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细胞膜穿透肽促进脂质体包载的siRNA细胞内转运、定位及其功能
目的研究细胞膜穿透性寡肽--八聚精氨酸(R8)输送包载siRNA的脂质体进入细胞能力的促进作用.方法将合成的R8与PEG-PE形成偶联物并定向定量地插入包载siRNA脂质体的外层膜上制成R8-liposomalsiRNA.荧光分光光度计测定脂质体中R8的含量,荧光倒置显微镜观察R8修饰的脂质体与常用转染试剂lipofectamine 2000携带siRNA对小细胞肺癌NCI-H446的转染效果,MTT法检测R8-liposomal siRNA对NCI-H446细胞的生长抑制作用.结果R8未修饰的脂质体不能穿过细胞膜,而R8修饰的脂质体则能迅速进入细胞内,随着作用时间的延长逐渐定位在细胞浆和细胞核.R8修饰的脂质体介导hdm2-siRNA转染肿瘤细胞的效率和对肿瘤细胞的生长抑制作用明显强于lipofectamine 2000.结论R8修饰的脂质体可以有效输送siRNA进入细胞并增强其生物学功能.
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转录信号转导子与激活子3小分子干扰RNA增强乳腺癌对多柔比星的药物敏感性
目的 进一步明确转录信号转导子与激活子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)信号通路在调节乳腺癌多柔比星耐药中的作用,促进转录信号转导子与激活子3信号通路抑制剂在逆转肿瘤耐药方面的临床应用.方法 首先在临床乳腺癌组织标本水平,应用Western blotting检测转录信号转导子与激活子3与活化磷酸化转录信号转导子与激活子3(phosphorylated STAT3,pSTAT3)的表达水平,同时应用RT-PCR及Western blotting检测转录信号转导子与激活子3/磷酸化转录信号转导子与激活子3在乳腺癌敏感及耐药细胞中的表达水平;再应用小分子干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)技术阻断转录信号转导子与激活子3表达,通过Western blotting方法检测转录信号转导子与激活子3-小分子干扰RNA对转录信号转导子与激活子3表达的影响;后分别应用细胞免疫荧光法和四甲基偶氮唑蓝法,检测阻断转录信号转导子与激活子3表达后,乳腺癌细胞的增殖活性及IC50值,从而观察转录信号转导子与激活子3-小分子干扰RNA是否能够抑制乳腺癌细胞增殖,以及能否增强乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性.结果 转录信号转导子与激活子3/磷酸化转录信号转导子与激活子3在肿瘤组织以及在多柔比星敏感及耐药的乳腺癌细胞中均呈现高水平表达,并且在多柔比星耐药乳腺癌细胞中的表达高于在相应敏感细胞中的表达水平.转录信号转导子与激活子3-小分子干扰RNA明显下调转录信号转导子与激活子3蛋白表达,并抑制了敏感乳腺癌细胞的生长.转录信号转导子与激活子3-小分子干扰RNA和多柔比星联合应用后,与单独应用多柔比星比较,使多柔比星耐药乳腺癌细胞的IC50降低了4倍,同时抑制了转录信号转导子与激活子3信号通路介导的抗凋亡蛋白的表达.结论 转录信号转导子与激活子3信号通路活化与乳腺癌发生相关,在多柔比星耐药乳腺癌细胞中显著活化,阻断乳腺癌多柔比星耐药细胞中转录信号转导子与激活子3信号通路可提高其对多柔比星的敏感性,并促进细胞凋亡.本试验为探索阻断转录信号转导子与激活子3信号通路逆转肿瘤耐药的可行性,以及临床联合应用转录信号转导子与激活子3抑制剂与化疗药物克服肿瘤细胞多药耐药现象提供实验基础.
关键词： 转录信号转导子与激活子3 乳腺癌 耐药 多柔比星 小分子干扰RNA -
小分子干扰RNA沉默髓样细胞触发受体1对内毒素诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7分泌炎性因子的影响
目的 利用小分子干扰RNA探讨髓样细胞触发受体1在内毒素刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β中的作用 .方法 设计并合成干扰率高的小分子干扰RNA,以pLKO1.1为载体构建pLKO1.1-髓样细胞触发受体1干扰质粒将小鼠巨噬细胞株RAW264.7分为4组:空白组；内毒素组；空质粒组(pLKO1.1组):采用脂质体法将pLKO1.1转染细胞；干扰组(小分子干扰RNA组):将pLKO1.1-髓样细胞触发受体1转染细胞,内毒素刺激24 h后实时定量PCR分别检测髓样细胞触发受体1、肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β的mRNA水平；以ELISA法分别检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β含量.结果 与内毒素组比较,小分子干扰RNA组细胞中髓样细胞触发受体1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的mRNA含量显著下降(P＜0.01)；细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β含量明显降低(P＜0.01).结论 小分子干扰RNA可能通过抑制髓样细胞触发受体1基因的表达而减少内毒素诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的分泌.
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siRNA分子非病毒载体的生物体内给药系统
目的 综述小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)经非病毒载体介导生物体内给药的研究进展.方法 查阅国内外相关文献,进行分析、归纳和综述.结果 与结论 siRNA分子由于其本身的特性,生物体内给药必须借助合适的给药系统,相对病毒载体,非病毒载体具有简便,安全和毒性小等特点,易于为临床所接受,因而近年来发展迅速.
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RNA干扰血管内皮生长因子受体2基因表达提高结肠癌细胞对奥沙利铂敏感性的研究
目的 研究RNA干扰血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)基因表达对人结肠癌细胞生长的抑制作用和对奥沙利铂的化疗增敏作用.方法 构建靶向VEGFR-2基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染人结肠癌细胞株SW480;通过RT-PCR和Western blot方法检测VEGFR-2 siRNA对人结肠癌细胞株SW480 VEGFR-2mRNA和蛋白表达的影响;采用MTT实验和流式细胞术检测该siRNA及协同奥沙利铂对细胞增殖及凋亡的影响.结果 VEGFR-2 siRNA显著下调结肠癌细胞VEGFR-2 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05).VEGFR-2siRNA协同奥沙利铂使结肠癌细胞的生长变得更加缓慢,增殖受到明显抑制,细胞抑制及凋亡明显增强(P＜0.05).结论 RNA干扰VEGFR-2基因表达可以抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖,促进其凋亡,并能提高结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性.
关键词： 结肠癌 血管内皮生长因子受体2 小分子干扰RNA 奥沙利铂 -
染色体驱动蛋白KIF4A稳定低表达胃癌细胞系的构建及鉴定
目的 构建稳定低表达染色体驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞系,观察KIF4A低表达细胞的有丝分裂期纺锤体中央区的形成.方法 针对人类驱动蛋白KIF4A mRNA的编码区设计特异性siRNA序列,构建KIF4A短发夹RNA(shRNA)表达质粒pGPU-GFP-KIF4A.将质粒转染胃癌细胞SGC-7901,经过G418筛选获得稳定低表达KIF4A的细胞株.使用蛋白免疫印迹方法鉴定细胞株内KIF4A蛋白的敲降效果,并通过细胞免疫荧光染色法观察细胞纺锤体中央区的形成.结果 成功获得了3株不同水平稳定低表达KIF4A的SGC-7901细胞株(SGC-shKIF4A)和稳定表达无意义shRNA的对照细胞(SGC-shNC);同时,与对照细胞SGC-shNC相比,SGC-shKIF4A细胞中有丝分裂纺锤体中央区延长,并随KIF4A蛋白表达水平的降低而增加.结论 成功构建了不同水平稳定低表达KIF4A蛋白的胃癌细胞SGC-shKIF4A,为进一步研究驱动蛋白分子KIF4A的功能及其在胃癌发生发展过程中的作用奠定基础.
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siRNA给药途径的研究进展
RNA干扰(RNAi)通过在生物体细胞内导入外源性或内源性的双链RNA,使同源性mRNA降解、抑制特定基因表达而治疗某些基因异常所致的疾病,近年来已成为研究热点之一.文章就小分子干扰RNA(siRNA)的病毒载体给药、非病毒载体给药途径及优缺点做一综述.
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靶向siRNACD31-脂质体复合物对人肺微血管内皮细胞PECAM-1表达的影响
目的 研究以血管内皮细胞为靶向的siRNACD31对血小板内皮黏附分子1(PECAM-1)表达及细胞增殖的影响.方法 实验分为裸siRNACD31组、siRNACD31-FAM组、稳定阴性对照(SNC)组、空白对照组.实验以阳离子脂质体(RNAi-mate)为载体,将2 '-O-甲基修饰的siRNACD31转染体外培养的人肺微血管内皮细胞(HPMVEC),四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测siRNACD31对HPMVEC增殖的影响,RT-PCR、Western blot检测PECAM-1的表达水平.结果 裸siRNACD31和siRNACD31-FAM转染的HPMVEC的PECAM-1 mRNA、PECAM-1蛋白的表达量、HPMVEC的增殖率均低于SNC组和空白对照组(P值均＜0.01),裸siRNACD31和siRNACD31-FAM转染的HPMVEC的PECAM-1 mRNA、PECAM-1蛋白的表达量、HPMVEC的增殖率差异无统计学意义(P值均＞0.05).结论 靶向siRNACD31可下调HPMVEC的PECAM 1 mRNA和蛋白的表达,并可抑制HPMVEC细胞的增殖,2'-O-甲基修饰的siRNACD31可作为沉默靶基因PECAM-1的有效的技术手段,RNAi-mate可作为siRNACD31的转染靶基因的载体,PECAM-1可能是干预肺癌癌细胞微环境中的微血管内皮细胞功能的潜在靶标.
关键词： 小分子干扰RNA 内皮细胞 血小板内皮细胞黏附分子1 靶向 细胞增殖 -
体外实验观察小分子干扰RNA对胶质瘤U251细胞血管内皮生长因子表达的影响
目的:血管内皮生长因子能促进血管内皮细胞增生和血管形成,而RNA干扰技术可高效特异地导致转录后基因沉默现象.实验针对人血管内皮生长因子基因化学合成小分子干扰RNA,观察其对胶质瘤U251细胞的体外干扰效应.方法:实验于2006-09/2007-02在中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室完成.①实验材料:人类U251胶质母细胞瘤细胞株由上海市肿瘤研究所朱景德教授惠赠.非特异性小分子干扰RNA,绿色荧光标记的FAM negative control siRNA(上海吉玛公司).②实验方法:选择基因序列号为NM0033761的血管内皮生长因子基因cDNA序列上的3个位点设计3条不同序列的小分子干扰RNA,并应用BLAST技术排除其他同源基因.采用脂质体法转染U251细胞,以200 hmol/L进行转染,以转染非特异性小分子干扰RNA作为阴性对照组,以未加入小分子干扰RNA作为空白对照组.48 h后RT-PCR筛选佳小分子干扰RNA,将抑制率高的小分子干扰RNA再分别按50,100,200,300 nmol/L进行转染.③实验评估:荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR法半定量检测浓度梯度下小分子干扰RNA对U251细胞血管内皮生长因子mRNA表达的抑制效果.结果:①荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率:镜下可见胞质内的绿色荧光,同一视野下细胞核呈蓝染,转染效率达95%以上.②RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达水平:不同序列的小分子干扰RNA以200 nmol/L转染细胞后血管内皮生长因子mRNA的表达水平均有所下调,以小分子干扰RNA1转染组为明显(P＜0.01),抑制率大于70%,选为佳特异性小分子干扰RNA.U251细胞转染50,100,200,300 nmol/L的小分子干扰RNA1 48 h后,随着转染浓度的升高,小分子干扰RNA1的抑制效果逐渐增强,各浓度转染组血管内皮生长因子mRNA的表达水平可下调16%～73%.结论:以血管内皮生长因子为靶基因、化学修饰合成的特异性小分子干扰RNA,在体外可有效抑制目的基因mRNA的表达.
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Smad4 siRNA对转化生长因子β诱导Ⅰ型胶原表达的作用
背景:近期研究表明,阻断smad传导通路可能成为一个阻断转化生长因子β引起的肝纤维化的新的靶点.目的:验证Smad4小分子干扰RNA(siRNA)对转化生长因子β诱导的Ⅰ型胶原的作用.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2008-10在哈尔滨医科大学药学院完成.材料:肝星状细胞HSC-T6体外培养,siRNA和荧光素酶报告基因采用Lipofectamine试剂转染,以含巨细胞病毒-β-半乳糖苷酶质粒作为转染阳性对照.方法:根据不同处理将细胞分为4组,空白对照组;Smad4 siRNA转染组;转化生长因子β处理组:Smad4 siRNA转染后转化生长因子β处理组,将Smad4 siRNA转染入肝星状细胞后行转化生长因子β刺激.各组分别于培养24 h后收集细胞.主要观察指标:利用荧光素酶报告基因法测定Smad结合转写因子(4XSBE)的活性;反转录-聚合酶链反应法检测Ⅰ型胶原mRNA表达的变化;Western印迹分析观察Smad4蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的变化.结果:Smad4 siRNA有意义的抑制Smad4蛋白表达;Smad4 siRNA抑制转化生长因子β诱导的4XSBE转录报告基因的活性:Smad4 siRNA从mRNA和蛋白水平有效抑制转化生长因子β激活的Ⅰ型胶原的表达.结论:Smad4 siRNA能够有效地阻断转化生长因子β诱导的Ⅰ型胶原表达.
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质粒表达型小分子干扰RNA对人肾小管上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1抑制作用的研究
目的 研究质粒表达型小分子干扰RNA(siRNA)对人肾小管上皮细胞(HKC)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的抑制作用.方法 2002年2～7月对同济大学附属东方医院针对人MCP-1 mRNA 67、116、142位点设计并合成的3对MCP-1 siRNA序列,构建MCP-1特异性siRNA真核表达载体pRNAT-MCP-1-Ⅰ、pRNAT-MCP-1-Ⅱ、pRNAT-MCP-1-Ⅲ,以脂质体法转染至HKC,转染24h后分别采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot技术检测HKC内MCP-1 mRNA、蛋白表达.结果 siRNA表达载体的转染效率为60%,与正常对照组相比,3组不同质粒表达型siRNA MCP-1 mRNA和蛋白表达均显著降低(P＜0.01).结论 siRNA能高效抑制HKC的MCP-1基因表达,提示siRNA在防治肾间质纤维化中具有潜在作用.
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小分子干扰RNA对卵巢癌紫杉醇耐药株的多药耐药性逆转的研究
目的 探讨小分子干扰RNA(small interfering RNAs,siRNA)对A2780/Taxol细胞多药耐药性的逆转作用.方法 2005-07-2005-12华中科技大学同济医学院附属协和医院根据多药耐药基因1(MDR1)序列设计2条siRNA,将siRNA包装入质粒,经转化、克隆、扩增、纯化,与pEGFPN-1质粒一起共转染A2780/Taxol细胞,流式细胞仪、MTT、RT-PCR和Western blot分别检测转染效率、紫杉醇的半数抑制浓度(IC50)、细胞P-gp蛋白及MDR1 mRNA表达.结果 两种重组质粒与EGFP质粒转染效率无明显差异,P-gp表达水平明显下调.两条siRNA对紫杉醇敏感性的相对逆转率分别达63.8%及51.2%.MDR1基因不同程度的沉默,MDR-A能更有效封闭MDR1基因,MDR1 mRNA相对水平下降(67.3±0.8)%.结论 siRNA能有效逆转MDR1基因编码P-gp介导的A2780/Taxol细胞多药耐药.
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siRNA作为小分子药物的研究现状
RNA干扰(RNAi)主要通过长度只有21～22个核苷酸的小分子干扰RNA(siRNA)与含其互补序列的基因相结合,并抑制该基因的表达,将设计过的siRNA双链作为药物,通过病毒载体表达siRNA前导序列,经细胞间的传递到达药物作用部位,从而达到基因治疗的目的.本文对以siRNA小分子为基础的药物研究进展及其应用的潜在障碍进行了综述.
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siRNA沉默β-Catenin对肝星状细胞工、Ⅲ型胶原表达的影响
目的 研究siRNA干扰β-Catenin表达、阻断Wnt/β-Catenin信号通路对肝星状细胞(HSC)Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响.方法 将化学合成siRNA β-Catenin以Lipofectamine包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照,抽提细胞总RNA及蛋白质,收集培养上清液,应用反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测细胞β-Catenin表达；Western blot法检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况；细胞免疫荧光法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达与定位；酶联免疫吸附法检测培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量.结果 转染siRNA的HSC-T6细胞β-Catenin基因及蛋白表达水平明显下调,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著下调,免疫细胞化学提示转染siRNA β-Catenin后的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均较对照组明显减弱；48 h和72 h时培养上清液中Ⅰ型胶原表达水平显著减少,分别比阴性对照下降(23.68±7.96)％和(38.42±6.58)％(F= 18.26,P＜0.01；F= 26.38,P＜0.01),Ⅲ型胶原含量于72 h时降低(39.68±4.92)％ (F= 37.68,P＜0.0t).结论 siRNAβ-Catenin能高效抑制HSC-T6细胞β-Catenin表达,阻断Wnt/β-Catenin信号通路,从而抑制HSC-T6细胞增殖,显著减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌,具有预防及治疗肝纤维化的潜力.
关键词： 肝星形细胞 小分子干扰RNA β-catenin基因 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原 -
小分子干扰RNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞培养激活的影响
目的研究化学合成小分子干扰RNA(siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSC)结缔组织生长因子(CTGF)基因表达的阻抑作用及对HSC培养激活的影响.方法以胶原酶原位灌注消化加密度梯度离心法分离大鼠原代HSC,将siRNA以脂质体包裹,转染培养72 h的原代HSC,设空白对照,收集孵育96 h细胞,以Western blot和免疫细胞化学染色法检测原代HSC CTGF及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因表达.结果转染siRNA的原代HSC CTGF及α-SMA基因表达显著下调,与对照相比,CTGF蛋白下调(92±5)%(P＜0.01);α-SMA蛋白表达分别下调(62±9)%(P＜0.01,Westem blot方法)和(58±6)%(P＜0.01,免疫细胞化学染色法).结论siRNA能显著下调大鼠原代HSC CTGF基因表达,明显阻抑原代HSC培养激活,提示针对CTGF基因化学合成的siRNA具有防治肝纤维化的潜力.
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抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA防治大鼠肝纤维化研究
目的探讨经门静脉注射抗结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)是否能在体内抑制大鼠肝CTGF基因表达及防治大鼠肝纤维化.方法雄性SD大鼠24只,均分成4组,模型组皮下注射40%CCl4(3 ml/kg)及门静脉注射生理盐水,每3 d 1次,连续6周;预防组皮下注射CCl4及门静脉注射抗CTGF siRNA(0.1 mg/kg),每3 d 1次,连续6周;治疗组皮下注射CCl4 2周,随后再给予抗CTGF siRNA及CCl44周;对照组门静脉注射生理盐水6周.于后1次CCl4注射后3 d行门静脉测压,并取血及组织标本,检测血清转氨酶、透明质酸(HA)及Ⅲ型前胶原(PⅢNP)浓度,应用RT-PCR及Western印迹法检测CTGF mRNA及蛋白质在大鼠肝组织表达,应用H-E及Sirius red胶原染色检测肝组织炎症及纤维化,应用偏光扫描对肝组织胶原染色面积进行定量.结果与模型组相比,预防组及治疗组大鼠肝组织CTGF mRNA及蛋白质表达显著下调,肝组织炎症、坏死及纤维化明显减轻,血清转氨酶、HA及PⅢNP浓度显著降低;预防组、模型组和治疗组的肝组织胶原染色面积分别为5.8%±0.8%、12.3%±0.8%和7.2%±0.9%(P＜0.01);门静脉压力分别为(14.2±2.3)cm H2O、(20.6士5.8)cm H2O和(15.1±3.6)cm H2O(P＜0.05),明显降低.结论经门静脉注射抗CTGF siRNA能在体内显著抑制大鼠肝CTGF基因表达并能有效防治大鼠肝纤维化,提示抗CTGF siRNA有潜力成为防治肝纤维化的一种新策略.
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SiRNA抑制高氧暴露下A549细胞硫氧还蛋白-2表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系
目的 研究小分子干扰RNA (SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞硫氧还蛋白-2(Trx-2)表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施.方法 体外传代培养A549细胞系,待其生长至接近亚汇合状态时,将体外化学合成Trx-2序列特异性的SiRNA通过Lipofectamine2000转染A549细胞.将细胞随机分为无干扰空气组、无干扰高氧组、干扰后空气组、干扰后高氧组4组.高氧组持续暴露于常压高浓度氧(92％O2,5％CO2)中；空气组仍置于5％CO2培养箱中.4组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h提取A549细胞总RNA.采用半定量RT-PCR测定Trx-2、三磷酸腺苷合成酶6,8(ATPase 6、8)及细胞色素C (CytC)mRNA的表达；Western-blot检测Trx-2蛋白表达；流式细胞术检测高氧和沉默Trx-2对A549细胞凋亡的影响.结果 序列特异性SiRNA可抑制Trx-2表达,SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3组Trx-2蛋白表达均受到抑制,SiRNA-1组抑制效率高(79.51％).与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12 h CytC和24 h Trx-2 mRNA的表达增高,48 h CytC mRNA的表达降低(P＜0.05).与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h Trx-2 mRNA的表达减弱,但在12、24 h CytC mRNA表达水平升高(P＜0.05).与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12、48 hATPase 6 mRNA的表达增高,24、48 h ATPase 8 mRNA的表达增高(P＜0.05).与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h ATPase 6,8 mRNA的表达减弱(P＜0.05).干扰后高氧组24、48 h A549细胞凋亡百分数明显高于干扰后空气组(P＜0.05).结论 高氧暴露和沉默Trx-2导致A549细胞ATPase 6,8表达下调和CytC表达升高,表明能量代谢障碍和细胞凋亡参与高氧肺损伤发病过程,Trx-2对高氧肺损伤线粒体起重要的保护作用.
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siRNA CD31沉默PECAM-1对鼠源血管内皮瘤细胞VEGF表达的影响
目的:研究siRNA CD31靶向沉默血管内皮细胞中血小板内皮细胞黏附分子1(platelet endothelialcell adhesion molecule 1,PECAM-1)基因对鼠源性血管内皮瘤(murine hemangioendothelioma,EOMA)细胞增殖及其VEGF表达的影响.方法:实验分为裸siRNA CD31组、siRNA CD31-FAM组、稳定阴性对照(SNC)组、空白对照(Opti-Med)组,以阳离子脂质体(RNAi-mate)为载体将化学合成的2'-O-甲基修饰的siRNA CD31转染体外培养的EOMA细胞,以激光共聚焦显微镜观察siRNA CD31的转染效果,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测siRNA CD31对EOMA细胞增殖的影响,以RT-PCR、Western blotting分别检测EOMA细胞中PECAM-1、VEGF的表达水平.结果:与SNC组和空白对照组比较,裸siRNA CD31和siRNACD31-FAM转染的EOMA细胞中的PECAM-1 mRNA和蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表达量均显著降低(均P＜0.01).与SNC组比较,裸siRNA CD31组、siRNA CD31-FAM组的EOMA细胞增殖抑制率明显上升[(18.82±1.46)％、(18.91±2.21)％vs(0.61±1.06)％,均P＜0.01].结论:采用siRNA CD31-脂质体复合物沉默EOMA细胞中的PECAM-1基因可抑制VEGF mRNA和蛋白的表达,从而抑制EOMA细胞的增殖.
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靶向siRNA对人直肠癌Colo320细胞的抑制作用
目的:利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人直肠癌Colo320细胞c-my基因的表达,探讨c-myc基因在人直肠癌Colo320细胞中的作用.方法 :设计人直肠癌Colo320细胞基因特异性小分子干扰RNA,用体外转录方法合成人直肠癌Colo320细胞的小分子干扰RNA并转染该细胞,培养48～96 h后,收集细胞RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中c-myc基因mRNA水平变化,Western blotting检测c-myc表达的蛋白,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成试验检测细胞增殖活性.结果:转染siRNA后,与对照组相比,实验组pGensil-c-myc-1、2、3、4的c-myc基因mRNA水平明显降低,c-myc的蛋白表达也明显降低.MTT法和集落形成试验检测表明,实验组的细胞增殖速率明显低于对照组.结论:在人直肠癌Colo320 细胞中存在RNA干扰的机制,特异性siRNA能够有效地抑制c-myc基因的表达,从而抑制Colo320 细胞的增殖.
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用于肿瘤治疗的小分子干扰RNA非病毒载体研究进展
近年来，小分子干扰RNA（siRNA）作为RNA干扰（RNAi）技术的效应分子，已被广泛用于恶性肿瘤的基因治疗领域。欲获得理想的治疗效果，其关键因素是寻找一种安全、高效、稳定、可控的基因载体。非病毒载体具有低毒、低免疫原性、制备简单、目的基因容量大、外源基因随机整合率低且携带基因大小类型不受限制等突出优势，已经成为目前siRN A载体的研究热点。在以往学者的研究基础上，从药剂学的角度，笔者对这些载体在siRNA传递系统中的研究现况做回顾性总结。
