首页 > 文献资料
-
人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及表达
目的:扩增人幽门螺杆菌(Helicobacter py lori,Hp)热休克蛋白A(heat shock prot ein A,HspA)编码基因并构建其重组表达载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,为疫苗的开发奠定了基础.方法:利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A(HspA)基因片段,目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后,插入pET32a(+)载体.以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达.结果:经PCR、酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为Hp HspA编码基因,与GenBank报道的相比较,核酸同源性达98%.经SDS-PAGE 分析,表达的融合蛋白分子量约为33 KD,其中目的蛋白的分子量约为13 KD.结论:成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因,为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础.
-
人β-神经生长因子和神经生长因子基因重组真核表达载体的构建
目的:人神经生长因子包括β-神经生长因子、神经生长因子这两种活性形式,拟分别构建这两种活性形式的基因重组真核表达载体,为进一步的转基因实验作好前期准备.方法:实验于2001～2004年在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①对象:健康志愿者5人,均对本实验知情同意.流产胎儿由青岛大学医学院妇产科提供,产妇均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:根据人β-神经生长因子与神经生长因子的全长基因序列设计合成特异性引物.抽取正常人外周血1.5 mL,提取基因组DNA后克隆出人β-神经生长因子基因片段.取胎儿海马部位脑组织100 mg,采用RT-PCR技术从胎儿脑组织中克隆出人神经生长因子基因片段.分别将纯化的β-神经生长因子产物与神经生长因子产物连接于真核表达载体pcDNA4上,构建重组真核表达载体.转入JM109大肠杆菌中,扩增后小剂量质粒提取,酶切鉴定及计算机自动测序.结果:β-神经生长因子和神经生长因子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,在预期位置均有阳性条带.酶切鉴定结果及计算机自动测序均证实插入片段为目的基因片断.结论:实验分别从人外周血和胎脑海马组织中成功克隆获得β-神经生长因子与神经生长因子,并顺利构建这两种活性形式的重组真核表达载体pcDNA4-β-NGF与pcDNA4-NGF,为进一步将神经生长因子基因转入真核细胞并比较二者表达效率作好准备工作.
-
CD41-42突变型β地中海贫血重组载体pEGFP-C2-CD41-42的构建及其稳定转染HeLa细胞模型的建立
目的:构建CD41-42突变型β地中海贫血重组载体pEGFP-C2-CD41-42和HeLaCD41-42细胞模型,为β地中海贫血CD41-42突变型细胞、小鼠模型建立及进一步基因治疗提供依据.方法:在β地中海贫血CD41-42突变的纯合子患者外周血中提取DNA,PCR法扩增含有βCD41-42的β-珠蛋白基因片段.将PCR产物βCD41-42珠蛋白基因克隆到pEGFP-C2载体中,用脂质体2000将pEGFP-C2-βCD41-42质粒转染HeLa细胞,观察转染后βCD41-42在HeLa细胞中荧光表达情况.RT-PCR法检测βCD41-42在HeLa细胞中的表达.结果:重组质粒pEGFP-C2-βCD41-42转染HeLa细胞24 h后细胞发出绿色荧光,G418筛选后,有大量荧光表达.RT-PCR扩增得到227 bp的特异性条带,而稳定转染pEGFP-C2空质粒的HeLa细胞中不表达特异性条带.结论:成功构建β地中海贫血pEGFP-C2-βCD41-42突变基因重组载体,并成功构建HeLaCD41-42细胞模型.
关键词： β地中海贫血 CD41-42突变基因 重组载体 Hela细胞 -
GHRHR-SV1抗体的制备及其蛋白在黑色素瘤细胞中的表达
目的：制备生长激素释放激素受体剪接变异体1（GHRHR-SV1）抗体，并检测 GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况，为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法：设计 GHRHR-SV1基因序列，将其插入质粒 pET-32a （＋）中，构建 pET-GHRHR-SV1重组载体，经 PCR 及测序鉴定后，转入大肠杆菌 BL21（DE3）中，分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L－1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；诱导1、2、4和6 h，并在37℃、30℃和25℃不同温度下进行诱导；观察目的蛋白表达的佳 IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白，将纯化后的蛋白免疫家兔，制备兔多克隆抗体， ELISA法检测该抗体效价， Western blotting法检测 GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系 B16-F10中的表达情况。结果：重组载体 pET-GHRHR-SV1构建成功。在 IPTG浓度为2.0 mmol· L－1时目的蛋白的表达量高；IPTG诱导蛋白表达2 h时，蛋白表达量大；当温度为25℃时，蛋白的表达量大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24000，纯化后纯度为80％， GHRHR-SV1抗体效价为1∶1600000，B16-F10细胞中有 GHRHR-SV1蛋白表达。结论：成功制备 pET-GHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在 IPTG浓度为2.0 mmol·L－1、诱导时间为2 h和温度为25℃的条件下表达佳。成功制备了高效价的 GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有 GHRHR-SV1蛋白表达。
关键词： 生长激素释放激素受体剪接变异体 1 重组载体 重组蛋白 抗体 黑色素瘤 -
钩端螺旋体外膜蛋白基因重组载体构建及在卡介菌中的表达
目的研制一种高效广谱的新型钩体疫苗.方法用PCR方法扩增致病性钩端螺旋体赖型017株外膜蛋白OmpLl基因,将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒载体pMV261和pMV361中.结果筛选到两个重组载体pBQ1和pBQ2,通过电穿孔导入卡介菌,重组体经诱导表达了相对分子质量约为35000的融合蛋白.结论卡介菌能有效表达钩体抗原蛋白.
-
平滑肌肌球蛋白轻链激酶N端删除载体的构建
目的:构建重组平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)N端删除栽体,为研究平滑肌MLCK的分子机制提供研究模型.方法:以重组质粒pCoid/155为模板,根据其待删除序列(N端1-41个氨基酸)设计上下游引物,行PCR扩增.将扩增片段以NdeI/EeoRl双酶切,产物行琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因.将目的基因与栽体连接,转化至大肠杆菌.筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.结果:用NdeI和EcoRI双酶切重组质粒pCold/155,琼脂糖凝胶电泳显示得到约4.4kb栽体和约3.4kb的MLCK片段.阳性克隆经测序证实MLCK的N端41个氨基酸序列已被成功删除.结论:成功构建了重组MLCK N端删除栽体 pCold/155/D41.
-
可用体外翻译获得的可溶天然型EGFP的表达
目的 构建能在体外大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的pET28a-EGFP原核表达载体.方法 以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切EGFP基因序列和pET28a载体.T4 DNA连接酶连接,转化大肠埃希菌DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定.将pET28a-EGFP转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,观察荧光.体外翻译系统中加入重组pET28a-EGFP载体,孵育后观察荧光.免疫印迹法(Western blott)鉴定EGFP.结果 测序证实pET28a-EGFP中的EGFP基因序列与GenBank中序列完全一致,荧光显微镜下观察到大肠埃希菌BL21(DE3)和体外翻译系统中强烈荧光,West-ern blot结果显示相对分子质量约为27 000的EGFP高效表达.结论 成功构建了能在体内和体外稳定表达的可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步体外筛选抑菌药物提供了可靠的报告载体.
-
HepG2.2.15细胞分泌前S1、病毒抗原和乙型肝炎病毒DNA的动态变化
HepG 2.2.15细胞是将含有HBV基因组(2个HBV二聚体以尾对尾方向串联)的重组载体质粒转染HepG2细胞,经G418筛选,得到的克隆能稳定分泌HBsAg、HBeAg、HBcAg及Dane颗粒,并可检测到细胞内DNA和RNA等各种中间复制体[1,2],还能分泌前S1和前S2[3-5].此外,在HepG 2.2.15细胞株中,培养细胞的上清液和细胞内均发现HBV ccc DNA[6],但至今鲜见有关HepG 2.2.15细胞分泌前S1动态变化的相关报道.为更好地了解和掌握HepG 2.2.15细胞分泌特点和动态变化,为筛选抗HBV药物建立一个稳定的体外培养系统,我们采用ELISA法检测HepG 2.2.15细胞株培养上清液中前S1、HBsAg和HBeAg,采用PCR检测HepG 2.2.15细胞株培养上清液中HBV DNA的动态变化,现报道如下.
-
构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达
目的 构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增hTERT,插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度.Western-Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达.结果 成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2.79×107Tu/mL,Western-Blot检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达.结论 含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞,并阳性表达目的基因.
-
一种视黄酸可控的绿色荧光蛋白表达研究
目的成功构建带有视黄酸反应元件(RARE)-TK启动子控制的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因表达载体,并验证该载体转染HL60细胞后全反式视黄酸(ATRA)依赖的eGFP表达.方法采用常规分子克隆方法构建真核表达载体pRARE-TK-eGFP,经脂质体转染肿瘤细胞;ATRA处理后检测细胞增殖功能变化和经荧光显微镜直接观测eGFP表达变化情况.结果ATRA处理转染HL60细胞后,eGFP呈视黄酸(RA)时间剂量依赖性表达增高.结论ATRA可通过RARE调控TK启动子下游的eGFP报告基因表达.
-
人生长激素重组载体的构建及其在原代成纤维细胞中的表达
早在1987年,生长激素(GH)基因即被成功克隆,随即开展了基因治疗的有关研究,但其进入临床试验的阻碍主要是缺少一个高效、易操作的基因治疗系统,尤其是靶细胞的问题,尽管传代细胞系易培养,但存在免疫排斥反应和肿瘤形成的危险.本实验以原代小鼠胚胎成纤维细胞为靶细胞,以逆转录病毒为基因表达载体,建立一个可操作的基因治疗系统.
-
人β-神经生长因子基因重组真核表达载体的构建
目的构建β-神经生长因子(β-NGF)基因重组真核表达载体,为β-NGF基因治疗和临床实验诊断研究打下良好的基础.方法将质粒PGEM-β-NGF进行酶切获得β-NGF基因片段,用T4连接酶将其插入真核表达载体PcDNA3;以T7、P2为引物进行PCR,论证插入片段的方向;经测序和酶切对插入片段进行分析和进一步鉴定.结果 PCR产物琼脂糖电泳结果显示:在预期位置有阳性条带;序列分析和酶切结果证实插入片段序列正确.结论β-NGF基因重组真核表达载体PcDNA3-β-NGF构建成功,为进一步开展β-NGF基因治疗神经系统疾病和临床实验诊断奠定了基础.
-
天然型EGFP在无细胞翻译系统中的可溶表达
目的:构建能在无细胞翻译系统中表达天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体.方法:以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,NcoI和HindⅢ双酶切EGFP基因和pET28a载体.T4 DNA连接酶连接,转化E.coli DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定.正确重组的载体命名为pET28a-EGFP.在无细胞翻译系统中加入大抽后的pET28a-EGFP模板(0.6 mg/ml),孵育3 h.荧光显微镜观察荧光.Western blot鉴定EGFP.结果:测序证实重组EGFP基因序列与基因库中的序列完全一致,荧光显微镜下观察到无细胞翻译系统中强烈荧光,Western blot证实分子量约为27 kD的EGFP高效表达.结论:成功构建了能在无细胞翻译系统中高效表达可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步建立荧光强度标准物奠定了基础.
关键词： 增强绿色荧光蛋白(EGFP) 重组载体 无细胞翻译系统 原核表达 -
单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录子蛋白读码框2真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达
目的:克隆单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录子蛋白读码框2(LAT ORF2)基因,构建真核表达载体并在真核细胞中表达,用于进一步研究LAT介导的HSV-2潜伏及激活感染机制. 方法：以构建成功的pVAX—LAT重组质粒为模板,根据GenBank中HSV-2 LAT ORF2基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入Kpn I和Pst I酶切位点.用PCR特异性扩增LAT基因ORF2片段,PCR产物纯化回收后经Kpn I、Pst I双酶切,再次回收后产物与同样经双酶切的pcDNA 6／myc—His B质粒进行连接,Amp抗性筛选阳性重组子．双酶切及测序鉴定连接产物.在脂质体介导下瞬时转染Vero细胞,用RT-PCR及SDS-PAGE检测其在Vero细胞中的表达. 结果：重组质粒经Kpn I和Pst I双酶切获得预期大小的两条片段,测序表明ORF2正确,RT-PCR及SDS-PAGE显示转染了重组质粒的Vero细胞内有目的基因及其编码蛋白的表达. 结论：成功构建了ORF2-pcDNA 6／myc-His B重组质粒,并可在Veto细胞内有效表达.
-
人ClC-2基因小分子干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定
目的:构建靶向人ClC-2基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体. 方法:根据DEQOR提供的siRNA设计原则和程序,设计两个靶向ClC-2基因的发夹状siRNA;通过化学合成的方法合成两对分别互补的寡核苷酸链,退火后得到编码该siRNA的ClC-2基因片段.将该片段连接至经BglⅡ和HindⅢ双酶切的真核细胞表达载体pSUPER.puro的多克隆位点,转化扩增提取质粒;对重组质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定.脂质体LipofectamineTM2000介导瞬时转染,通过RT-PCR检测人胶质瘤细胞系BT-325细胞中ClC-2 mRNA表达. 结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与真核细胞表达载体pSUPER.puro连接正确.转染两重组质粒细胞的ClC-2 mRNA表达明显降低. 结论:成功构建人ClC-2基因干扰真核表达载体2个,分别命名为pSUPER.puro-siClC-21和pSUPER.puro-siClC-22,可用于进一步研究ClC-2基因对人胶质瘤侵袭和迁移活动的影响.
-
大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建靶向大鼠CD40基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体.方法:利用Ambion公司的网上设计工具,设计2个靶向CD40基因的发夹状siRNA,通过化学合成的方法合成2对分别互补的寡核苷酸链,退火后将双链DNA片段连接至pSilencer4.1-CMV neo vector的多克隆位点,转化扩增提取质粒,对重组质粒进行BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定.结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与pSilencer4.1-CMV neo vector连接正确,靶向大鼠CD40基因的siRNA重组表达质粒构建成功.结论:成功构建了大鼠CD40基因的RNA干扰真核表达载体pSilencer4.1-CMV-CD40.1和pSilencer4.1-CMV-CD40.2,为进一步研究CD40基因在同种器官移植排斥反应中的作用奠定基础.
-
肝炎病毒性肝炎免疫学预防的进展
(上接第 6卷第 1期专家笔谈)③口服疫苗-正在研制能表达 HBsAg的转基因植物,如香蕉,可作为食用疫苗;④新送递系统-利用疫苗、腺病毒或沙门菌等作为 HBsAg的重组载体,以增强 HBsAg的免疫原性,诱导特异性免疫力;⑤前 S疫苗-该疫苗将具有高度的免疫原性 [25].
-
人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定
目的 构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体.方法 针对ERRα mRNA设计了4条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定.用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelperl.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果.结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml.转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低.结论 成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础.
关键词： 雌激素受体相关受体α RNA干扰 重组载体 子宫内膜癌 -
GFP/HBxn、 GFP/HBxc融合蛋白重组载体的构建和稳定表达细胞系的建立
目的 分别构建绿色荧光蛋白(GFP)与氨基端或羧基端缺失突变乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的重组表达载体,建立稳定表达GFP/HBxn、GFP/HBxc融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响.方法 PCR法分别扩增氨基端缺失50aa的HBx及羧基端缺失50aa的HBx基因,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切定向插入pEGFP-C1相应酶切位点并转化宿主菌DH5α,双酶切鉴定pGFP/HBxn、pGFP/HBxc;脂质体转染法转染HepG2细胞,G418筛选出抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP的表达,挑选抗性克隆细胞扩大培养并传代.RT-PCR法、Western blot法检测转染细胞HBxn、HBxc基因、蛋白的表达.结果 扩增的HBxn、Hbxc基因片段琼脂糖凝胶电泳显示符合预估大小.重组质粒pGFP/HBxn、pGFP/HBxc经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后电泳,符合预估大小;转染pGFP/HBxn及pGFP/H Bxc的HepG2细胞可见抗性细胞克隆形成,并可见阳性克隆细胞均有GFP表达.RT-PCR与Western blot法检测到HBxn、HBxc的表达.结论 成功构建了GFP/HBxn、GFP/H Bxc真核重组表达载体pGFP/HBXn、pGFP/HBxc,获得了稳定表达GFP/HBxn、GFP/H Bxc融合蛋白的HepG2细胞系,为进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响奠定了基础.
-
HBVC 区基因真核表达载体的构建及转染
目的：构建含乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）增强子Ⅱ（enhancerⅡ，EnhⅡ）、核心启动子区（basal core promoter，BCP）和 C 区基因的真核表达载体，以研究 EnhⅡ、BCP 和 C 区基因的生物功能。方法提取 HBV DNA，PCR 法扩增 EnhⅡ-BCP-C 区基因片段；HindⅢ和 XbaⅠ双酶切 PCR 产物，胶回收纯化的 DNA 片段，连接入载体 pBudCE4．1，酶切及 DNA 测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体 DNA 转染 HepG2细胞和HeLa 细胞，酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的 HepG2细胞、HeLa 细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎 e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）的表达水平。结果双酶切及 DNA 测序鉴定，含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C 区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ＋BCP＋C／pBudCE4．1重组载体转染 HepG2细胞24、48 h 后的上清液和转染48 h 后裂解物中 HBeAg 表达水平均明显高于 pBudCE4．1空载体转染 HepG2细胞（均 P＜0．05），EnhⅡ＋BCP＋C／pBudCE4．1重组载体转染 HeLa 细胞24、48 h 后的上清液和转染48 h 后的裂解物中 HBeAg 表达水平与pBudCE4．1空载体转染 HeLa 细胞比较差异均无统计学意义（均P＞0．05）。结论成功构建 HBV EnhⅡ-BCP 启动-C 基因肝细胞特异表达的真核载体，有利于进一步研究 EnhⅡ、BCP 和 C 区基因某些突变位点的生物学意义。
