时以后,超微载体释放浓度变化缓慢,并可持续释放9d以上.结论 成功构建磁性阳离子高分子脂质体结合WTp53投递系统,将为进一步行细胞转染奠定可靠的基础,并为构建血管内靶向定位基因投递新方法和新技术提供可靠理论依据.
关键词： 壳聚糖季铵盐 磁性阳离子高分子脂质体 野生型p53 -
肝癌特异性多靶点慢病毒的体外实验研究
目的 研究anti-AFP scFv(抗AFP单链抗体)介导的慢病毒(lentivirus)载体对表达AFP肝癌细胞特异性基因转移以及双靶点基因系统对肝癌细胞生长的抑制作用.方法 用脂质体Lipofectamine 2000将目的基因转移载体、包装结构及包膜结构质粒共转染包装细胞293T,大量收集病毒上清,过滤、浓缩.用携带AFP-WtP53-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R融合基因的慢病毒体外转染培养的肝癌细胞HEP3B.荧光显微镜下观察感染效果,用PCR、Western blotting鉴定WtP53、miR30-shRNA-IGF1R在细胞中的整合转录结果.CCK8观察重组慢病毒对肝癌细胞生长的影响,TUNEL检测细胞凋亡.结果 成功构建anti-AFP scFv介导的慢病毒；滴度为4.58×109 PFU/ml;PCR、Western blotting均显示阳性条带,证明anti-AFP scFv介导的慢病毒在靶细胞中整合且转录表达.重组慢病毒对肝癌细胞的生长有明显的抑制作用且有促进细胞凋亡的作用.结论 anti-AFPscFv介导的慢病毒可将双靶点基因系统高效靶向性转染、杀伤肝癌细胞.
关键词： 肝癌细胞 人胰岛素样生长因子1类受体 野生型p53 慢病毒 -
p53和p16基因过表达对人肺腺癌细胞株H1299生物学功能影响实验研究
目的 p53及p16基因是肺腺癌的两种重要的驱动基因,但其在肺腺癌发生发展中的作用尚不明确.本研究探讨外源性突变型p53(p53mut)、野生型p53(p53wt)和p16基因过表达对人肺腺癌细胞株H1299生物学功能的影响.方法 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p53mut、pIRES2-EGFP-p53wt和pIRES2-EGFP-p16,将H1299细胞分为空白对照组、阴性对照组和转染组(p53mut转染组、p53wt转染组、p53wt和p16联合转染组),空白对照组只加转染试剂,阴性对照组转染空载体,转染组转染含目的基因的过表达载体.蛋白质印迹法验证质粒载体转染效果,细胞增殖检测试剂盒8 (cell counting kit 8,CCK8)、划痕试验、Transwell小室侵袭实验分别检测转染前后细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化,流式细胞术检测转染前后细胞周期和凋亡的变化.结果 真核表达载体质粒经测序鉴定证明构建正确.蛋白质印迹法证实,空白对照组及阴性对照组的H1299细胞不表达p53和p16蛋白.转染组的H1299细胞成功过表达目的基因(p53mut、p53wt及p16).CCK8实验提示,空白对照组与阴性对照组在细胞增殖能力上差异无统计学意义(P＞0.05),p53mut转染组细胞增殖能力增强,p53wt转染组及p53wt、p16共转染组细胞的增殖能力减弱,且以后者下降更为明显,P＜0.001.划痕试验提示,空白对照组与阴性对照组细胞在迁移能力差异无统计学意义(P＞0.05),p53mut转染组细胞迁移能力增强,p53wt转染组及p53wt、p16共转染组细胞迁移能力减弱,且以后者下降更为显著,P＜0.001.Transwell小室侵袭实验提示,空白对照组与阴性对照组细胞的侵袭能力差异无统计学意义(P＞0.05),p53mut转染组细胞侵袭能力增强,p53wt转染组及p53wt、p16共转染组细胞侵袭能力减弱,且以后者减弱更为明显,P＜0.001.流式细胞术检测提示,空白对照组与阴性对照组G1期细胞比例差异无统计学意义(P＞0.05),而p53wt转染组及p53wt、p16共转染组出现了G1期阻滞,且以后者更显著,P＜0.001.流式细胞术检测提示,空白对照组与阴性对照组细胞在凋亡比率方面差异无统计学意义(P＞0.05),而p53mut转染组细胞凋亡受抑制,p53wt和p16共转染组细胞凋亡增加,且以后者凋亡更多,P＜0.001.结论 过表达p53mut基因在H1299细胞中有显著的促癌作用;过表达p53wt基因在H1299细胞中有显著的抑癌作用,当p53wt联合p16共同过表达时,其抑癌作用进一步增强.
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E1A基因对鼻咽癌细胞放射敏感性影响的初步实验研究
目的 探讨E1A基因对鼻咽癌细胞放射增敏作用及相关机制.从而为提高鼻咽癌放射治疗疗效提供实验依据.方法 经腺病毒介导,将E1A基因导入人鼻咽癌细胞系CNE2细胞.经RT-PCR鉴定,获得含E1A的阳性克隆.将未转染的CNE2细胞、转染对照空载体Ad-B-gal的CNE2细胞和转染Ad-E1A的CNE2细胞用6 MV X线分别照射0、2、4、6、 8 Gy后进行成克隆分析并绘制细胞存活曲线,计算放射增敏比.流式细胞术和RT-PCR检测转染前后的细胞周期分布以及wtp53表达情况.结果 转染后阳性克隆细胞RT-PCR结果说明E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达.细胞存活曲线结果显示转染E1A的CNE2细胞放射增敏比分别为1.37(D_0值比)、1.95(D_q值比)、1.46(SF_2值比).未转染及空载体转染后的CNE2细胞照射后细胞存活曲线分析结果显示无差异,D0D_qSF2值分别为1.57 Gy及1.53 Gy、1.82 Gy及1.78 Gy、0.89及0.82.流式细胞术显示细胞周期出现G_2+M期阻滞,RT-PCR结果显示E1A基因能提高wtp53的表达.结论 E1A基因能显著提高人鼻咽癌细胞的放射敏感性,其作用机制可能与E1A基因提高叭p53基因的表达和引起G2+M期阻滞有关.
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热休克蛋白70对X射线照射下wtp53蛋白的影响
目的 探讨反义热休克蛋白70 (hsc70) 在X射线照射下对野生型p53(wtp53)的影响。方法 利用脂质体方法将本室构建的反义hsc70真核表达重组质粒pXAhsc70转染wtp53的MCF-7乳腺癌细胞，PCR证实外源DNA存在。Western blot 检测hsc70蛋白下降程度。X射线照射转染细胞后，检测wtp53蛋白的表达情况及半衰期变化。结果 转染重组质粒的细胞中hsc70蛋白下降53%；不同剂量X射线照射下，反义hsc70的存在能够提高wtp53的表达；4?Gy相同剂量照射后，转染反义hsc70重组质粒的细胞中wtp53的半衰期延长。结论 反义hsc70能够上调wtp53的表达、稳定X射线照射下的wtp53蛋白并延长其半衰期；推测hsc70可能参与了wtp53的稳定和降解过程。
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野生型P53及其调控基因与子宫颈癌发病机制
P53基因是迄今发现与人类肿瘤的发生相关性高的抑癌基因,在人类癌症中发生突变的频率高达50%.在子宫颈癌组织中表达则降低,且以野生型(wt)为主.P53第4外显子72密码的基因多态性与子宫颈癌发病机制密切相关.wtP53蛋白在子宫颈癌细胞中半衰期短,功能易失活,具有调节细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长的功能.其功能失活与多种基因,如E6,E7,MDM2和STAT3等基因的降解作用有关.
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bFGF对兔视网膜缺血再灌注损伤中wt-p53蛋白表达的影响
目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对兔视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)后野生型p53(wt-p53)蛋白表达的影响.方法 56只健康大耳白兔随机分为正常对照组(8只)与损伤组(48只);损伤组同一大耳白兔在RIRI后左眼玻璃体腔注入生理盐水(损伤对照组),右眼玻璃体腔注入bFGF(损伤治疗组);损伤组按照RIRI后处死时间不同,分为6组(每组8只),并对各组大耳白兔取视网膜做切片并进行免疫组化分析.结果 正常对照组视网膜组织基本无wt-p53蛋白表达,损伤对照组与损伤治疗组均于RIRI后6 h发现wt-p53蛋白表达,24 h达到高峰,之后随着RIRI时间的延长逐渐减弱,两组RIRI后6、12、24、48 h wt-p53蛋白阳性表达比较差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论 wt-p53蛋白的规律表达说明视网膜细胞凋亡与RIRI密切相关,而bFGF在抑制视网膜细胞凋亡及维持视网膜神经节细胞存活再生有重要作用.
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首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒
目的:选择只感染分裂细胞的鼠源性反转录病毒载体pLHCX作为载体,构建由hTERT启动子驱动目的基因表达的载体,实现靶向性表达.方法:实验于2005-09/2006-05在江西省分子医学重点实验室完成.①实验材料:含319 bp hTERT核心启动子的phTERT-luc质粒由军事科学院郑晓飞博士惠赠,反转录病毒载体质粒pLHCX由浙江大学朱永良教授惠赠,含1.8 kb wtp53基因的质粒pCMV-Neo-BamH-wtp53由第二军医大学朱明华教授惠赠,增强型绿色荧光蛋白报告质粒pEGFP-N2和pEGFP-C1由本室保存,对照反转录病毒质粒pLHCX-CMV-EGFP前期构建完成;端粒酶阳性人大肠癌细胞SW620、HT-29,人宫颈癌细胞Hela,人肺癌细胞A549和端粒酶阴性人胚肺成纤维细胞MRC-5由本室保存.②实验方法:利用定向克隆的方法分别构建由hTERT启动子驱动EGFP的质粒pLHCX-hTERT-EGFP和驱动wtp53表达的质粒pLHCX-hTERT-wtp53.以质粒pLHCX-hTERT-EGFP和课题组前期构建的质粒pLHCX-CMV-EGFP转染端粒酶阳性的人大肠癌细胞株SW620和HT-29、人宫颈癌细胞株Hela和人肺癌细胞株A549以及端粒酶阴性的正常人肺胚成纤维细胞MRC-5.③实验评估:通过流式细胞仪测定分析转染效率,证实pLHCX-hTERT-EGFP在不同细胞中的表达特异性.运用RT-PCR和Western Blot分别检测p53 mRNA和p53蛋白在p53突变的大肠癌细胞株SW620中表达.利用MTT检测质粒pLHCX-hTERT-wtp53对不同细胞的增殖抑制情况和流式细胞术检测不同细胞的凋亡情况.结果:①通过酶切证实重组质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53构建成功,并通过将pLHCX-hTERT-EGFP转染SW620细胞观察到绿色荧光蛋白的表达,测序证实构建质粒中包含完整的wtp53片段.②流式细胞术检测结果证实质粒pLHCX-hTERT-EGFP处理后端粒酶阳性的SW620、Hela和A549内增强型绿色荧光蛋白表达强度明显强于端粒酶阴性的MRC-5(P < 0.05),而pLHCX-CMV-EGFP在端粒阳性和阴性的上述细胞中表达无明显差异(P > 0.05).③RT-PCR和Western Blot分别证实了p53mRNA和p53蛋白表达.④MTT检测到重组质粒对端粒酶阳性的大肠癌细胞有明显的增殖抑制作用,而对端粒酶阴性的MRC-5细胞生长无明显影响(P < 0.05).⑤流式细胞检测观察到重组质粒引起端粒酶阳性的大肠癌细胞凋亡要明显强于端粒酶阴性的MRC-5细胞(P < 0.05).结论:构建的反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-EGFP在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达;重组反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-wtp53转染后对端粒酶阳性的大肠癌细胞有特异性的影响作用.
关键词： 人端粒酶逆转录酶基因启动子 野生型p53 基因治疗 -
前列腺癌组织中TGF-β1和wt-p53基因mRNA的表达及意义
目的 探讨前列腺癌(PCa)组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、野生型p53(wt-p53)基因的表达及意义.方法 应用RT-PCR技术检测正常前列腺、PCa组织和癌旁组织中TGF-β1、wt-p53 mRNA的表达情况.结果 正常前列腺外腺和癌旁组织间的TGF-β1、wt-p53表达水平相似(P＞0.05);PCa组织中TGF-β1和wt-p53表达与正常PCa组织和癌旁组织相比差异显著(P＜0.01);已有远处转移灶的PCa组织中TGF-β1和wt-p53表达与无转移者有统计学差异(P＜0.01).结论 测定TGF-β1与wt-p53表达可协助PCa的诊断和评估预后.
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神经生长因子对红藻氨酸致痫大鼠海马神经细胞凋亡和野生型P53表达的影响
目的探讨外源性神经生长因子(NGF)对癫痫发作大鼠海马神经细胞凋亡与野生型P53(wtP53)蛋白表达有无抑制作用.方法采用KA诱导癫痫发作大鼠模型.以TUNEL方法标记DNA片段,原位检测凋亡细胞;免疫组化SP法检测wtP53蛋白.观察大鼠癫痫发作40h(注射KA 48h)后其海马CA1神经细胞凋亡和wtP53蛋白表达情况及外源性NGF对它们的影响.结果大鼠急性癫痫发作后,其凋亡细胞和wtP53蛋白表达均明显增加,wtP53蛋白表达与细胞凋亡呈正相关(r=0.839,P＜0.01);给予NGF,凋亡细胞数及wtP53 表达均显著性降低(P＜0.01).结论外源性NGF对癫痫所致神经细胞凋亡有抑制作用,其抑制凋亡的分子机制可能是通过抑制wtP 53蛋白表达而实现的.
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尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响
目的:研究尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因转染对人肺腺癌细胞系H1299(p53基因缺失)的增殖抑制和凋亡诱导作用.方法:UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,采用荧光显微术、RT-PCR法和West-ern blot法分别检测细胞内绿色荧光蛋白(GFP)、wt-p53 mRNA和蛋白的表达,并通过MTT法分析基因转染对细胞的生长抑制作用,DAPI染色法和琼脂糖凝胶电泳法评价其对细胞的诱导凋亡作用.结果:UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,大量细胞表达GFP,细胞内wt-p53 mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞生长受到显著地抑制,凋亡细胞数量明显增加,并有清晰的DNA梯状条带出现.结论:UAC介导wt-p53基因转染能够显著地抑制人肺腺癌细胞系H1299的增殖,并诱导其凋亡.
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艾滋病病毒1型与乙型肝炎病毒X蛋白的相关性
近研究显示,HIV和HBV具有部分相同生物活性,在艾滋病病程中相互协同作用.文中对HIV-1和HBx及其编码产物特点、相互作用及作用机制进行综述.
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新型阳离子聚合物非病毒载体介导野生型p53基因体外转染效果的研究
目的:研究新型阳离子聚合物非病毒载体——尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因体外转染人肝癌细胞系HepG2的效果.方法:载体UAC包裹含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因和wt-p53治疗基因的质粒(pEGFP-p53)转染HepG2细胞,利用流式细胞术和荧光显微术检测细胞内GFP的表达,优选佳转染条件；采用RT-PCR法检测细胞内p53mRNA的表达,流式细胞术评价基因转染对细胞周期的影响,Western blot法检测细胞内p53及其下游细胞周期调控蛋白的表达.结果:在低pH(pH=6.9)条件下,采用低壳聚糖分子量(20000)的UAC作为载体,与pEGFP-p53形成高N/P(N/P=30)的UAC/ pEGFP-p53复合物转染HepG2细胞,可获得佳转染效果；载体UAC介导wt-p53基因转染细胞后,p53 mRNA表达水平明显上调,G0/G1期出现显著阻滞,p53、p21和Rb蛋白表达水平明显上调,cyclin D1和CDK4蛋白表达水平明显下调.结论:载体UAC可成功介导wt-p53基因转染HepG2细胞,并诱导其产生细胞周期阻滞.
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萎胃康对萎缩性胃炎大鼠胃黏膜野生型p53和Bax表达的影响
目的 对萎胃康颗粒逆转慢性萎缩性胃炎的机制进行研究.方法 将84只SD大鼠随机分为正常组14只,造模组70只.造模组采用复合造模法,待确定造模成功后,将剩余造模组60只大鼠随机分为模型组 、萎胃康低 、中 、高剂量组和西药组.各组均采用灌胃方式给药,其中正常组和模型组给予生理盐水,治疗组分别给予不同浓度的萎胃康水溶液及维酶素.治疗30 d后,做常规病理,并采用免疫组化法测各组大鼠胃黏膜Bax和p53表达情况.结果 与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜Bax和p53表达明显降低(P<0.01);经药物治疗后,各治疗组大鼠胃黏膜Bax和p53表达均显著增多,其中以萎胃康高剂量组增多明显(P<0.05).结论 萎胃康高剂量组疗效好,可能与促进细胞凋亡,抑制细胞异常增殖有关,萎胃康具有防止胃黏膜癌变的作用.
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5-氟尿嘧啶对人胃癌细胞系 p53β表达的影响
目的：检测5-氟尿嘧啶（5-FU）对人胃癌细胞株MKN45及SGC-7901 p53，p53β表达的影响。方法将不同浓度5-FU作用细胞48h，用western-blot检测p53及P53β在蛋白水平表达的变化。结果Western-blot结果显示，化疗药物5-FU作用MKN45胃癌细胞48h后，p53，P53β较未加药组表达增加，并且随药物浓度的增加其表达也随之增高，人正常胃黏膜细胞中p53，p53β的表达低于药物干预后的胃癌细胞；而相同条件下，在SGC-7901细胞系中，随药物浓度的增加p53，p53β的表达无明显变化。结论5-FU能够抑制表达野生型p53人胃癌细胞系MKN45的增殖，并能上调p53，p53β的表达，推测p53β异构体参与的p53途径是5-FU诱导的肿瘤生长抑制的重要途径之一。5-FU能够抑制人胃中分化腺癌细胞SGC-7901的增殖，但与p53，p53β无明显关联。
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TGF-β1及WTp53在乳腺癌组织中的表达及其临床意义
研究表明乳腺癌的发生是基因调控失衡的结果,其生物学特性与多种癌基因的作用密切相关,TGF-31有促进肿瘤侵袭,转移,上皮间叶转化(EMT)[1],血管增生以及免疫抑制等多种作用.野生型p53 (wt-p53)具有显著地肿瘤抑制作用,而突变型p53(mp-53)则具有致癌的作用.目前有关TGF-β1,wt-p53在乳腺癌的研究中极少报道.本研究运用血清学和免疫印迹技术分别检测了TGF-β1,wt-p53基因在乳腺癌组织中的表达,并探讨其临床意义.
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MiR-122上调野生p53蛋白增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性
目的 探讨MiRNA-122对肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU的5-氟尿嘧啶敏感性的影响以及作用机制. 方法 构建miR-122及其阴性对照空载体稳定转染至BEL-7402/5-FU细胞中,Western blot检测未转染组,阴性栽体转染组和miR-122转染组中与耐药相关的p53蛋白表达水平.用MTT法和流式细胞术检测三组细胞对5-氟尿嘧啶敏感性. 结果 MiR-122转染组与未转染组,阴性载体转染组比较,野生型p53蛋白表达水平升高.流式细胞术检测,miR-122转染组的细胞凋亡率较未转染组和阴性载体转染组高. 结论 miR-122能上调野生型p53蛋白表达,增加BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性,从而成为治疗肝癌耐药治疗的一个方法.
关键词： 微小RNA 野生型p53 BEL-7402/5-FU细胞 凋亡 5-氟尿嘧啶 -
外源性野生型p53基因对HepG_2细胞的作用
目的 研究外源性野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG_2细胞生长的影响.方法 以人源性肝癌细胞系HepG_2细胞为实验对象,检测其p53基因的突变.转染阳离子脂质体介导的野生型p53基因,检测其表达和凋亡水平的变化.结果 人源性肝癌细胞系HepG_2细胞存在p53基因的突变,阳离子脂质体介导的野生型p53基因可有效转染入HepG_2细胞中.转染后的HepG_2细胞增殖受到抑制,细胞凋亡水平增高.结论 野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG_2细胞有明显的抑制效应, 可能在肝癌的治疗方面起着重要作用.
关键词： 野生型p53 肝癌细胞系HepG_2 基因治疗 -
宫颈鳞癌组织中HPV E6与野生型p53和PinX1表达的关系及其临床意义
目的 探讨宫颈鳞癌、宫颈鳞癌癌旁及正常宫颈组织中HPV E6、野生型p53及PinX1表达及其关系.方法 收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科2013年3月至2014年2月17例宫颈鳞癌患者宫颈鳞癌、宫颈鳞癌癌旁组织,选取10例正常宫颈组织作为对照.采用Real-TimePCR、Western blot、免疫组织化学方法检测3组组织中HPV E6、野生型p53和PinX1的mRNA、蛋白的表达及分布.结果 宫颈鳞癌组织中mRNA及蛋白水平结果均显示HPV E6的表达水平显著高于癌旁组织(P＜0.01),而野生型p53和PinX1的表达水平明显低于癌旁及正常组织(P＜0.05).相关性分析提示:宫颈鳞癌组织中野生型p53(R=-0.605,P＜0.01)和PinX1(R=-0.496,P＜0.05)表达水平的下降与HPV E6的表达水平升高存在负相关,野生型p53与PinX1的表达呈正相关(R=0.824,P＜0.01).结论 宫颈鳞癌组织中HPV E6表达上调与野生型p53、PinX1的表达负相关,PinX1的表达与野生型p53密切相关,HPV E6可能通过抑制野生型p53、PinX1导致宫颈鳞癌的发生、发展.
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制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达
背景与目的 p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53 C-末端负调控序列的作用.本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scatter plot, FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)表达.方法 利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明.三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scatter plot检测其GFP表达.结果 测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53 C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失.Ad-(empty carrier)无p53.FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增.801D包含了不同荧光强度比率的细胞.结论 构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier).流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法.
