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骨唾蛋白及骨桥素在修复性牙本质形成中免疫组化定位的实验
骨唾蛋白(bone sialoprotein, BSP)和骨桥素(osteopontin, OPN)是矿化组织中重要的非胶原蛋白,两者都属于唾蛋白,有许多相似的物理化学性质,分别在矿化起始及成熟中发挥作用.我们通过免疫组化的方法,短期动态观察了BSP和OPN在修复性牙本质形成中时间、空间上的表达,以期进一步了解这两种蛋白在修复性牙本质形成中的作用.
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天鹅记忆接骨器对实验性骨折愈合时骨桥素和骨连接素mRNA表达的影响
目的:探讨天鹅记忆接骨器对实验性骨折愈合中骨桥素和骨连接素mRNA表达的影响.方法:30只新西兰兔双侧肱骨干横断截骨,随机选一侧以天鹅记忆接骨器内固定作为实验组,对侧以4孔加压钢板固定作为对照组.分别于术后第2、7、14、28、56天时,在骨折间隙取材,行组织学观察及半定量RT-PCR检测骨桥素和骨连接素mRNA的表达.结果:实验组骨折间隙软骨内成骨和编织骨向板层骨的改建均早于对照组;相应地,实验组的骨桥素和骨连接素mRNA分别在术后第14天和28天时达峰值,早于对照组,且其愈合进程也明显提前.结论:天鹅记忆接骨器产生的持续动态压应力可能促进了骨折愈合.
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回转对离体大鼠成骨细胞中骨粘连蛋白及骨桥素mRNA的影响
为研究模拟失重对成骨细胞细胞外基质mRNA的影响,实验采用离体大鼠成骨细胞水平轴回转模拟失重效应,用RT-PCR技术分别检测成骨细胞中骨桥素(osteopontin,OPN)及骨粘连蛋白(osteonectin,ON)mRNA的水平,并观察细胞培养液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性和骨钙素(osteocalcin,BGP)含量的变化.结果观察到,分别回转24、48、72 h后,OPN、ON的mRNA含量及细胞培养液中BGP含量均显著下降,细胞培养液中ALP活性也呈下降趋势.上述结果表明,模拟失重后成骨细胞OPN及ON的表达下调,进而使BGP及ALP的分泌量减少,从而导致骨钙化能力降低,提示模拟失重导致的细胞外基质蛋白基因表达下降可能是模拟失重引起骨丢失的原因之一.
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骨桥素对高磷诱导的牛血管平滑肌细胞钙化的作用
目的:研究骨桥素(OPN)对高磷诱导的牛血管平滑肌细胞钙化是否具有抑制作用.方法:用含不同磷(iP)浓度(1.4～2.0 mmol/L)的培养基体外培养牛血管平滑肌细胞,观察细胞钙沉积及OPN的表达;在高磷(2.0 mmol/L)培养基中加入不同浓度外源性OPN测定细胞钙化值的变化.用甲?酚肽络合酮法测定钙化量,用二喹啉甲酸检测法(BCA法)测蛋白含量,并以细胞蛋白含量标化钙化量.以实时荧光定量PCR法检测OPN mRNA的表达,以Western Blotting法测定OPN蛋白表达.结果:①培养基磷浓度1.4 mmol/L组细胞仅有少量钙沉积,随着培养基磷浓度增高及培养时间的延长,细胞钙沉积增加,第9天时,iP 2.0 mmol/L组与iP 1.4 mmol/L组钙沉积[(138.00±12.53) μg/mg protein比(22.67±2.52) μg/mg protein]差异具有显著性.②随着培养液磷浓度增高OPN mRNA表达逐渐增高,iP 2.0 mmol/L组与iP 1.4 mmol/L OPNmRNA表达[(2.51±0.18)×107 拷贝/106 GAPDH与(1.27±0.04)×107 拷贝/106 GAPDH]差异具有显著性.③随着培养基磷浓度增高OPN蛋白表达量亦相应增加.④随着培养基中OPN浓度的增高细胞钙化有减少趋势,OPN浓度0.5 μg/ml和5 μg/ml组钙化分别为(67±6.68) μg/mg protein、48.32±6.55 μg/mg protein,与单纯高磷组比较其差别具显著性(P＜0.05).结论:高磷培养基能诱导血管平滑肌发生钙化和OPN表达,且与磷浓度和作用时间有关,外源性OPN能抑制高磷诱导的细胞钙化的产生,而且这种抑制作用具剂量依赖性.
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高磷对牛血管平滑肌细胞钙化及其骨桥素分泌的实验研究
目的 研究不同浓度的磷对体外培养的牛血管平滑肌细胞的钙化及其分泌骨桥素(OPN)的影响.方法 用不同浓度磷的(1.4～2.0mmol/L)培养基体外培养牛血管平滑肌细胞,观察细胞钙沉积及骨桥素的表达.用甲σ-酚肽络合酮法测定钙化量,BCA法测蛋白含量,并以细胞蛋白含量标化钙化量.实时荧光定量PCR法检测OPN mRNA的表达,Western Blotting法测定OPN蛋白表达.结果 (1)培养基磷浓度1.4mmol/L组细胞仅有少量钙沉积,培养基磷浓度增高及培养时间延长,细胞钙沉积增加,第9天时,Pi 1.4mmol/L组与Pi 2.0mmol/L组钙沉积(22.67±2.52μg/mg vs 138.00±12.53μg/mg protein)有显著性差异P＜0.05;(2)随着培养液磷浓度增加OPN mRNA表达逐渐增加,Pi 1.4mmol/L组与Pi 2.0mmol/L组OPN mRNA表达[(1.27±0.04)×107拷贝/106GAPDH vs(2.51±0.18)×107拷贝/106GAPDH],有显著差异P＜0.05;(3)随着培养基磷浓度增加OPN蛋白表达量亦相应增加.结论 高磷培养基能诱导牛血管平滑肌发生钙化和OPN表达,且与磷浓度和作用时间有关.
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增骨Ⅱ号注射液对大鼠成骨细胞OC和OPN mRNA表达的影响
目的:研究增骨Ⅱ号注射液对体外培养的大鼠成骨细胞OC和OPN mRNA表达的影响,探讨增骨Ⅱ号注射液防治骨质疏松症的分子机制.方法:体外培养大鼠成骨细胞,分别给予不同浓度、时间的增骨Ⅱ号注射液进行干预实验,然后用RT-PCR技术分别检测各组细胞的OC and OPN mRNA表达,并进行定量分析.结果:增骨Ⅱ号注射液在不同浓度时连续干预至1～5 d,以1 mg/ml浓度条件下,OC and OPN mRNA表达强;而以1 mg/ml生骨注射液干预防1～5 d,OC和OPN mRNA的表达随时间逐渐增强.结论:增骨Ⅱ号注射液对体外培养的大鼠成骨细胞OC和OPN mRNA表达有明显促进作用,其作用强度随浓度、时间而改变.
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鼠矿化组织中非胶原蛋白的提取和层析分离
目的:提取小鼠矿化组织中的基质蛋白,用离子交换层析法分离非胶原蛋白,并进行初步分析.方法:取新生小鼠的颅盖骨和成年鼠的股骨,用盐酸胍和EDTA提取基质蛋白,采用Mono Q HR 离子交换柱层析,4%-16% SDS-PAGE梯度胶电泳,Stains-All染色结合银染鉴定蛋白质,抗骨唾蛋白(bone sialoprotein,BSP)抗体,抗骨桥素(osteopontin,OPN)抗体进行免疫印迹.结果:用Mono Q HR 离子交换柱能够有效地分离出矿化组织的非胶原蛋白,Stains-All硝酸银染色和免疫印迹显示出不同组份的蛋白质提取分析情况.结论:对矿化组织中的非胶原蛋白的初步提取、分离可以采用Mono Q HR 离子交换柱层析,采用银染结合Stains-All染色、免疫印迹检测和鉴定各种非胶原蛋白.
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牙周韧带细胞体外矿化的研究——骨唾蛋白与骨桥素在矿化过程中的表达
目的:研究骨唾蛋白与骨桥素在体外培养的人牙周韧带细胞矿化过程中的表达.方法:体外培养的人牙周韧带细胞,经地塞米松矿化液诱导,分别于不同的时间在相差显微镜下观察其矿化结节的形成,采用免疫细胞化学的方法观察骨唾蛋白与骨桥素的表达情况.结果:矿化培养1周细胞呈复层生长,骨桥素呈阳性染色;两周细胞密集呈结节状,骨唾蛋白与骨桥素均为阳性,胞浆染成黄褐色;3周出现矿化结节,矿化以后骨唾蛋白与骨桥素保持稳定表达.结论:牙周韧带细胞在适当的条件下可以向成骨细胞表型分化,表达矿化相关蛋白,形成矿化结节.
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矿化相关蛋白在牙周组织中的分布及意义
目的:研究矿化相关蛋白在牙周组织中的分布并探讨其意义.方法:取正常成年杂种狗第二磨牙及其牙周组织,利用免疫组化SP法对矿化相关蛋白在牙周组织中的表达进行定位研究.结果:骨桥素OPN在牙周韧带基质及细胞中表达阳性,牙龈结缔组织中表达弱阳性,牙槽骨中邻近牙周韧带的部位表达阳性,其余部位及牙骨质中表达阴性;骨钙素OC在牙周韧带中表达阳性,牙龈结缔组织中表达弱阳性,牙槽骨中染色较弱且不均匀,牙骨质中表达阴性;骨唾蛋白BSP在牙周韧带中表达阳性,牙槽骨中染色集中在哈佛氏管周围,牙骨质和牙龈表达阴性.结论:矿化相关蛋白在牙周韧带基质及细胞中阳性表达,提示牙周韧带细胞在矿化组织的形成与再生中具有重要作用;矿化相关蛋白在牙周韧带细胞和牙龈成纤维细胞中的不同表达可作为鉴别牙龈成纤维细胞与牙周韧带细胞的标志.
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高磷对牛血管平滑肌细胞钙化及其骨桥素分泌的影响
血管钙化是一种类似于骨和软骨形成过程,具有可调节性,其中高磷具有促进血管钙化发生和进展的作用[1,2],然而,其机制尚未完全清楚.为此,我们进行牛血管平滑肌细胞体外培养,观察不同磷浓度对钙沉积影响,并探讨其与骨桥素(OPN)的关系.
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核心结合因子a1、骨形成蛋白及骨桥素在小鼠牙周组织发育中的免疫组化定位研究
目的 探讨核心结合因子a1、骨形成蛋白和骨桥素3者在小鼠牙周组织发育过程中的时间和空间分布特点、表达意义及它们之间的相互作用.方法 用SABC免疫组化法检测3者在出生后不同时期小鼠牙周组织发育中的表达及特点.结果 牙齿发育早期,仅骨形成蛋白在牙囊细胞中表达;当牙根开始发育后,3者皆在牙周膜细胞、成牙骨质细胞中表达,但骨形成蛋白在无细胞牙骨质和细胞牙骨质中皆不表达,核心结合因子a1在细胞牙骨质中表达,而骨桥素则在无细胞牙骨质、细胞牙骨质和牙槽骨表面皆呈强阳性表达.结论 核心结合因子a1、骨形成蛋白、骨桥素3者皆参与牙周组织的发育,对矿化和生长发育发挥重要作用.
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模拟失重大鼠股骨和骨髓中骨桥素的变化
目的研究模拟失重大鼠股骨和骨髓中骨桥素(OPN)的形态学变化.方法选用SD大鼠,随机配对分为尾吊组和自由活动组,每组5只,实验期为14和28 d.组织标本行原位杂交.结果尾吊组大鼠股骨(14 d, 207.45±0.43; 28 d, 217.48±0.34)和骨髓(14 d, 108.37±0.42; 28 d, 207.32±0.56)中OPN的表达明显弱于对照组(P<0.05);尾吊组14 d OPN的表达明显强于28 d (P<0.05).对照组间无显著性的差异(P>0.05).结论大鼠后肢去负荷导致股骨和骨髓的OPN含量降低.去负荷时间越长,OPN含量降低就越显著.
