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高正加速度环境对猴口腔黏膜上皮细胞热休克蛋白70表达的影响
航天飞船在升空和返回阶段,机体可受到超重高正加速度(+Gx)的作用.研究表明,超过+3Gx负荷可影响人体正常的生理功能.我们以猴为对象,采用模拟高+Gx作用的动物离心装置,观察猴口腔黏膜的组织病理学改变及热休克蛋白70( heat-shock protein-70,HSP-70)表达的影响.
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口腔黏膜病临床治疗Ⅳ.口腔扁平苔藓的诊断及治疗进展
口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP)是一种伴有慢性浅表性炎症的黏膜角化异常性疾病,发病率约为0.51%,是口腔黏膜病中常见的疾病之一[1].笔者对2 429例黏膜病初诊病例进行统计分析发现,OLP占16.3% (395/2 429),仅次于复发性阿弗它溃疡的18.7% (454/2 429),居初诊患者的第二位.目前,OLP的发病机制仍不明确,但许多证据表明OLP符合自身免疫性疾病的基本特征[1-5]:①OLP常呈反复发作,呈慢性迁延趋势;②好发于中年女性,且发病部位对称;③OLP的发生有一定的遗传倾向;④糖皮质激素或其他免疫抑制剂治疗OLP常能使病情缓解但不能根治;⑤患者病损范围局限在自身细胞毒性T细胞所针对的口腔黏膜上皮细胞分布区域;⑥将人的致敏T细胞转移到鼠的脚垫,可观察到类似OLP的病理改变.所以说,OLP是一种T细胞介导的自身免疫性疾病.本文以自身免疫为主线,从OLP的诊断与治疗两方面进行介绍.
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正常和病变的口腔黏膜上皮细胞对α干扰素的敏感性差异研究
目的 观察正常和不同病变程度的口腔黏膜上皮细胞对α干扰素(IFN-α)敏感性的差异,为IFN-α的抗肿瘤应用和机制的研究提供基础.方法 分别培养正常口腔黏膜上皮细胞株(NOK)、口腔黏膜异常增生上皮细胞株(DOK)、口腔表皮样癌细胞株(KB),取传至第3代对数生长期细胞接种于细胞培养板,对照组每孔加入2mL含10％胎牛血清的完全培养液,实验组设IFN-α浓度100、500、1000U/mL3个浓度组,实验组每孔分别加入含相应浓度IFN-α的完全培养液,常规培养24h后检测细胞增殖能力、细胞凋亡和细胞周期变化情况.结果 不同浓度的IFN-α分别作用于3种细胞,对NOK细胞株的增殖能力无影响,而DOK、KB细胞株各实验组与对照组相比增殖能力明显减慢,差异均有显著统计学意义(均P＜0.01).浓度500 U/mL IFN-α对NOK细胞株的凋亡无影响,但有促进DOK、KB细胞株凋亡的作用.浓度500 U/mL IFN-α对NOK细胞株周期无影响,DOK细胞株GdG1期细胞比例显著减少,而GJM期细胞比例显著增加,KB细胞株G#M期细胞比例显著增加.结论 正常上皮细胞对IFN-α不敏感,而DOK、KB细胞株对IFN-α敏感;IFN-α有抑制DOK、KB细胞株的增殖能力、促其凋亡的作用,且细胞周期阻滞于GdM期.
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干扰趋化因子CC受体-2调控p38MAPK信号通路抑制人口腔黏膜上皮细胞系增殖的机制
目的 探讨干扰趋化因子CC受体(CCR)2基因的表达对口腔黏膜上皮细胞增殖的影响及机制.方法 Western印迹检测CCR2在口腔黏膜下纤维性变(OSF)中的表达;用CCR2的siRNA转染人口腔黏膜上皮细胞系(HOMC)细胞,转染48 h后用Western印迹检测各组细胞中CCR2蛋白表达;细胞增殖与活性检测(CCK8)实验检测细胞增殖;Western印迹检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化(p)-p38MAPK蛋白表达.结果 CCR2在OSF组织中的表达显著高于正常口腔黏膜组织(P＜0.01);阴性对照(NC)-siRNA组CCR2蛋白表达、细胞存活率及p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);CCR2-siRNA组CCR2蛋白表达、细胞存活率及p-p38MAPK蛋白表达均显著低于对照组(P＜0.01).结论 CCR2在OSF中高表达,抑制CCR2的表达可通过调控p38MAPK信号通路抑制HOMC的增殖.
关键词： 趋化因子CC受体-2 口腔黏膜下纤维性变 口腔黏膜上皮细胞 增殖 -
口腔黏膜上皮细胞片移植治疗角膜缘干细胞缺损的基础研究及临床应用
角膜缘干细胞为正常角膜上皮的自我更新提供了来源,在维持眼表稳态中起到了极为重要的作用.近年来,随着对成体干细胞认识的加深以及生物组织工程学的发展,培养的口腔黏膜细胞片移植已成为治疗角膜缘干细胞缺损的方法之一.本文就其培养方法、细胞片表型及临床应用结果的进展进行综述.
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TLR4与LPS诱导的大鼠口腔黏膜分泌TNF-α的相关性研究
目的:观察Toll样受体-4(Toll like receptors 4,TLR4)与脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的,大鼠口腔黏膜上皮细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的相关性.方法:选取SPF级SD大鼠15只,根据随机数字表法将其随机均分为5组,分别为采用不同浓度和不同时间的LPS刺激大鼠口腔黏膜,检测大鼠口腔黏膜上皮细胞培养上清液中TNF-α的表达情况,检测细胞内TLR4、MyD 88的表达变化.结果:经过LPS刺激后,TNF-α蛋白质的表达量随着LPS刺激浓度的增加而逐渐升高,呈现出明显的剂量依赖性效应.另外,二者与LPS刺激的持续时间呈现出一定的时间依赖性,TNF-α蛋白质的表达量在12 h达到峰值.LPS能够明显增加细胞内TLR4和MyD88蛋白质的表达.结论:LPS诱导并促进大鼠黏膜上皮细胞分泌TNF-α的情况,可能与TLP4调控有关.
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hTERT诱导永生化口腔黏膜上皮细胞株的建立
目的:转染外源性人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因建立永生化口腔黏膜上皮(oral mucosal epithelial,OME)细胞株.方法:利用反转录病毒载体将外源性hTERT基因转入OME细胞,G418筛选出抗性细胞克隆后,进行免疫细胞化学(immunoeytochemistry,ICC)鉴定细胞来源、细胞形态学观察、细胞增殖动力学研究、裸鼠成瘤实验以及hTERT基因和蛋白表达的检测.采用SPSSll.0软件包对数据进行统计学处理.结果:转染细胞与未转染细胞形态非常相似,均呈多边形、多角形,“铺路石”样排列;广谱角蛋白染色阳性,波丝蛋白染色阴性；未转染细胞体外培养36 d后停止生长,群体倍增数(population doublings,PDL)为9,转染细胞增殖活跃,PDL 值超过80; RT-PCR和Western印迹结果均显示,hTERT在转染细胞中稳定表达,而在未转染细胞中不表达.结论:转染外源性hTERT基因的OME细胞呈稳定增殖的永生化状态.
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人口腔黏膜角化上皮细胞的体外培养及生物学特性研究
目的:探讨人口腔黏膜角化上皮细胞的体外培养扩增方法及其生物学特性.方法:取牙周手术中切取的正常角化牙龈组织,经0.25%肼spase分离上皮层后,0.05%的胰酶分离为单个细胞,接种在无血清培养基中,进行原代培养及传代培养,并进行形态学观察、角蛋白免疫组化染色及其生长曲线、传代特点、各代生长特点的观察.结果:口腔黏膜角化上皮细胞能够在Epilife无血清培养基中稳定增殖传代,可连续传4～6代,成活45～60d,细胞生长呈铺路石状,角蛋白免疫组化染色阳性.结论:应用Epilfe无血清培养基,可在短期内获得大量具有增殖能力的口腔黏膜角化上皮细胞.
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慢病毒载体介导Golli-MBP基因过表达的体内实验初探
目的：通过过表达Golli?MBP基因尝试诱导口腔黏膜产生OLP病损，探讨Golli?MBP在OLP发病中的作用。方法：通过动物体内实验利用慢病毒载体系统包装诱导Golli?MBP过表达基因，将其注射于叙利亚金黄地鼠口腔黏膜下，肉眼观察黏膜改变，HE染色观察组织学改变，TUNEL法检测细胞凋亡，免疫组化法检测细胞增殖情况。结果：Golli?MBP未能诱导实验动物口腔黏膜产生肉眼可见的OLP病损变化，7天实验组上皮层细胞凋亡率与对照组无明显差异（ P＞0．05），14天实验组上皮层细胞凋亡率低于对照组（P＜0．05）。7天及14天实验组上皮层细胞增殖率低于对照组（P＜0．05）。结论：Golli?MBP 过表达能够抑制叙利亚金黄地鼠颊囊黏膜上皮细胞增殖和凋亡，但未能成功诱导其黏膜产生OLP病损。
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人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验
目的:探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法.方法:采用美国DispaseⅡ试剂获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞,将其种植在PLGA膜上,通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性.结果:采用Dispase Ⅱ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层,通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞,将其植入PLAG膜上,细胞获得很快生长,5 d时细胞出现分化,8 d时可以长到5层左右.结论:本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞,获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PLAG膜上可获得良好的生长.
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温度敏感性材料培养的脂肪源性干细胞作为眼表重建种子细胞的可行性研究
背景 组织工程角膜学的发展为角膜盲的治疗提供了新的选择,但目前暂未发现培养方法简单、可行性好的角膜上皮种子细胞和理想的支架材料.研究表明,脂肪源性干细胞(ADSCs)具有自我更新能力同时也具有类上皮的特质,而温度敏感性材料(TRSs)作为支架进行干细胞培养也为细胞层片技术的进步提供了技术支撑. 目的 研究兔ADSCs在TRSs上的培养特性,并与经典的口腔黏膜上皮细胞(OMECs)特性进行比较,探讨ADSCs作为眼表重建种子细胞的可行性.方法 异丙基丙烯酰胺溶于二丙醇后均匀涂于直径35 mm的聚苯乙烯培养皿表面,利用电子束照射制备TRSs,兔颈背部皮下脂肪组织2～3g经消化培养后获得ADSCs,同时取出兔口腔黏膜组织进行消化培养,获得OMECs.将2种干细胞均接种于TRSs上继续培养,比较2种细胞形态、生长速度、脱附时间和成活细胞的总计数,将ADSCs层片和OMECs层片行组织病理学检查,观察2种细胞的形态特征;采用免疫组织化学法检测2种细胞中干细胞标志物和上皮细胞标志物的表达;应用扫描电子显微镜检查2种细胞层片的表面超微结构.结果 自制TRSs透明性和光滑度与普通培养皿接近,任意观察的5个样品中有4个水接触角＞10°,成功率为80％.TRSs上培养的ADSCs呈长梭形,OMECs呈不规则圆形.ADSCs生长周期在TRSs上为12～ 14 d,脱附时间为(46.0±9.6) min,细胞总计数为(7.9±1.1)×105/片,而TRSs培养的OMECs生长周期为14～16 d,脱附时间为(91.9±10.9) min,细胞计数为(45.8±26.5) ×105/片,2种细胞间层片脱附时间和细胞计数的差异均有统计学意义(P=0.002、0.028).组织病理学检查显示,TRSs上的ADSCs呈1～3层排列,而OMECs呈4～5层覆层结构.免疫组织化学染色显示,ADSCs和OMECs细胞层片细胞角蛋白12(CK12)及干细胞标志物p63、ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)均呈阳性表达.扫描电子显微镜下观察可见ADSCs和OMECs表面均有致密的上皮微绒毛结构,细胞间连接紧密.结论 自制的TRSs可作为脂肪干细胞的培养支架,ADSCs取材广泛,TRSs上培养的ADSCs层片细胞活力好,可操作性强,可作为眼表重建新的种子来源.
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体外培养组织工程细胞膜片重建眼表研究进展
角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的来源,是维持眼表稳态的关键.近年来,随着对成体干细胞认识的加深以及组织工程、生物材料及细胞培养技术的发展,体外培养的细胞膜片移植,包括角膜缘和口腔黏膜上皮细胞膜片移植进行眼表重建的基础研究获得了一定的进展,在临床应用中也得到了较好的治疗效果,但对眼表重建的临床效果和移植细胞的体内转归方面仍无定性的结论.本文主要对利用组织工程技术构建的自体或异体角膜缘上皮细胞、口腔黏膜上皮细胞膜片移植重建眼表的基础研究进展、临床应用情况及移植细胞体内转归的进展进行介绍和比较,以期为该领域的研究提供有益的探索方向.
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以兔自体结膜成纤维细胞为饲养细胞构建上皮细胞植片
近年来用以组织工程技术制备的角膜上皮或口腔黏膜上皮细胞植片成为一种目前治疗角膜缘干细胞缺乏性疾病的新技术[1-2],能够改善角膜缘的功能,恢复角膜表面的完整性.目前的构建体系常用小鼠胚胎组织来源的3T3成纤维细胞作为饲养细胞,但这种含异种细胞的植片可成为异种病原向人体传播的潜在渠道,也存在异种排斥反应的可能性[3].因此寻找更安全的饲养细胞成为完善现有技术的一个关键.本研究观察以兔自体结膜成纤维细胞为饲养细胞、兔口腔黏膜上皮细胞为种子细胞构建上皮细胞植片的可行性.
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犬上皮细胞亚群的实验研究
目的 探讨犬上皮细胞原代培养的可行性,并从中分选出一类上皮细胞亚群.方法 酶消化法获取口腔黏膜上皮细胞,流式分选整合素α6+/CD71-的细胞亚群,观察其生物学特性,对照组细胞未用流式分选.结果 成功获取犬上皮细胞,细胞亚群形态一致,可见角蛋白丝和桥粒结构,克隆形成率(11.63％)高于对照组(6.83％),生长周期也更长;第3代亚群细胞整合素α6阳性表达率(92.3％)高于对照组(86.4％),且整合素β1荧光强度也明显增强.结论 犬上皮细胞原代培养成功,并分选出一种新型、优质的种子细胞.
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KGF对口腔黏膜上皮细胞中增殖相关基因PCNA mRNA的作用
目的:检测不同浓度角质细胞生长因子(KGF)对体外培养的口腔黏膜上皮细胞形态学及对上皮细胞增殖相关基因PCNA mRNA表达的影响.方法:体外培养的口腔黏膜上皮细胞加入含不同浓度KGF(0 ng/mL,5 ng/mL,25ng/mL,50 ng/mL)的D-KFSM,分别培养12 h、24 h、48 h后观察细胞形态改变并用荧光实时定量检测各组细胞内增殖相关基因PCNA mRNA的表达.结果:①相同时间段实验组较对照组上皮细胞贴壁明显,培养48 h实验3组(50ng/mL)较其他组细胞核仁明显；②12h时,实验组较对照组上皮细胞内PCNA mRNA表达增加,但各实验组间PCNAmRNA表达逐渐降低(P＜0.05)；③24 h时实验组较对照组PCNA mRNA表达增加,但各实验组间无统计学差异(P＞0.05)；④48 h时,实验组较对照组PCNA mRNA表达增加,且呈剂量依赖性(P＜0.05).结论:外源性KGF可上调口腔黏膜上皮细胞增殖相关基因PCNA mRNA的表达,且在不同时间段、不同浓度调控作用存在差异.
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口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞的复合培养
目的为癌前病变临床病理研究建立一种简便、迅速和有效的口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞复合培养的方法, 实现体外模拟组织工程化口腔黏膜的发生发展. 方法用DispaseⅡ分离上皮和皮下组织, 用KGM培养口腔黏膜上皮细胞. 用细胞培养法和组织块培养法获取实验用的口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞, 并采用复合培养法对两种细胞进行共同培养. 结果用DispaseⅡ可成功地分离上皮和皮下组织. KGM可明显促进口腔黏膜上皮细胞的分裂繁殖 . 复合培养的HE染色切片显示薄层的结缔组织之上有方形的基底细胞、颗粒细胞和角化层 . 结论 KGM可明显促进口腔黏膜上皮细胞的分裂和成熟. 采用组织培养法获取原代成纤维细胞是适合口腔黏膜取材等特点的有效方法. 气液相培养的口腔黏膜下结缔组织可促进上皮细胞的分层和分化.
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人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA 方法的初步研究
目的：探索从人类口腔黏膜上皮细胞中提取基因组 DNA 方法的可行性。方法分别采用煮沸法和碱裂解法从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA ，然后与临床常用的碘化钠（NaI）法提取的人全血基因组 DNA 进行比较。结果煮沸法和碱裂解法2种方法均能从口腔黏膜上皮细胞抽提到 DNA ，提取的 DNA 浓度虽低于 NaI 法，但用2种方法提取到的 DNA 样品进行聚合酶链反应，均能获得满意效果，与常规 NaI 法无明显差异。结论从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA 简便、快捷、无损，在临床上具有潜在的应用价值。
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葛根芩连汤对人口腔黏膜上皮细胞增殖的影响
目的 探讨葛根芩连汤浸提液对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响.方法 原代培养人口腔黏膜上皮细胞,取第二代培养细胞,随机分为五个实验组和一个对照组.实验组分别用无血清培基(K-SFM)稀释成终浓度分别为2％、10％、15％、20％、50％五个浓度梯度的葛根芩连汤提取液进行培养.对照组仅用无血清培基继续培养.MTT法测定培养的人口腔黏膜上皮细胞的增殖活性.结果 原代培养的人口腔黏膜上皮细胞呈多角形,胞核清晰.5个实验组OD值均高于对照组;15％浓度组OD值高于其它4个实验组;以上差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 葛根芩连汤在15％浓度下能增强体外培养的人口腔黏膜上皮细胞的增殖活性,,有望用于复发性阿弗他溃疡的局部治疗.
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慢病毒介导过表达端粒酶逆转录酶的人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建
目的 通过慢病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的口腔黏膜上皮细胞(OMECs),探索构建高效、稳定的永生化OMECs细胞系的方法.方法 提取293T细胞总RNA,应用聚合酶链反应(PCR)法扩增hTERT基因全长,构建重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT.包装慢病毒颗粒后感染人正常OMECs,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测hTERT基因mRNA和蛋白的表达水平.结果 成功构建了pLVX-puro-hTERT过表达慢病毒载体并感染到OMECs中;感染细胞与正常OMECs形态相似,呈铺路石样生长;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,hTERT在感染细胞中高表达,与正常细胞相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 通过慢病毒法成功建立了过表达hTERT的OMECs稳定细胞系,为构建高效、稳定增殖的人永生化OMECs细胞系奠定了实验基础.
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角质细胞生长因子对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用研究
目的：研究不同浓度角质细胞生长因子（KGF）对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用，为探讨KGF在口腔黏膜病发生发展中的作用提供依据。方法将不同浓度的KGF（对照组0 ng·mL-1，实验1组5 ng·mL-1，实验2组25 ng·mL-1，实验3组50 ng·mL-1）分别加入体外培养的口腔黏膜上皮细胞，培养12、24、48 h后，倒置显微镜下观察其对细胞形态的影响，并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果1）实验组较对照组细胞贴壁明显，且48 h时实验3组细胞核仁明显。2）培养48 h时，4组之间的细胞凋亡率、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均有统计学差异，随着KGF浓度的增加，细胞凋亡率和Bax mRNA表达逐渐降低，Bcl-2 mRNA表达逐渐升高（P<0.05）。结论 KGF可通过上调Bcl-2 mRNA和下调Bax mRNA的表达抑制上皮细胞的凋亡。
