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大鼠胎肝干细胞的鉴定和分化研究
胚胎肝脏中含有的原始肝细胞具有成体肝干细胞的基本特性,即具有自我增殖和向肝细胞或胆管细胞分化的双分化潜能[1].鉴定潜在的干/祖细胞,主要依赖离心法或细胞表面标志来实现.经典的利用细胞表面标志实现分选方法是流式细胞分选法和免疫磁珠分选法,但肝干细胞表而标志目前尚无公认的金标准[2]且标志分选策略的代价高,限制了其在肝干细胞分选中的应用.
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胚胎肝干细胞癌变实验
背景:目前针对肝癌是起源于成熟肝细胞的去分化还是肝干细胞的成熟受阻这一问题仍存在争议.目的:观察胚胎肝干细胞癌变的可能性.设计、时间和地点:随机对照动物实验,于2006-01/12在中山大学动物实验中心完成.材料:6～8周龄BALB/c雌性小鼠70只,体质量20～25 g,随机分为3组:空白对照组10只、模型组30只、实验组30只.另取孕14 d胎鼠用于制备胚胎肝细胞.方法:3组小鼠麻醉后均行2/3肝切除.模型组诱导肝癌,在饮水中加入100 μg/L二乙基亚硝胺,连续饮用12周.实验组在诱导肝癌的基础上行肝干细胞移植,即分离的胚胎肝细胞经肠系膜静脉注射到肝脏,每只小鼠移植1×106个细胞.空白对照组仅行肝干细胞移植,同时饮正常水.6个月后处死小鼠,制备肝脏标本,取肝癌结节做连续切片进行指标检测.主要观察指标:采用免疫组化或免疫荧光方法检测Y染色体性别决定区域蛋白、甲胎蛋白、胎盘型谷胱苷肽转移酶或细胞角蛋白19的表达,以分析肝癌的细胞来源和特征.结果:6个月后,实验组有8只小鼠成功诱癌,其中7只为肝细胞性肝癌,1只为胆管细胞性肝癌;模型组有7只小鼠成功诱癌,其中6只为肝细胞性肝癌,1只为胆管细胞性肝癌;两组诱癌率、肿瘤病理类型比较均无明显差异(P>0.05).实验组17.1%的肝细胞癌结节Y染色体性别决定区域蛋白染色阳性,胆管细胞癌结节Y染色体性别决定区域蛋白染色均为阴性.肝细胞癌结节表达甲胎蛋白和谷胱苷肽转移酶,而不表达细胞角蛋白19;胆管细胞癌结节不表达甲胎蛋白和谷胱苷肽转移酶,而表达角蛋白19.结论:在诱导肝癌过程中移植的肝干细胞有癌变的潜能,并保持了胚胎肝干细胞未成熟的特征,仍表达谷胱苷肽转移酶和甲胎蛋白.
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大鼠胚胎肝干细胞标记物的筛选
目的 筛选大鼠胚胎肝脏组织特异性表达的mRNA,寻找肝干细胞的特异性标记物.方法 取成年大鼠肝脏2个、2周胚龄大鼠胚胎肝脏2个作为标本.提取标本的RNA,反转录合成cDNA,再体外转录合成cRNA,同时进行标记.将cRNA纯化后进行杂交、洗涤、染色,对芯片进行扫描.将基因芯片数据进行处理与分析,筛选出目的基因.免疫组化方法检测各相关蛋白在胚胎肝脏组织中的表达.结果 筛选出787个在大鼠胚胎肝脏组织中高表达的差异表达基因,涉及8个类别.免疫组化检测发现,高迁移率族蛋白A1(HMGA1)在2周胚龄多数胚肝胎细胞中表达阳性,阳性信号多分布于细胞质.结论 大鼠胚胎肝脏组织发育相关的差异表达基因筛选可采用基因芯片,HMGA1是大鼠胚胎肝干细胞特异性标记物.
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胚胎肝细胞移植治疗小鼠肝纤维化
目的 观察移植胚胎肝细胞减轻小鼠肝纤维化的作用.方法 孕14 d的BALB/C小鼠胚胎肝细胞移植到雌性BALB/C小鼠肝脏,二乙基亚硝胺诱导肝纤维化.60只雌性小鼠随机分为对照组,模型组及治疗组.3个月后测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)浓度及肝脏羟基脯氨酸(Hyp)含量.免疫组织化学检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)表达来确定移植的胚胎肝细胞在肝内的增殖分化.结果 移植胚胎肝细胞能显著降低血清ALT、AST、HA和LN的水平(P＜0.01).胚胎肝细胞移植组肝脏Hyp含量也明显低于模型组(P＜0.01).移植组肝脏α-SMA的表达明显低于模型组.胚胎肝细胞移植及诱导肝纤维化3个月后,胚胎肝细胞能增殖分化为肝细胞和胆管细胞,占肝脏的30%～50%.结论 在诱导肝纤维化过程中,移植胚胎肝细胞有向肝细胞和胆管细胞高增殖分化的能力,并有效地减轻肝损害和肝纤维化.
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人胚胎肝脏褪黑素受体的鉴定
目的:应用免疫组织化和核酸原位杂交技术检测人胚胎肝脏的MEL受体及其亚型分布,为进一步研究MEL对肝脏功能的调节作用提供证据.方法:1.研究对象:中期水囊引产人胎儿,取出心脏和主动脉,立即用4%多聚甲醛+0.1%DEPC固定,石蜡包埋组织,4℃冰箱贮存待检测.2.MEL探针制备:培养含有MEL1A或MEL1B受体质粒的大肠杆菌,抽提质粒,酶切,地高辛标记探针(宝灵曼公司).3.核酸分子原位杂交:原位杂交检测试剂盒、APES、Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)和专用盖玻片均购自武汉博士德生物工程公司、APES与Poly-L-Lysine 联合应用处理载玻片.按原位杂交试剂盒的说明进行检测.实验设不加探针为阴性对照.4.免疫组织化学法:一抗为鼠抗人MEL1A和MEL1B受体单克隆抗体,由香港大学生理系彭树勋教授馈赠.免疫组化试剂盒购自福建迈新公司.MEL1A和MEL1B受体单克隆抗体的稀释浓度为1∶75,以缓冲液代替第一抗体作为阴性对照,下丘脑组织作为阳性对照.结果:1.肝脏MEL1A和MEL1B受体蛋白的检测:肝脏免疫组织化学染色结果显示,在人胚胎肝脏细胞存在MEL1A和MEL1B受体蛋白,分布于细胞膜和胞核,但以胞膜为主.2.肝脏MEL1A受体和MEL1B受体mRNA的检测:肝脏的核酸分子原位杂交结果显示,在肝细胞的胞核和胞浆均存在MEL1A和 MEL1B受体mRNA的表达,但以胞核为主.结论:肝细胞的胞膜和胞核存在MEL1A和MEL1B受体蛋白,同时在胞浆和胞核检测到MEL1A受体和MEL1A受体mRNA的表达,提示肝细胞存在MEL1A和MEL1B受体,从而证实了肝脏是MEL作用的外周靶器官.
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胚胎肝干细胞癌变潜能的研究
目的 研究肝干细胞癌变的可能性. 方法 取孕14d的小鼠胚胎肝细胞作为肝干细胞移植到雌性小鼠肝脏,二乙基亚硝胺诱导肝癌.6个月后取肝癌结节做连续切片,免疫组化或免疫荧光分析Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)、 AFP、胎盘型谷胱苷肽转移酶(GST-P)或角蛋白19的表达,以研究肝癌的细胞来源和特征. 结果 6个月后诱导多发性肝癌结节.实验组17.1%的肝细胞癌结节SRY染色阳性,胆管细胞癌结节SRY染色均为阴性.肝细胞癌结节表达AFP和GST-P,而不表达角蛋白19.胆管细胞癌结节不表达AFP和GST-P,而表达角蛋白19. 结论 移植的肝干细胞转变为肝癌,并且保持了胚胎肝干细胞未成熟的特征,仍表达GST-P和AFP.提示在诱导肝癌过程中移植的肝干细胞有直接癌变形成肝细胞癌潜能.
