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人TALL-1基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
目的克隆人TALL-1基因全长及其胞外区片段,构建人TALL-1及其胞外区蛋白毕赤酵母分泌型表达载体.方法从人新鲜淋巴结组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增人TALL-1及其胞外区基因编码区序列,构建人TALL-1及其胞外区 cDNA毕赤酵母表达载体,并进行序列测定.结果克隆获得的858 bp和459 bp片段与文献报道的人TALL-1全长及其胞外区基因编码区cDNA序列一致,将目的基因插入酵母表达载体pPIC-9Kα因子分泌信号肽下游.结论本实验为大量获得人TALL-1蛋白及其可溶性功能蛋白,以及探讨其生物学性能和未来在临床上的应用奠定了实验基础.
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视黄酸可控的Fas/RARα融合基因表达载体构建
目的构建带有视黄酸反应元件(Retinoic acid response element , RARE)的Fas/RARα融合基因表达载体,为研究肿瘤细胞凋亡的可调控性奠定理论与实验基础.方法采用常规DNA分子克隆方法,借助相关计算机软件,设计融合基因各片段引物,经PCR扩增后重组真核表达载体pRARE-tk-eGFP-Fas/RARα.结果成功构建融合基因真核表达载体,与预期设计路线相符;检测DNA序列与原始片段相一致.结论本实验成功构建了pRARE-tk-eGFP-Fas/RARα融合基因表达载体,为进一步在哺乳动物细胞中表达新型融合蛋白、探讨其未来在临床上的应用奠定实验基础.
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pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体的构建及vigilin重组慢病毒包装
目的 构建pCS-CG-DsRed2-vigilin慢病毒重组载体,以及包装pCS-CG-DsRed2-vigilin重组慢病毒.方法 用NheⅠ、NotⅠ将目的片段红色荧光蛋白基因DsRed2从pDsRed2-N1中切下,连入pcDNA3.1(-)上,再用Kpn1从pcDNA3.1(-)-DsRed2中切下DsRed2片段插入pCS-CG-vigilin中.用相应的内切酶鉴定,阳性克隆送测序鉴定.采用三质粒系统包装慢病毒并分别感染HEK293T和HepG2细胞.结果 电泳显示,构建的pCS-CG-DsRed2-vigilin用KpnⅠ和SacⅡ分别单酶切切下800bp和600bp的插入片段,阳性克隆质粒测序结果与pDsRed2-N1中DsRed2序列一致;HEK293T和HepG2细胞感染后均能观察到较强的红色荧光.结论 带有红色荧光基因的pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体构建成功;成功包装出带红色荧光标签的vigilin重组慢病毒,且该病毒具有较高的感染效率.
关键词： Vigilin DsRed2荧光蛋白 重组载体 重组慢病毒 -
同源重组与Gibson Assembly方法构建腺病毒载体
目的：对比同源重组与Gibson Assembly两种方法构建腺病毒载体的效率。方法：增殖并提取AD4 DNA，分别用同源重组与Gibson Assembly两种方法，将AD4 DNA镶嵌入pBR322质粒，构建出携带有全长AD4 DNA的腺病毒载体，并进行PCR和测序鉴定，对比两种方法构建腺病毒载体的筛选效率。结果：两种方法均能构建出正确的腺病毒载体；筛选同源重组法1000个菌落中，鉴定360个，仅有1个菌落；Gibson Assembly法112个菌落数中，鉴定其中10个，有3个阳性。结论：Gibson Assembly方法比传统同源重组方法在构建腺病毒载体时更有效。
关键词： 腺病毒 疫苗 重组载体 Gibson Assembly -
shRNA-Bmi1重组载体构建及其对胆囊癌裸鼠移植瘤hTERT表达的影响
目的 体外构建及鉴定shRNA-Bmi1重组载体,探讨靶向沉默原癌基因Bmi1对人胆囊癌细胞Bmi1mRNA表达、蛋白表达及对裸鼠皮下移植瘤hTERT表达的影响.方法 针对Bmi1不同位点构建4个shRNABmi1重组质粒,采用倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和Western blot检测各组Bmi1mRNA和蛋白表达,选择有效干扰组进行体内实验.构建GBC-SD裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为shRNA-Bmi-4组(实验组)、shRNA-Scramble(错配组),Lipofectamine(阴性对照组),GBC-SD(空白对照组).成瘤后进行移植瘤治疗,治疗6周后处死裸鼠,免疫组化检测裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达水平.结果 成功构建了shRNA-Bmi1重组载体.转染胆囊癌48 h后倒置荧光显微镜观察发现shRNA-Bmi1-4组GBC-SD绿色荧光强度增强、转染效率高,RT-PCR及Western blot结果显示shRNA-Bmi1-4组mRNA及蛋白表达量均明显低于各对照组(P＜0.05),对照组间表达量差异无统计学意义(P＞0.05).选取shRNA-Bmi1-4组作为有效干扰序列作后续体内实验.免疫组化检测shRNA-Bmi-4组裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达水平明显低于各对照组(P＜0.05),对照组间蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外成功构建了shRNA-Bmi1重组载体,顺利进行重组载体的转化和转染实验.靶向沉默Bmi1基因可有效促进胆囊癌细胞Bmi1mRNA降解、抑制其蛋白的表达,同时有效抑制GBC-SD裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达.
关键词： shRNA-Bmi1 重组载体 GBC-SD 皮下移植瘤 hTERT -
人神经菌毛素-1基因shRNA慢病毒载体的构建
目的:构建并鉴定靶向人神经菌毛素-1(NRP-1)基因的小发卡RNA的慢病毒载体.方法:针对NRP-1mRNA设计了4条shRNA,并构建pGCSIL-RFP-shNRP1慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定.用pGCSIL-RFP-shNRP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒干扰RNA及含有NRP-1过表达载体共转染293T细胞,Western blot法检测Flag表达,观察NRP-1蛋白相对表达抑制效果.结果:PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达1×109 Tu/mL.转染细胞中NRP-1蛋白相对表达显著降低.结论:成功构建了高效率的人NRP-1基因shRNA慢病毒载体.
关键词： Neuropilin-1 RNA干扰 重组载体 -
沉默与过表达AEG-1重组载体的构建及其对细胞迁移的影响
目的:设计靶向AEG-l序列的人鼠通用的siRNA,并构建沉默AEG-1表达的shRNA和过表达AEG-1的重组表达载体,以改变肿瘤细胞中AEG-1的表达,探讨AEG-1对肿瘤细胞迁移的影响.方法:首先设计靶向AEG-1的siRNA并转染细胞后检测其转染效率和沉默活性;然后将筛选出的siRNA序列插入pScilence4.1载体中构建靶向沉默AEG-1的重组载体AEG-1-shRNA.利用巢式PCR克隆AEG-1序列,将其与pEGFPC3载体进行酶切、纯化、连接,并对转化子进行筛选和鉴定,构建过表达AEG-1重组质粒pEGFPC3-AEG-1.后将重组载体AEG-1-shRNA与pEGFPC3-AEG-1转染肺癌A549细胞,利用细胞平板划痕实验和Transwel小室实验评价AEG-1表达变化对肿瘤细胞迁移能力的影响.结果:成功设计具有较高沉默活性的靶向AEG-1的siRNA,并成功构建了AEG-1-shRNA和pEGFPC3-AEG-1重组质粒,细胞划痕实验和Transwel小室实验结果表明AEG-1具有促进肿瘤细胞迁移能力的作用.结论:AEG-1具有促进肿瘤细胞迁移能力的作用,为后续进一步研究AEG-1与肿瘤发生发展的相关性及其分子机制奠定实验基础.
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绿色荧光蛋白基因标记的胃癌细胞系的建立
目的建立能连续传代稳定高表达绿色荧光蛋白(GFP)的胃癌细胞株,探讨胃癌的生长与转移特征.方法利用脂质体将携带GFP-cDNA的真核表达载体质粒转染胃癌细胞株GC9811-P,经过G418筛选和克隆化培养,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染的EGFP基因在癌细胞体内外的表达,MTT比色法观察细胞生长,Western blot检测转染细胞和未转染细胞肿瘤相关抗原的表达.结果携带EGFP的真核表达载体能有效地转染胃癌细胞GC9811-P,转染的细胞能稳定、高效和持久地表达EGFP,与未转染细胞比较,他们的生物学特性未改变(P>0. 05).在裸鼠皮下肿瘤中,EGFP也能稳定、高效的表达.结论胃癌GC9811P-GFP的建立为研究肿瘤侵袭和转移的发生机制提供了理想的细胞株.
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抗LPS mAb Fab片段cDNA的克隆及其在CHo细胞中的表达
[马越云,马文煜,于文彬,尹文,苏明权,丁振若.细胞与分子免疫学杂志,2001;17(3):280-283]目的构建抗LPS单克隆抗体Fab段的真核表达载体,并在CHO细胞中表达.方法以逆转录PCR方法扩增抗LPSmAb重链Fd和轻链cDNA,分别克隆入载体pGEM-T easy.经测序分析后,再分别亚克隆入载体pcDNA3,构建成重组载体pcDNA3-Fd和pcDNA3 LC,并以PCR方法扩增pcDNA3-LC中包括CMV启动子、轻链序列和BGH Poly(A)在内的轻链表达序列.经适当的限制性内切酶酶切后,插入到质粒pcDNA3-Fd中Fd表达序列的前部,构建成表达载体pcDNA3-Fab,以脂质体包裹转染CHO细胞.经G418筛选,用ELISA、免疫荧光和Western blot鉴定阳性克隆.结果用ELISA和免疫荧光法,筛选出4株高表达Fab的细胞株.Western blot显示,表达产物的Mr为50 000.同时,ELISA结果显示,该Fab具有良好的结合LPS的活性.结论成功地在CHO细胞中表达抗LPS mAb的Fab段,为进一步鉴定其抗LPS的作用,使之成为诊断和治疗革兰氏阴性细菌感染的工具奠定了基础. (井晓梅)
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转录因子Smad2高表达载体的构建和鉴定
目的 构建并鉴定大鼠转录因子Smad2的高表达载体(简称pLJM1-Smad2).方法 首先以E3大鼠肝脏cD-NA为模板、PCR法获取转录因子Smad2 mRNA CDS区(即目的基因片段);然后用AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切pLJM1-MGFP载体和目的基因片段,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;之后再将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,扩大培养并提取重组质粒;后用PCR、AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切以及DNA测序鉴定重组质粒.结果 PCR、AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切结果均提示pLJM1-Smad2重组载体中插入了目的片段Smad2;将含有目的片段的阳性重组体克隆送上海生工进行DNA测序,并将测序结果与NCBI数据库的进行比对,确定插入片段无突变、序列完全正确,证实pLJM1-Smad2重组载体中成功插入了目的基因片段Smad2.结论 成功构建了转录因子Smad2的高表达载体pLJM1-Smad2.
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含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区报告基因载体的构建和鉴定
目的：利用 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector(简称为pmirGLO 报告基因载体)构建并鉴定含 miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体 mRNA 3′UTR 区报告基因载体(pmir-Insr-3′UTR 及 pmir-mutant-Insr-3′UTR)。方法以大鼠肝脏 cDNA为模板,PCR 获取目的片段(即含 miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体 mRNA 3′UTR区)；用PmeI、XbaI双酶切 pmirGLO 报告基因载体和含 miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体 mRNA 3′UTR区,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物；连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。结果 PCR和双酶切证实pmir-Insr-3′UTR及 pmir-mutant-Insr-3′UTR重组载体中均插入目的片段；DNA测序结果进一步证实 pmir-Insr-3′UTR重组载体中成功插入了胰岛素受体mRNA 3′UTR区,pmir-mutant-Insr-3′UTR重组载体中成功插入了在miR-497结合位点含有3个突变碱基的胰岛素受体 mRNA 3′UTR 片段。结论成功构建了含 miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR报告基因载体 pmir-Insr-3′UTR及 pmir-mutant-Insr-3′UTR。
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人COX-2基因反义真核表达载体对胃癌转移的影响
目的:在成功构建人COX-2基因反义真核表达载体的基础上,研究COX-2基因对人胃癌细胞株SGC-7901转移能力的影响.方法:实验分为COX-2基因反义真核表达载体转染的人胃癌细胞株SGC-7901转染组、COX-2抑制剂SC2360处理组(SGC-7901细胞培养基内含100μmol/L SC236)和对照组(SGC-7901细胞),并分别采用细胞体外侵袭实验,内皮细胞体外迁移实验,观察各组细胞体外转移的情况.采用裸鼠皮下移植瘤抑制实验,用转染和未转染的SGC-7901细胞按每毫升5×10<'7>个的细胞悬液分别注射于BALB/C-nu/nu无胸腺裸鼠背部皮下,SC236处理组按3 mg/(kg·d)剂量于接种SGC-7901细胞10 min后,由尾静脉注射,隔日1次.各组6周后处死动物,观察皮下移植瘤的生长情况.并用Western blot法检测各组细胞VEGF及MMP-2蛋白的表达.结果:体外侵袭实验、促内皮细胞体外迁移实验结果显示,与对照组相比,转染组和SC236处理组迁移的肿瘤细胞和内皮细胞均减少(P<0.01);裸鼠皮下移植抑制实验结果显示,转染组和SC236处理组荷瘤鼠移植瘤的生长受到抑制;Western blot结果显示,转染组和SC236处理组细胞VEGF及MMP-2蛋白的表达下降.结论:反义COX-2基因能抑制SCG-7901细胞的转移能力,其机制可能与其抑制肿瘤的血管生成、减少MMP-2的表达有关.
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人COX-2基因反义真核表达载体的构建及对SGC-7901细胞增殖的影响
背景与目的:构建人COX-2基因反义真核表达载体,研究COX-2基因对人胃癌细胞株SGC-7901增殖的影响.材料与方法:采用分子克隆技术,用EcoR Ⅰ从含人全长COX-2基因的质粒pBOSNeoCOX-2中切下含COX-2 cDNA的目的片段,然后分别在其两端添加EcoR Ⅰ和Sgt Ⅱ酶切位点,酶切后将该片段按正、反两个方向插入真核表达载体plRES2-EGFP的多克隆位点中,琼脂糖凝胶电泳法对重组子进行鉴定,脂质体法将重组质粒转染到人胃癌细胞株SGC-7901中,MTT法检测转染反义COX-2基因的表达载体后SGC-7901细胞增殖的变化.结果:经酶切鉴定,正、反义目的片段成功地连接到plRES2-EGFP中,COX-2基因正、反义真核表达载体成功构建,转染后在SGG7901细胞中稳定表达,反义COX-2基因真核表达载体转染SGC-7901细胞后能抑制其增殖.结论:成功构建人COX-2基因反义真核表达载体,反义COX-2基因能抑制SGC-7901细胞增殖.
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人survivin基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定
目的构建人survivin基因反义真核表达载体.方法采用分子克隆技术,用SacⅠ和SacⅡ双酶切pGEM-T Easy-survivin,然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点,后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,将目的片段成功的连接到pIRES2-EGFP上.结论成功地将survivin目的片段反向插入到pIRES2-EGFP中,构建了人survivin反义真核表达载体pIRES2-EGFP-survivin.
