丹参酮Ⅱ A对ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞蛋白质组的影响
摘要： 目的 应用双向电泳和质谱技术研究丹参酮Ⅱ A对ox-LDL诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞蛋白质组的影响,探讨丹参酮Ⅱ A调脂和抗动脉粥样硬化作用的分子机制.方法 分离纯化获得人血清低密度脂蛋白(LDL),用CuSO4进行氧化得到ox-LDL,与RAW264.7细胞共孵育,形成的泡沫细胞用含20 mg/L丹参酮Ⅱ A继续培养24h作为丹参酮组,不合丹参酮Ⅱ A的溶液培养24h作为对照组,经超声破碎细胞,离心,取上清进行蛋白质定量,丹参酮Ⅱ A组和对照组蛋白质等量上样,进行双向电泳,电泳完毕后用硝酸银染色得到不同样品的蛋白质组图谱.经Labscan软件进行差异蛋白质组分析,选取蛋白质表达量差异超过2倍的蛋白质作为差异蛋白.经胶内酶解及质谱分析,得到肽质量指纹图谱,通过Mascot数据库搜索,结合2-D图谱上蛋白质的分子量、等电点信息鉴定蛋白质.结果 丹参酮组钙网蛋白、波形蛋白、过氧化物酶2、CuZn-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、亮氨酸拉链蛋白、stabilin-1、造血细胞系特异性蛋白表达量增加,而GTP蛋白、ATP合酶、mimitin、IL-5、热休克蛋白70(HSP70)、翻译控制肿瘤蛋白、氯离子通道蛋白1表达量降低.结论 丹参酮Ⅱ A通过降低GTP蛋白和HSP70表达以及提高钙网蛋白表达改善泡沫细胞对脂代谢的调控功能;通过提高stabilin-1表达和降低ATP合酶表达调节细胞的吞噬能力;通过提高亮氨酸拉链蛋白和波形蛋白表达促进脂与脂蛋白的代谢;通过提高过氧化物酶2和CuZn-SOD表达起到清除氧自由基和抗脂质过氧化作用;通过降低mimitin和IL-5表达以及提高造血细胞系特异性蛋白表达而具有抗炎和抗细胞凋亡作用;通过降低氯离子通道蛋白1和翻译控制肿瘤蛋白表达具有抗肿瘤作用.因此可以认为丹参酮Ⅱ A可能具有调节血脂和抗动脉粥样硬化作用,在临床上可以用于心脑血管疾病的治疗.
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烟酸姜黄素酯促进血管平滑肌细胞向收缩型转化
目的 研究烟酸姜黄素酯(CurTn)调节血管收缩性的机制及其对血管平滑肌细胞(VSMC)表型调节的影响.方法 将C57BL/6小鼠用50 mg/(kg·d)CurTn灌胃,连续给药6周后取小鼠胸主动脉,用Myography肌动描记仪记录血管收缩力,并检测血管组织中收缩蛋白的水平.将VSMC用10 μmol/L CurTn孵育24h,Western blot检测VSMC表型相关因子的表达;噻唑蓝法和划痕试验分别观察VSMC的增殖、迁移情况;油红O染色和高效液相色谱分析VSMC对低密度脂蛋白(LDL)的吞噬能力.结果 CurTn灌胃处理的小鼠胸主动脉血管的收缩力增强,且血管平滑肌组织中收缩蛋白的表达增加.CurTn增加VSMC中Myocardin及收缩型特异标志蛋白α-actin和SM22α的表达,同时下调增殖型特异标志物骨桥蛋白的水平.此外,CurTn阻止了VSMC的增殖、迁移及对LDL的吞噬作用.结论 CurTn能增强血管收缩力,其机制可能是通过促进VSMC的收缩表型而阻止其增殖表型来实现的.
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t-PA基因修饰的内皮祖细胞对大鼠急性心肌梗死的治疗作用
目的 探讨组织型纤溶酶原激活物(t-PA)基因修饰的脐血内皮祖细胞(EPCs)移植治疗对大鼠急性心肌梗死的治疗作用.方法 体外扩增EPCs,将构建的t-PA基因慢病毒表达载体转染脐血EPCs,建立大鼠心肌梗死模型,实验随机分为PBS组、空载体EPCs组、单纯EPCs组和t-PA EPCs组.大鼠急性心肌梗死术后3h开始移植治疗,t-PA EPCs组、EPCs组和空载体EPCs组静脉注射t-PA基因转染的EPCs、单纯EPCs和空载体EPCs.移植4周后,采用心脏超声评价心脏功能及检测血浆N末端B型脑钠钛前体(NT-Pro-BNP)的表达水平,Western-blot检测心肌组织中血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶9(MMP-2/MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)的表达水平;移植8h后,ELISA法检测血清中t-PA、D-二聚体、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)和纤维蛋白原(Fib)表达情况.结果 与PBS组、空载体EPCs组以及单纯EPCs组比较,t-PA基因修饰EPCs可明显改善心肌梗死后大鼠的心肌组织病理改变,大鼠急性心肌梗死心功能各参数改善为显著;t-PA EPCs组NT-Pro-BNP的表达水平显著低于其他各组;t-PA EPCs组VEGF和TIMP的表达水平显著高于其他各组;相反,基质金属蛋白酶(MMP-2/MMP-9)的表达水平显著低于其他各组.t-PA EPCs组t-PA、D-二聚体表达均显著高于其他各组,而PAI-1、Fib表达均显著低于其他各组.结论 t-PA基因修饰的EPCs移植能有效治疗大鼠急性心肌梗死,其具体治疗作用与其改善心脏功能、促进血管新生、抑制心室重构、抑制血栓形成或增加溶栓作用等有关.
关键词： 组织型纤溶酶原激活物 内皮祖细胞 急性心肌梗死 -
网膜素能降低糖尿病动脉硬化大鼠主动脉胶原Ⅲ含量
目的 探讨过表达网膜素对糖尿病动脉硬化大鼠主动脉胶原含量的影响.方法 选用60只1月龄雄性Wistar大鼠,按随机数字表法分为正常对照组(NC组;n=8)和实验组(n=52).实验组采用高脂高糖饲料喂养联合尾静脉注射2％链脲佐菌素(30 mg/kg),建立糖尿病大鼠模型;成模的糖尿病大鼠再灌胃给予维生素D3(70万IU/kg),继续喂养16周,建立糖尿病合并动脉硬化大鼠模型.将终24只糖尿病动脉硬化大鼠,依随机数字表法分为糖尿病动脉硬化组(DAC组;n=8)、糖尿病动脉硬化+空病毒组(DAC+E组;n=8)和糖尿病动脉硬化+网膜素组(DAC+O组;n=8).将150 μL携带人网膜素基因ITLN1-AAV9的腺相关病毒和携带空质粒的病毒经尾静脉分别注射至DAC+O组和DAC+E组,等量生理盐水注射至NC组和DAC组.继续高脂饲料喂养4周,处死大鼠,测定血清及肝脏网膜素、血脂水平;取主动脉进行HE染色;应用定量实时聚合酶链反应测定胶原Ⅰ、Ⅲ、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9 mRNA含量;Western blot测定主动脉胶原Ⅰ、Ⅲ、MMP-2、MMP-9蛋白含量;黄嘌呤氧化酶法测定主动脉超氧化物歧化酶(SOD)含量,硫代巴比妥酸缩合法测定主动脉丙二醛(MDA)水平.结果 (1)与NC组相比,糖尿病动脉硬化大鼠血清中大鼠网膜素水平显著下降.给予携带人网膜素基因的腺相关病毒静脉注射后,在DAC+O组的大鼠血清中测定人网膜素为(101.0±0.2) μg/L,肝脏中测得人网膜素为(98.3±1.9) μg/L,在其他组别的相应组织中未测出人网膜素.(2)与DAC组相比,DAC+E组和DAC+O组血清血脂谱和主动脉MDA均显著下降,SOD升高,但后2组间差异无统计学意义.(3)DAC组主动脉内膜部分脱落,平滑肌增生,局部透明变性并钙化.DAC+O组内膜完整,局部管壁增厚,平滑肌增生和钙化程度较DAC组明显改善.(4)与DAC+E组相比,DAC+O组胶原Ⅰ、ⅢmRNA表达显著下降,胶原Ⅲ蛋白表达显著下降.与DAC+E组相比,DAC+O组MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义.结论 在糖尿病动脉硬化大鼠体内,过表达人网膜素能减少主动脉胶原Ⅲ的表达量,减轻动脉硬化,对氧化应激水平无明显影响.
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Notch1/Hes1通路活化通过抑制氧化应激改善高糖诱导的心肌细胞肥大
目的 研究Notch1/Hes1信号通路活化对高糖诱导的心肌细胞肥大的影响,及其对氧化应激的作用.方法 原代培养大鼠心肌细胞,采用图像分析法检测心肌细胞表面积,BCA试剂盒分析细胞总蛋白含量,采用RT-qPCR和Western blot技术检测Notch1、Hes1、超氧化物歧化酶(SOD1)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平,相关试剂盒检测细胞匀浆中丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量.结果 与对照组比较,高糖能明显诱导心肌细胞表面积及总蛋白含量的增加(P＜0.05),心肌细胞中Notch1、Hes1蛋白表达量也明显降低(P＜0.05),同时氧化应激产物MDA、NO明显升高(P＜0.05),并且SOD1显著降低、iNOS显著升高(P＜0.05);激活Notch1/Hes1信号通路能够显著降低高糖引起的心肌细胞肥大及氧化应激损伤(P＜0.05),而Notch1干扰慢病毒可阻断Notch1对心肌细胞肥大及氧化应激的上述改善作用(P＜0.05).结论 激活Notch1可以降低高糖诱导的心肌细胞肥大,其作用机制可能与降低细胞氧化应激损伤有关.
关键词： Notch1/Hes1信号通路 心肌细胞肥大 氧化应激 -
量子降脂仪对高脂血症大鼠血脂的影响及其机制
目的 观察量子降脂仪对高脂血症模型大鼠的降血脂作用并探讨其机制.方法 以高脂饲料和10％果糖自由饮水建立无特定病原体动物(SPF)级大鼠高脂血症模型.量子降脂仪输出功率强度为70 μ,W/(cm2·min),每天治疗1～2次,治疗时间为每次5～10 min.采用Elisa试剂盒检测血清中血脂水平,Western blot方法检测脂类代谢和炎症通路关键蛋白表达水平的变化.结果 量子降脂仪明显改善由高脂血症引起的的血脂代谢紊乱、调节血脂平衡、降低炎症状态、缓解肝功能损伤、缓解氧化损伤、提高脂肪代谢相关酶的活性、抑制脂肪酸合成酶的活性.Western blot结果显示,量子降脂仪通过调节核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)蛋白的表达水平,缓解机体慢性炎症;通过调节过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)蛋白的表达水平促进机体脂质代谢;通过调节胆固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)通路,促进低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白表达,缓解脂质代谢紊乱,调节机体高胆固醇和高甘油三酯水平.结论 量子降脂仪具有明显降血脂作用,可作为降血脂医疗器械辅助应用于临床.
关键词： 高脂血症 量子降脂仪 胆固醇调节元件结合蛋白2 -
睾酮对维生素D3和尼古丁诱导的主动脉血管钙化的影响
目的 建立SD大鼠血管钙化模型,并观察睾酮在主动脉血管钙化中的作用.方法 将10周龄SD雄性大鼠分为:对照组、钙化组、钙化+低剂量睾酮组和钙化+高剂量睾酮组,每组8只.除对照组外,其余三组采用维生素D3(300 kU/kg一次肌肉注射)和尼古丁(25 mg/kg溶于花生油中早、晚各灌胃1次)诱导大鼠血管钙化模型;低剂量睾酮组注射1 mg/kg外源性睾酮(隔日注射1次),高剂量睾酮组注射2 mg/kg睾酮(隔日注射1次),持续8周后处死.采用ELISA法测定大鼠血清睾酮和骨形态发生蛋白4(BMP-4)含量,采用试剂盒检测血管组织钙离子及碱性磷酸酶(ALP)含量,蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测主动脉血管组织BMP-4、骨桥蛋白(OPN)的蛋白表达水平,Von Kossa染色法观察血管钙化情况.结果 (1)成功制备了大鼠血管钙化模型:Von Kossa染色可见钙化组大鼠血管中膜大量黑色颗粒样钙盐沉积,而对照组血管结构完好,未见黑色钙盐沉积物.(2)睾酮对血管钙化的影响:睾酮组钙含量、ALP、BMP4、OPN水平显著低于钙化组(P＜0.01),且高剂量睾酮组低于低剂量睾酮组,对照组水平低;Von Kossa染色可见钙化组血管中膜出现大量黑色颗粒样钙盐沉积,而低剂量睾酮组和高剂量睾酮组均见少量钙盐沉积,对照组无钙盐沉积.结论 外源性睾酮能一定程度上减轻维生素D3和尼古丁诱导的大鼠血管钙化.
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冠状动脉粥样斑块内CD45表达水平与病灶结构变化的关系
目的 通过检测冠状动脉粥样硬化病灶内CD45蛋白表达水平,分析其与病灶结构变化的关系,探讨CD45在人冠状动脉粥样硬化病灶发生发展中的作用.方法 收集贵州医科大学法医司法鉴定中心司法鉴定中尸体检验及组织学检查确认有冠状动脉粥样硬化病例的冠状动脉组织,根据冠状动脉病变情况将其分为对照组、单纯动脉粥样硬化组(单纯As组)和动脉粥样硬化并继发病变组(As并继发病变组),常规石蜡切片HE染色观察各组冠状动脉的组织结构,免疫组织化学染色法、蛋白免疫印迹法及实时荧光定量PCR检测CD45蛋白的表达分布及水平,分析CD45表达水平与粥样硬化病灶结构变化的关系.结果 与对照组比较,有动脉粥样硬化及并发继发病变的冠状动脉斑块内纤维帽厚度变薄,病灶厚度、坏死灶厚度及血管腔面积增加(P均＜0.05).与对照组比较,有动脉粥样硬化及并发继发病变的血管组织CD45蛋白表达显著升高(P＜0.05),且As并继发病变组显著高于单纯As组(P＜0.05).与对照组比较,有动脉粥样硬化及发生继发病变的冠状动脉病灶内CD45的表达显著升高(P＜0.05),且As并继发病变组显著高于单纯As组(P＜0.05),CD45阳性蛋白表达主要分布于斑块肩部和底部的白细胞(棕黄色着色).与对照组比较,有动脉粥样硬化及并发继发病变的血管组织CD45 mRNA表达显著升高(P＜0.05),且As并继发病变组显著高于单纯As组(P＜0.05).病灶内CD45表达水平与病灶结构变化具有相关性.结论 人冠状动脉粥样斑块内CD45分子作为炎症反应的标志物,其表达水平反映病灶内的炎症反应程度,而病灶内炎症反应程度能影响病灶结构,从而导致斑块稳定性改变.
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miR-155通过调节Caspase-3和FADD表达影响TNF-α诱导的HUVEC凋亡
目的 观察TNF-α处理的脐静脉内皮细胞(HUVEC)中miR-155的表达情况,探讨miR-155的表达与TNF-α诱导的HUVEC凋亡的关系,并探究两者之间的作用机制.方法 不同浓度TNF-α分别处理HUVEC不同时间,MTT法检测细胞活性,Hoechst33342荧光染色法检测HUVEC凋亡,qRT-PCR检测细胞中miR-155的表达;通过转染miR-155 mimic和anti-miR-155使HUVEC中miR-155过表达或抑制其表达,Hoechst33342荧光染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测过表达miR-155或抑制miR-155表达对HUVEC凋亡的影响;使用miRanda和Tangetscan等分析软件预测miR-155作用的潜在靶基因,Western blot检测靶基因Caspase-3和FADD的表达变化.结果 TNF-α可诱导HUVEC凋亡,且呈剂量和时间依赖性增加;10 μg/L TNF-α处理HUVEC24h后可以诱导其miR-155表达明显增加;抑制miR-155表达可以增加HUVEC凋亡;miR-155过表达则抑制HUVEC凋亡;miR-155通过调节Caspase-3、FADD和active-Caspase-3表达抑制细胞凋亡.结论 miR-155通过下调FADD和Caspase-3表达调节Caspase凋亡信号通路,抑制TNF-α诱导的HUVEC凋亡.
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糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用
目的 观察糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用,探讨雷帕霉素是否通过调节自噬、内质网应激和细胞凋亡对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用.方法 雄性SD大鼠用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病组和雷帕霉素干预组.采用链脲佐菌素制备1型糖尿病大鼠模型.雷帕霉素干预组给予雷帕霉素2mg/(kg·d)灌胃.于实验第8周留取血标本,用于血生物化学指标和脂联素水平检测,然后处死动物并迅速取出胸主动脉和腹主动脉,测定主动脉Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Caspase-12、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达.结果 与正常对照组比较,糖尿病组大鼠血清脂联素水平显著降低(P＜0.05),主动脉壁增厚,内皮严重受损,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2mRNA表达水平显著降低(P＜0.05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著升高(P＜0.05).与糖尿病组比较,雷帕霉素干预组大鼠血清脂联素水平显著升高(P＜0.05),主动脉组织病理改变显著减轻,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P＜0.05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著降低(P＜0.05).结论 糖尿病大鼠主动脉组织自噬水平降低,雷帕霉素可能通过激活自噬和减轻内质网应激和细胞凋亡水平对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用.
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血管内皮生长因子-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸缓释微球的治疗性血管再生实验研究
目的 探讨血管内皮生长因子-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸缓释微球在促进大鼠缺血下肢血管生成的作用.方法 制备血管内皮生长因子-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸微球,扫描电镜观察其形态,采用酶联免疫吸附测定法检测其体外释药性能.将负载血管内皮生长因子-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸微球纤维蛋白凝胶注射到大鼠缺血下肢肌肉内,1个月后进行组织学和免疫组织化学检测,评价血管再生情况.结果 血管内皮生长因子-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸微球体外释放血管内皮生成因子持续时间超过4周,可显著提高注射部位毛细血管和α-平滑肌肌动蛋白阳性血管的密度,并促进CD34、C-kit和血管内皮生长因子受体2阳性细胞的动员.结论 肌肉注射负载血管内皮生长因子-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸微球的纤维蛋白凝胶是一种较为理想的治疗性血管再生方法.
