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卵母细胞透明带形态异常1例病例报道与文献复习
目的 介绍1例卵母细胞透明带形态异常不孕患者成功活产的病例.方法 对本院1例卵母细胞透明带形态异常不孕患者的临床资料进行分析,并对相关文献进行系统性回顾.结果 患者孕40+1周成功分娩一男活婴.结论 卵母细胞透明带形态异常可能影响受精、胚胎发育等,改变受精方式和采用非常规的胚胎激光辅助孵化可获得良好的妊娠结局.
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自体血清培养系统获得人未成熟卵体外成熟和受精及临床妊娠成功2例
人未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)技术是IVF-ET及卵母细胞单精子显微注射(ICSI)技术衍生的一种新型辅助生殖技术.在临床主要应用于难治性多囊卵巢(PCO)及多囊卵巢综合征(PCOS)的不孕患者[1-3].目前,IVM培养体系仍无标准化的商业培养系统应用于临床.我中心常规采用人成熟卵泡液作为主要蛋白和营养来源的IVM培养体系[4,5],但临床应用仍存在潜在的病原学感染的风险和伦理学问题.所以,我们开始以患者自体血清作为蛋白和营养来源的IVM培养系统的临床研究,已实施3例IVM,获得2例临床妊娠.报道如下:
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代谢组学在胚胎评估中的应用前景
胚胎发育能力的评估在人类辅助生殖技术中起很重要的作用.代谢物组学作为一种非侵入性检测手段可以客观地评价胚胎质量,有良好的重复性;可通过碳水化合物、氨基酸等代谢物评估胚胎及卵母细胞的发育潜能,从而使代谢组学在辅助生殖领域有广阔的应用前景.
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人类卵母细胞冷冻保存技术的安全性及其临床应用
随着冷冻技术的发展,特别是玻璃化冷冻技术的应用,卵母细胞冷冻技术越来越成熟,目前已成为辅助生殖技术重要的组成部分.本文从人卵母细胞冷冻方法 、影响冷冻安全性因素、临床应用及临床安全性方面对人卵母细胞冷冻技术进行阐述与总结,以期指导其在临床的应用.
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玻璃化冷冻保存技术对体外成熟卵母细胞发育潜能和转录组的影响
目的 探索玻璃化冷冻保存技术对体外成熟(in vitro maturation,IVM)卵母细胞发育潜能和转录组的影响.方法 选择2014年9月—2016年3月期间在北京大学第三医院生殖医学中心接受腹腔镜手术联合经阴道穿刺取卵行卵母细胞IVM治疗的不孕症患者为研究对象进行前瞻性队列研究,将研究对象分为IVM组(A组,n=13)和IVM-冻卵组(B组,n=24).分析卵母细胞的早期胚胎发育状况和单细胞水平的转录组学情况.结果 IVM后玻璃化冷冻-解冻对存活卵母细胞的早期胚胎发育没有明显影响,受精率、卵裂率、优质胚胎率和可移植胚胎率组间差异均无统计学意义.但IVM后行玻璃化冷冻-解冻对转录组存在一定影响,与A组相比,B组共有1913个基因呈现差异表达,其中570个基因表达量升高,主要富集到59个生物学过程;1343个基因表达量降低,主要富集到140个生物学过程,而且一些差异基因参与了卵母细胞质量、受精和胚胎发育潜能的调控.结论 IVM后行玻璃化冷冻-解冻对早期胚胎发育没有明显影响,但对转录组具有一定影响,且发生表达量变化的基因与卵母细胞质量、受精和胚胎发育潜能有关,提示玻璃化冷冻-解冻有可能影响子代安全性.
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卵母细胞固定、染色及压片方法研究
目的:建立卵母细胞(单细胞)固定、染色及压片方法.方法:应用显微操作技术,在体视显微镜下通过液滴法移动、洗涤和抗体孵育卵母细胞.结果:通过点柱法压片的方法成功建立了卵母细胞(单细胞)固定、染色及压片方法.共固定卵母细胞58枚,其中1枚丢失,l枚破损,成功率96.55％.结论:此制片方法解决了卵母细胞在固定、染色及压片中容易丢失和碎裂的问题,从而使卵母细胞和胚胎的实验室研究变得较为简单有效.
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小檗碱对心肌细胞IK1、IK及HERG通道的抑制作用
目的:研究小檗碱(Ber)对豚鼠心室肌细胞钾通道和动作电位作用,以及在蛙卵中表达的人的HERG通道的作用.方法:酶解方法分离单个心肌细胞,采用全细胞膜片箝方法记录钾离子电流及动作电位,基因箝技术研究HERG通道电流.结果:Ber可显著延长动作电位时程,并呈剂量依赖性.Ber 100μmol/L使APD90由对照的(450±48)ms延长至(888±90)ms(n=6,P＜0.01).Ber对IK1及IK呈剂量依赖性抑制作用.Ber100μmol/L对IK1的抑制率达65%±7%(n=6,P＜0.01).Ber50μmol/L对IK的抑制率达57%±6%;对IKtail的抑制率达53%±6%.Ber对IK作用呈现电压依赖性.Ber对在蛙卵中表达的HERG通道具有很强的阻断作用,IC50为75μmol/L,此阻断作用也呈电压依赖性.结论:Ber可使动作电位时程明显延长,对IK1及IK具有阻断作用.Ber可显著抑制HERG通道.Ber抗心律失常的机制与其抑制IK1、IK及HERG通道密切相关.
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异丙酚、芬太尼复合麻醉用于阴道取卵术的临床探讨
体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程,经阴道取卵术是一个重要的环节.为减轻患者在取卵过程中的忧虑、恐慌心理及疼痛感,2003年4～12月,我们对部分患者施行异丙酚加芬太尼静脉麻醉下经阴道取卵术,获得了良好的临床效果.
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冷冻载体及蔗糖浓度对复苏卵母细胞存活率的影响
目的:探讨MⅡ卵母细胞玻璃化冷冻和复苏过程中不同冷冻载体和不同蔗糖浓度解冻对卵母细胞存活率的影响.方法:收集2009年6月至2012年5月在成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心常规IVF治疗周期第1天没有受精的MⅡ卵母细胞853枚,进行玻璃化冷冻后复苏.按照实验过程中所用不同冷冻载体和不同解冻方法分为4组.A组79枚,载体为冷冻环,采用常规方法解冻；B组580枚,载体为半麦管,采用常规方法解冻；C组121枚,载体为冷冻环,采用改良法解冻；D组73枚,载体为半麦管,采用改良法解冻.将卵母细胞复苏2 h后观察,对各组卯母细胞存活率进行了比较.结果:C组卵母细胞存活率(97.52％)显著高于A组(72.15％)、B组(52.24％)和D组(64.38％)(P＜0.01)；A组卵母细胞存活率高于B组,差异显著(P＜0.05)；其余各组间卵母细胞存活率差异无统计学意义(P＞0.05).结论:采用冷冻环冷冻及改良法解冻能提高成熟卵母细胞存活率.
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巯基乙酸对爪蟾卵母细胞体外核成熟的影响
背景与目的:探讨巯基乙酸(thioglycolic acid,TGA)对孕酮诱导的爪蟾卵母细胞核成熟的影响.材料与方法:用不同浓度的TGA(5、25、125 μg/ml)在体外预处理爪蟾卵母细胞2 h后,再用孕酮诱导成熟,实验并设不经TGA预处理的对照组.在培养过程中观察卵母细胞的外观和核形态,以判断生发泡破裂(GVBD)情况;在培养结束时(加入孕酮后8 h),收集卵母细胞进行荧光染色.观察染色体的状态. 结果:经不同浓度TGA处理后卵母细胞的GVBD50 明显缩短,与对照组比较均具有统计学意义(P均<0.05),说明TGA加快卵细胞GVBD的发生;荧光染色观察GV期卵母细胞未见凝集的染色体,第一次减数分裂中期细胞可见赤道板形成,第二次减数分裂中期细胞除染色体赤道板外,还可见第一极体(PB1).经25 mg/ml和125 mg/ml浓度的TGA处理后,排出PB1的爪蟾卵母细胞比例明显降低(P<0.05),即抑制了MI-MII转变和第一极体的释放.结论:TGA可抑制孕酮诱导的爪蟾卵母细胞体外成熟.
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经皮染毒巯基乙酸对昆明小鼠排卵及体内卵母细胞成熟的影响
背景与目的:探讨巯基乙酸(thioglycolic acid,TGA)对昆明小鼠排卵以及卵母细胞体内成熟的影响. 材料与方法:选取昆明小鼠12只,按体重随机分成4组,每组3只,分别为对照组和TGA高(151.25 mg/kg)、中(75.625 mg/kg)、低(37.812 5 mg/kg)3个剂量组.给小鼠皮肤染毒TGA的同时腹腔注射10 IU人绒毛膜促性腺激素(hCG),14 h后,处死小鼠收集卵母细胞进行小鼠排卵计数,采用免疫荧光染色法观察成熟卵母细胞内纺锤体与皮质颗粒(conical germinal,CG)的分布. 结果:TGA高、中剂量组排卵数明显低于对照组及低剂量组(P<0.01及P<0.05);对照组和低剂量组小鼠卵母细胞纺锤体呈双极状,中、高剂量组纺锤体逐渐呈桶状,形态发生了明显改变,且随着TGA剂量的增加,纺锤体的面积有增加趋势;TGA对cG的膜下分布以及无皮质颗粒区(cortical germinal freedomain,CGFD)的形成在形态上没有明显影响.结论:经皮肤给TGA能抑制小鼠排卵,并对卵母细胞成熟有一定影响.
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巯基乙酸对小鼠成熟卵母细胞皮质颗粒分布和MAPK活性的影响
背景与目的:探讨巯基乙酸(thioglycolic acid ,TGA)对小鼠卵母细胞胞浆成熟和相关生化指标的影响.材料与方法:以不同浓度TGA(0.2、1.0、2.5 mmol/L)体外培养小鼠卵母细胞,并设M16培养液对照组,培养16 h后在体视显微镜下,观测卵母细胞生发泡破裂和第一极体排出情况,用免疫荧光染色方法对皮质颗粒(cortical granules,CGs)进行标记,采用western blot方法对p44/42MAPK进行检测.结果:各组生发泡破裂率均达到90%左右,各组间差异无统计学意义(P＞0.05).随着TGA剂量的增加,第一极体排出率下降,各剂量组和对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).各剂量组均可观察到CGs在细胞膜下的线状排列,但随着TGA吼剂量的增加,质膜下CGs的密度降低,胞浆中CGs的密度有增加的趋势.对照组卵母细胞中有非常明显的无皮质颗粒区(cortical granules free domain,CGFD)形成,0.2 mmol/L组也形成了CGFD,但1.0 matol/L和2.5 mmol/L两个剂量组未观察到CGFD.1.0 mmol/L和2.5mmol/L TGA可抑制p44/42MAPK的活化.结论:TGA可影响小鼠卵母细胞细胞质成熟和MAPK的活性,具有一定的生殖毒性.
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巯基乙酸对孕酮诱导爪蟾卵母细胞体外成熟过程中MAPK和MPF激酶活性的影响
背景与目的:探讨巯基乙酸(TGA)对孕酮诱导爪蟾卵母细胞体外成熟过程中丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和成熟促进因子(MPr)蛋白激酶活性的影响.材料与方法:用0、5、25和125 μg/ml浓度的TGA分别处理经孕酮诱导的体外培养爪蟾卵母细胞,另设不含孕酮的阴性对照组,于处理4 h和8 h收集卵母细胞进行Western Blotting检测,观察p-Erkl/Erkl蛋白、p-RSK蛋白、Cdc2、p-Cdc2和Cyclin BI蛋白的表达情况.结果:TGA处理爪蟾卵母细胞4 h后,Erkl蛋白的磷酸化水平(即MAPK的活性水平),较对照组明显增加(P＜0.05);MAPK的活性底物p-RSK蛋白的表达也增加(P＜0.05);同时伴随着p-fAc2表达水平的下降和Cyclin B1蛋白表达的增强(P＜0.05).TGA处理8 h后Erkl蛋白磷酸化水平和p-RSK蛋白含量与对照组相比无明显差异(P＞0.05),但此时TGA组p-Cdc2水平明显增加(P＜0.05),Cyclin BI蛋白的表达降低(P＜0.05).结论:在孕酮诱导的爪蟾卵母细胞体外成熟早期,TGA可促进MPF和MAPK蛋白激酶及其底物p-RSK的活化;在成熟的晚期,TGA对MAPK活性无明显影响,但明显抑制MPF活性.TGA影响MPF活性的可能机制是降低Cyclin B1蛋白水平.
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氟哌啶醇对小鼠卵母细胞染色体的影响
背景与目的:探讨抗精神病药氟哌啶醇(Haloperidol,Hal)在卵子发生过程中对卵母细胞染色体的影响.材料与方法:将40个12周龄健康雌性小鼠随机分为4组,分别按0、0.05、0.50、5.00 mg/(kg·d)腹腔注射Hal,连续注射8 d,通过超排收集卯母细胞,制备染色体标本进行核型分析.结果:对照组、0.05、0.50、5.00 mg/(kg·d)组的实验参数分别为,①超单倍体率:3.8%、4.4%、7.3%、18%;②非整倍体率:7.5%、8.8%、14.5%、36.0%;③退化卵母细胞率:1.3%、1.4%、1.8%、10.0%;④染色体分离均数:0.013、0.014、0.018、0.100.0.05、0.50 mg/(kg·d)组分别与对照组比较,各实验参数间的差异没有统计学意义(P＞0.05).5.00 mg/(kg·d)组各实验参数值均比对照组高,其差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:大剂量Hal有可能诱发卵母细胞非整性增加并引起卵母细胞退化.
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HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞的研究
背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病.为了探索乙肝病毒通过卵母细胞垂直传递的可能性,对HBV DNA重组质粒能否转染小鼠卵母细胞进行了研究.材料与方法:将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA重组质粒进行共培养后,分别提取卵母细胞DNA及制备小鼠卵母细胞中期染色体.用PCR、Southern、斑点杂交及FISH技术证实HBV DNA能否转染小鼠卵母细胞.结果:PCR试验在受检样本中观察到HBV DNA阳性条带.Southern试验在受检PCR产物中观察到明显的阳性杂交信号.用每次实验的后3次洗液进行斑点杂交未发现HBV DNA阳性信号,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性.荧光原位杂交在1 000个卵母细胞中的36个中期相内发现HBV DNA杂交信号.结论:HBV DNA序列能够通过卵母细胞的透明带和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到卵母细胞染色体上.此类卵母细胞与正常精子受精时,有可能作为载体将HBVDNA带进胚胎.
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Dynein抑制剂对卵母细胞体外成熟及cyclinB1 mRNA水平的影响
背景与目的:胞浆 Dynein(动力蛋白)做为微管负极方向的马达蛋白在细胞增殖进程中发挥重要作用.本实验采用原钒酸钠特异抑制 Dynein生物活性后,观察卵母细胞体外培养成熟率和cyclinB1基因转录水平变化,探讨 Dynein功能异常对卵母细胞成熟分裂进程的影响及相关机制.材料与方法:应用卵母细胞体外培养成熟技术、半定量RT_PCR和单细胞RT_PCR方法,分别检测加入 Dynein抑制剂前后卵母细胞成熟率和cyclinB1基因转录水平的变化.结果:12 h量效实验结果证实,不同浓度原钒酸钠作用后,5 μmol/L原钒酸钠即可明显降低小鼠卵母细胞成熟率,0～400 μ mol/L卵母细胞成熟率随着剂量的增加而显著减少;同时检测发现,50～500 μ mol/L原钒酸钠组卵母细胞cyclinB1 mRNA表达呈剂量依赖性增加.时程结果表明,卵母细胞与400 μmol/L原钒酸钠作用 1 h 以上,卵母细胞成熟率明显减少;体外分别培养4 h或 8 h后再放入含有原钒酸钠培养基中培养至 12 h,仍可明显抑制卵母细胞第一极体排放. 400 μ mol/L原钒酸钠作用后,卵母细胞内 cyclinB1 mRNA时程表达水平与对照组相比,呈明显反向变化.结论: Dynein抑制剂诱导体外培养的卵母细胞减数分裂阻滞,成熟促进因子 (MPF)活性改变可能是 Dynein功能丧失后引起减数分裂停滞的一个机制.
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脂质体介导外源DNA体外转染金黄地鼠卵母细胞的研究
背景与目的:研究外源DNA在金黄地鼠卵母细胞染色体上的整合率,探索卵母细胞作为外源基因载体的可行性.材料与方法:在体外,用脂质体包裹外源NF-Luc质粒,将其与金黄地鼠卵母细胞共培养后收获细胞,分别用斑点杂交、Southern杂交以及荧光原位杂交分析检测Luc+基因在卵母细胞中的整合.结果:Southrn杂交分析,在13个样本DNA中发现9个样本有Luc+基因特异性条带扩增;阳性率为69.2%(48.2%～94.5%),荧光原位杂交分析显示,在253个转染后卵母细胞中发现,2例中期相染色体及3例间期核上有明显的Luc+基因阳性杂交信号.结论:在国内首次证实金黄地鼠卵母细胞可被脂质体包裹的外源DNA转染,即金黄地鼠卵母细胞可以作为外源基因的载体,这一新途径为研究外源基因在金黄地鼠卵母细胞中的表达提供了实验基础.
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小鼠体外成熟与激素超排卵母细胞核型分析
目的: 评价激素超排(HIO)和体外培养成熟(CVM)两种方法对小鼠卵母细胞染色体的影响. 方法: 通过HIO与CVM分别获得100个、80个成熟小鼠卵母细胞,制备染色体标本进行核型分析. 结果: 在HIO组,超单倍体率、非整倍体率、染色体结构畸变率、结构畸变卵母细胞率、退化卵母细胞率和染色体分离均数依次为2.0 %、4.0 %、2.0 %、2.0 %、8.0 % 和0.13;在CVM组,上述实验参数依次为4.0 %、8.0 %、7.5 %、6.3 %、12.5 %和0.325;两组所有实验参数经统计学处理没有显著差异. 结论: 经体外培养成熟的与经激素超排的小鼠卵母细胞其质量和染色体核型没有本质上的差异.将此结果外推到人类,提示未成熟卵母细胞经体外培养成熟在人类辅助生殖领域具有广泛的应用前景.
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乙型肝炎病毒垂直传播新途径的研究
垂直传播是指患者的生殖细胞受病毒感染,在受精时由精子或卵细胞作为载体,将病毒基因带到胚胎进而使子代患病的一种新的、尚待证实的传播方式.近年来成为相关领域的研究热点.本文综述了近年来垂直传播研究取得的进展并对研究前景进行了展望.
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叶酸对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
背景与目的:探讨叶酸(folic acid,FA)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响.材料与方法:实验设次黄嘌呤(hypoxanthine,Hx)处理小鼠体外卵母细胞的卵母细胞成熟抑制模型组(Hx 4 mmol/L+M16培养液)、FA组(500μmol/L FA+4 mmol/L Hx+M16培养液)和M16培养液组,各组卵母细胞培养24 h后.在体视显微镜下观测卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)和第一极体(the first polar body,PB1)排出情况.采用免疫荧光染色方法观察染色体和纺锤体的形态结构.结果:M16培养液组、Hx模型组和FA处理组的GVBD率分别为98%、22.2%、40.1%,其PBl排出率分别为77.7%、15.5%、27.6%,各组间的差异均具有统计学意义(P<0.05);次黄嘌呤和叶酸对染色体的形态没有影响,而次黄嘌呤使正常的纺锤体变长、变宽、面积变大,FA组较Hx模型组增大的纺锤体有所恢复,并接近于正常水平.结论:叶酸可促进小鼠卵母细胞体外减数分裂的重启和成熟.
