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肿瘤坏死因子α通过抑制线粒体呼吸链复合体Ⅲ诱导L929-A细胞发生RIP1激酶依赖性细胞凋亡
目的 探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)诱导L929-A细胞发生受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein 1,RIP1)依赖性凋亡的分子机制.方法 通过胰蛋白酶浓度梯度消化及蛋白质印迹法检测RIP1、胱天蛋白酶8(caspase-8)和Bid蛋白的表达和线粒体定位;利用荧光探针标记法检测TNF-α处理后L929-A细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、胞内钙离子浓度、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)浓度,应用试剂盒检测线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ的活性变化;采用RIP1激酶特异性抑制剂坏死抑素1(necrostatin-1,Nec-1)和Bid基因敲除的L929-A细胞评估RIP1激酶活性和Bid蛋白在介导细胞死亡中的作用.结果 RIP1、caspase-8和Bid蛋白均定位在线粒体外膜上;TNF-α处理后3 h即可诱导Bid剪切,伴随Bid剪切,线粒体呼吸链复合体功能检测显示复合体Ⅲ的活性受到抑制,MMP下降.TNF-α处理后6~12 h细胞内ROS升高、钙离子浓度上升、ATP浓度降低;抑制RIP1激酶活性或敲低Bid蛋白可完全拮抗TNF-α诱导的细胞毒性.结论 TNF-α通过诱导RIP1激酶活性依赖的Bid剪切,继而抑制线粒体呼吸链和细胞能量代谢,诱导细胞死亡.
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多巴胺代谢引起氧化应激导致鱼藤酮诱导的PC12细胞毒性作用
鱼藤酮是一种常见的杀虫剂,也是线粒体呼吸链复合体Ⅰ的特异性抑制剂,大鼠长期喂鱼藤酮可以引起类似帕金森病(PD)的生化和组织水平的改变,如黑质致密部多巴胺能神经元的选择性丧失等等.该文用PC12细胞系从氧化应激的角度论证多巴胺在此细胞毒性过程中的作用.实验结果表明,加鱼藤酮组的细胞成活率有明显降低而且胞内多巴胺浓度显著升高并与加药脸始亮恳览倒叵?鱼藤酮也影响PC12细胞中与多巴胺合成和转运相关的蛋白质和酶活性的改变.在这些细胞中,单胺转运蛋白2(VMAT2)活性显著下调,多巴胺转运蛋白(DAT)活性上调,单胺氧化酶(MAO)活性增强.
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尿素通道蛋白B基因敲除对小鼠线粒体功能的影响
目的:尿素通道蛋白B( urea transporter B, UT-B)是介导尿素快速跨膜转运的膜蛋白,UT-B基因敲除后可导致老龄小鼠发生心肌肥大,本研究拟探讨UT-B基因敲除后对小鼠线粒体功能的影响。方法:应用试剂盒检测线粒体呼吸链复合体的活性, PCR检测mtDNA 基因D-loop区域多态性/突变情况,流式细胞术检测线粒体膜电位和ROS水平。结果:与野生型小鼠相比, UT-B基因敲除小鼠线粒体复合体I和IV活性明显下降,通过复合体Ⅴ产生的ATP量明显降低;线粒体mtDNA发生多处突变,线粒体损伤标志线粒体DNA/核DNA的比率显著下降。 UT-B基因敲除小鼠线粒体膜电位水平较野生型小鼠明显下降,而心肌ROS水平增加约31.42%。结论:UT-B基因敲除后可导致小鼠线粒体功能障碍,这可能是其老龄后发生心肌肥大的机制之一。
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SAMP6小鼠骨髓间充质干细胞线粒体呼吸链复合体功能研究
目的:研究自发性老年性骨质疏松模型SAMP6小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的衰老状态、分化功能及线粒体呼吸链复合体活性。方法:分离培养SAMP6及其对照品系SAMR1小鼠BMMSCs,分别以实时定量PCR(RT-PCR)、Western Blot及细胞染色的方法,检测衰老、分化相关指标,并分别检测线粒体呼吸链复合体活性及复合体相关基因的表达。结果:与对照品系SAMR1小鼠相比,SAMP6小鼠BMMSCs的衰老相关基因、蛋白水平及β-gal染色阳性率显著升高(P<0.05);成骨分化相关基因、蛋白水平及茜素红染色阳性率显著降低(P<0.05);线粒体呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ活性显著降低,且呼吸链复合体相关基因表达亦降低(P<0.05)。结论:SAMP6小鼠BMMSCs存在细胞衰老及成骨分化功能障碍,其线粒体呼吸链复合体功能显著下降。