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迎接新一代测序时代的到来
DNA测序技术的发展为揭开人类和其他生物遗传密码提供了重要技术支撑,是分子生物学及其相关学科研究中重要的技术之一[1-4].从20世纪70年第一代测序技术的出现以来,近几年高通量测序技术飞速发展,不仅可以探讨物种基因表达之间的差异,而且为生命科学诸多研究领域提供了强有力的工具.基于新一代测序技术的胚胎植入前遗传学检测技术磅礴发展[5-6],使新一代测序技术应用于临床、造福人类取得突破性进展,使得基于芯片平台的微阵列比较基因组杂交技术(array-CGH)在胚胎植入前遗传学检测和产前诊断的应用是否会被新一代测序技术所取代面临前所未有的挑战.
关键词： 新一代测序 植入前遗传学诊断 植入前遗传学筛查 微阵列比较基因组杂交 -
重视植入前遗传学诊断及筛查技术的安全性
自1990年世界上诞生第1例植入前遗传学诊断(PGD)试管婴儿至今,已有25年的历史.植入前遗传学诊断是对胚胎进行遗传学分析和诊断,去除有遗传缺陷的胚胎,选择诊断正常的胚胎植入子宫的一种诊断方法.PGD将遗传学技术与辅助生殖技术相结合,将遗传病诊断提前到胚胎植入宫腔之前,避免了因选择性流产给妇女及其家庭带来的伤害.另外,对于反复流产、反复种植失败的夫妇,可以利用植入前遗传学筛查(PGS)技术选择诊断正常胚胎移植以改善临床结局.因此,PGD、PGS在辅助生殖技术中越来越受到重视.
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国外植入前遗传学诊断指南解读
1990年世界首例植入前遗传学诊断(PGD)试管婴儿的出生标志着人类辅助生殖技术的突破性进展.近10年来,随着单细胞全基因组扩增技术及分子遗传学诊断技术的改进,植入前遗传学诊断技术得到迅速发展及广泛应用.2008年PGD国际协会(PGDIS)公布的数据显示,可进行植入前遗传学诊断的单基因疾病种类约170种.目前国内尚缺乏植入前遗传学诊断技术规范,本文以“consensus”or“guideline”,and“PGD”or“PGS”为关键词检索了2010年至今的关于国外植入前遗传学诊断技术规范或指南相关文献,并就此解读.
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玻璃化冷冻人活检后不同发育时期胚胎的研究
目的:探讨玻璃化冷冻法应用于人活检后不同发育时期胚胎冻存的可行性及佳的冷冻时期.方法:选择体外授精-胚胎移植周期病人授精后第3天的废弃胚胎,随机分为活检组和对照组,活检组胚胎采用抽吸法活检1个卵裂球,对照组胚胎不活检,而后分别继续培养至卵裂期、融合期和囊胚期进行玻璃化冷冻,比较两组各时期胚胎解冻后的复苏效果和继续发育潜力.结果:玻璃化冻融后的活检组卵裂期、融合期和囊胚期胚胎,其解冻复苏率、完整复苏率和继续发育能力均与对照组无显著差异,但活检组卵裂期胚胎卵裂球复苏率显著低于对照组(82.1％ vs88.5％,P=0.001);活检组和对照组融合期胚胎完整复苏率均显著高于卵裂期和囊胚期胚胎(P<0.05).结论:玻璃化冷冻法可以成功应用于人活检后胚胎的冻存,融合期是玻璃化冻融复苏效果稳定的时期.
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全基因组扩增技术的研究进展
全基因组扩增可增加微量DNA分析的遗传信息量,为实现微量DNA多基因位点分析和重复检测提供了可能,目前已应用于植人前遗传学诊断、母体外周血胎儿细胞产前遗传学分析,及肿瘤基因分析等领域研究,是一项非常有价值的技术.
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三核苷酸重复疾病与植入前遗传学诊断
三核苷酸重复疾病(TRD)是指由于致病基因三核苷酸重复序列拷贝数目的不稳定而异常扩增导致的一类常见的遗传性疾病.它包括多种神经系统变性性疾病,尤其是脊髓小脑性共济失调(SCA).采用PCR或FISH技术的植入前遗传学诊断(PGD)通过对遭受多种单基因遗传病威胁的早期胚胎的检查而从根本上避免患病后代的产生,具有广阔的临床应用前景.
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跨断裂点探针及其在胚胎植入前遗传学诊断研究进展
植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是产前诊断的一种新方案,理论上可避免以往产前诊断有异常而不得不终止妊娠的遗憾.染色体异常是PGD的很重要一部分,其中的染色体结构异常是PGD的难点之一.用目前商业化的探针不能区分正常和平衡易位的核型,针对各个病例的跨断裂点探针能区分这两种核型.本文就跨断裂点探针的技术路线、应用实例及其应用前景作一简要介绍.
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植入前遗传学诊断的结局和安全性
植入前遗传学诊断(PGD)是目前辅助生殖技术的重要组成部分,主要用于遗传高风险夫妇植入前胚胎的选择.自1990年第1个PGD婴儿诞生以来,PGD技术对临床结局及子代安全性的影响已成为目前众多学者所关心的问题.本文从不同活检时期、植入前遗传学筛查以及活检后胚胎冷冻等几个方面,详述了PGD的临床结局及后代安全性等问题.
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单基因遗传病的植入前遗传学诊断研究进展
近十多年来，单基因遗传病的植入前遗传学诊断(PGD)已取得了显著的成绩，其基本技术包括胚胎活检、PCR和FISH。本文就PGD的研究概况、活检标本来源、以PCR技术为基础的各类诊断技术的研究进展、影响PGD准确性的原因及未来的发展作一综述。
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SNP单体型分析在单基因遗传病PGD中的应用
目的 探讨单核苷酸多态性(SNP)单体型分析在单基因遗传病植入前遗传学诊断(PGD)中的临床应用价值.方法活检囊胚滋养层细胞全基因组扩增产物,应用SNP单体型分析方法进行诊断,并用Sanger测序进行验证.结果共205枚胚胎同时完成了SNP单体型分析和Sanger测序验证,155枚胚胎(75.61％)诊断结果一致,18枚胚胎(8.78％)诊断结果不一致.Sanger测序失败有30枚胚胎(14.63％),单体型分析有2枚胚胎(0.98％)失败,后者诊断失败率明显低于前者(P<0.05).41个移植周期共45枚胚胎移植,临床妊娠率为70.73％(29/41),种植率为71.11％(32/45).胎儿中孕期羊水产前诊断结果与胚胎单体型分析诊断结果一致.结论SNP单体型分析准确性好,与Sanger测序相比,其失败率较低,能够有效用于临床单基因病PGD.
关键词： 单基因遗传病 植入前遗传学诊断 单核苷酸多态性单体型分析 -
用荧光原位杂交技术进行染色体异常者胚胎植入前遗传学诊断
目的:初步探索应用荧光原位杂交(FISH)技术为染色体异常患者进行胚胎植入前遗传诊断(PGD).方法:针对染色体结构异常的种类,分别选择亚端粒探针及着丝粒探针,用荧光原位杂交技术为5例染色体异常患者进行植入前遗传学诊断.结果:5例患者共行7个PGD周期,共获卵134个,活检47个胚胎,FISH分析可供移植胚胎16个,6个移植周期移植其中15个胚胎,获得1例临床妊娠,并经产前诊断验证,已顺利诞生1健康男婴.结论:荧光原位杂交技术能有效地应用于染色体异常者胚胎植入前遗传学诊断.
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针对染色体易位携带者的微阵列比较基因组杂交-植入前遗传学诊断技术的建立与应用
目的:应用微阵列比较基因组杂交技术(array-CGH)对染色体平衡易位携带者进行胚胎植入前遗传学诊断,探讨其临床应用价值.方法:应用荧光原位杂交技术(FISH)对染色体易位携带者D3胚胎进行检测,对结果为异常且发育到囊胚的15枚胚胎应用array-CGH再次检测,建立array-CGH技术平台,再将array-CGH技术应用于染色体平衡易位携带者胚胎植入前遗传学诊断.结果:对经过FISH检测为异常且发育到囊胚的15枚胚胎进行全基因组扩增(WGA)后采用array-CGH技术进行检测,发现array-CGH技术不仅能够检测到FISH结果对应的数目异常和结构异常,还可以发现除FISH诊断的染色体异常外其他染色体异常.其对于相互易位病例不平衡易位断裂点检测的结果与对易位携带者的核型分析结果一致.应用array-CGH技术对5对染色体易位携带者夫妇的31枚胚胎进行胚胎植入前遗传学诊断,30枚获得检测结果,1对夫妇移植1枚整倍体胚胎后获得妊娠,羊水染色体分析提示胎儿染色体核型正常.结论:通过全基因组扩增以及array-CGH技术,对染色体平衡易位携带者胚胎进行植入前遗传学诊断,能够全面评估胚胎染色体的情况,具有良好的临床应用前景.
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植入前遗传学诊断妊娠成功
目的:探索建立植入前遗传学诊断技术.方法:对2例高龄输卵管性不孕患者,单精子卵细胞浆内注射,卵裂球活检,染色体21、X、Y三色荧光原位杂交,胚胎遗传学分析后,选择染色体正常胚胎移植.结果:20 d后血HCG>1 000 IU/L,孕50 d B超见子宫腔内单胎妊娠并见心搏,孕16周B超检查显示胎儿生长、结构正常.结论:植入前遗传学诊断移植2例,临床妊娠成功.
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我校医学院附属妇产科医院一项技术获得国家发明专利
浙江大学申报的一项以徐晨明博士和黄荷凤教授为技术发明人的"一种单个卵裂球的染色体制备方法" 国家发明专利近期获得授权.这项基于克隆技术的染色体检测方法,在染色体病的植入前遗传学诊断(PGD)领域有着诱人的应用前景.
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罗氏易位患者通过植入前遗传学诊断获妊娠
目的 通过胚胎植入前遗传学诊断(PGD)技术使遗传性不孕不育夫妇获得后代.方法 1例原发性不孕、慢性输卵管炎患者行常规体外受精和胚胎移植(IVF-ET)失败后,夫妇双方检查染色体核型,男方为罗氏易位,45,XY,t(13;14).对卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)受精后第3天适宜活检的胚胎进行逐个活检,每个胚胎取出1个卵裂球,经细胞裂解及细胞核固定,使用13号染色体位点特异性探针、14号染色体端粒探针与变性后核内染色体杂交,对荧光信号进行分析.13号及14号染色体均有两个信号的为正常或平衡的易位携带者,选择这两种可能的胚胎给予移植.结果 超促排卵后取卵20个,成熟18个,ICSI后正常受精16个,第3天适宜胚胎活检的有12个,13号及14号染色体信号均两个的胚胎 6个,第4天移植3个致密桑椹期胚胎,1个致密桑椹期胚胎行玻璃化法冷冻,另2个因检查为正常胚胎未继续发育而被丢弃.移植后14 d尿人体绒毛膜促性腺激素(HCG)阳性,移植后35 d阴道超声见1个孕囊并可见胚芽及原始心管搏动,为单胎妊娠.结论 针对13号及14号染色体易位的检查于活检后24 h内出结果,罗氏易位患者可通过PGD技术获得后代.
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植入前遗传学诊断中单卵裂球固定方法的相关研究
目的 以人类受精胚胎单卵裂球为对象,对传统低渗固定法进行改良,探讨一种更简便效率更高的固定方法.方法 收集30枚人类多精受精胚胎激光打孔后去除透明带,将获得的完整卵裂球按传统低渗固定法和直接固定法进行固定后行X,Y染色体双色荧光原位杂交,比较固定率和杂交率.结果 固定卵裂球共171枚.低渗固定法(A组)固定80枚,成功68枚,成功率为85.0%.直接固定法(B)组固定91枚,成功82枚,成功率为90.1%.两组差异有显著性.A组杂交率为77.5%(每卵裂球数),91.2%(每核数),B组杂交率为83.5%(每卵裂球数)92.7%(每核数).两组差异无显著性.结论 直接固定法简化了固定步骤,降低了细胞丢失率,为较理想的单个卵裂球间期核固定技术.
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植入前遗传学诊断中的胚胎活检技术应用进展
植入前遗传学诊断(PGD)主要是对体外受精(IVF)后发育到6～8细胞的胚胎,在显微操作系统下活检其中的1～2个卵裂球或对囊胚期胚胎活检其滋养外胚层细胞,应用聚合酶链反应(PCR)或荧光原位杂交(FISH)技术进行快速的遗传学诊断后,选择正常健康的胚胎植入子宫内,从而获得健康的胎儿.PGD是辅助生育技术与分子生物学相结合而形成的一种较早期的产前诊断方法,给大多数目前无法治愈的遗传病,主要是单基因遗传病和染色体疾病提供了一种有效的治疗预防手段,有效地阻断了致病基因的垂直传播,降低了人群中致病基因的遗传负荷;同时为不愿接受终止妊娠的患有遗传病的高危夫妇提供了一种选择手段,能够有效地减少高危夫妇因终止妊娠而带来的心理压力和生理上的痛苦.广义上的PGD还包括:在受精前对配子的诊断如精子的筛选、分离,精子或卵子的基因型直接检测,极体的活检等.目前,世界范围包括我国在内约50个有能力进行PGD的生殖中心,除了对精子或卵子的基因型直接检测没有在临床上应用成功外,其他技术均有在临床上应用成功的报道.
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罗伯逊易位携带者胚胎植入前遗传学诊断
目的:了解罗伯逊易位携带者进行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)的价值.方法:应用荧光原位杂交方法(FISH),采用位点特异探针(LSI)和端粒探针(Tel)对3例罗伯逊易位患者的卵裂球进行PGD分析,并选择正常或平衡胚胎移植人子宫.结果:共进行5个PGD周期,获卵145个,正常受精率81.1%,卵裂率92.5%,优质胚胎率88.9%.5个周期共移植11个胚胎,1例获得妊娠.获妊娠者孕20周后经羊水细胞核型分析,证实为正常/平衡,现已分娩健康婴儿.结论:PGD是罗伯逊易位携带者获得正常后代的有效途径.
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克氏综合征患者胚胎植入前遗传学诊断的临床价值
目的 探讨新一代高通量测序植入前遗传学诊断(NGS-PGD)对于克氏综合征患者的临床应用价值.方法 采用新一代高通量测序技术对5例克氏综合征患者的囊胚进行了全部23对染色体的检测,取同期因反复流产行植入前遗传学筛查的20例患者作为对照,比较两组患者的临床资料.结果 两组患者的女方年龄、平均获卵数、MⅡ 率、卵裂率和可利用囊胚形成率间差异均无统计学意义(均P>0.05);克氏综合征组的受精率明显低于反复流产组(62.6％vs.77.0％,P<0.05),克氏综合征组的染色体非整倍体率低于反复流产组,但差异无统计学意义(29.4％vs.39.0％,P>0.05).在克氏综合征组检测的17个囊胚中,未发现性染色体异常,5个异常的囊胚均为常染色体的非整倍体.结论克氏综合征患者囊胚中性染色体异常比例极低,并不一定需要专门针对性染色体进行检测,但鉴于其存在一定的常染色体非整倍体发生率,植入前遗传学诊断仍具有一定的实用价值.
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运用单细胞三重PCR对杜氏肌营养不良进行植入前遗传学诊断
目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的可行性.方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因.结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0.结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用.
