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核心蛋白聚糖和细胞因子的相互作用
核心蛋白聚糖(decorin)为蛋白聚糖(PG)的一种,属分泌型的富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族,由于其能修饰胶原原纤维因此也称为饰胶蛋白聚糖.decorin由富含亮氨酸的核心蛋白和一条糖胺聚糖链组成,在调节细胞黏附、迁徙、增殖,胶原纤维形成及对转化生长因子(TGF)-β活性调节中起重要作用.近来发现decorin高表达可以使TGF-β和白细胞介素(IL)-1β的水平降低,相反,使IL-4和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平升高,说明decorin在细胞因子产生的调节中起着重要作用[1].细胞因子是由免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞等产生的调节细胞功能的高活性多功能蛋白多肽分子.细胞外基质(decorin其中之一)的形成和改变受各种细胞因子的影响[2].decorin可以与多种细胞因子相互作用,下面就decorin与TNF-ot、干扰素(IFN)-γ、IL-6等细胞因子的相互作用作一简单综述.
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泛素特异性修饰酶2-69对大鼠系膜细胞内饰胶蛋白聚糖表达和泛素化降解的调节
目的 研究泛素特异性修饰酶2-69(USP2-69)对系膜细胞(MC)内饰胶蛋白聚糖(DCN)表达和泛素化的调节作用.方法 ①培养MC细胞,采用Western blot法检测大鼠肾MC内USP2-69的表达;②采用免疫共沉淀、激光共聚焦和免疫荧光法,检测MC内USP2-69是否与DCN结合,并观察两者在MC内的定位;③将pRK5-USP2-69-HA质粒瞬时转染MC后,用Western blot法检测HA、USP2-69和DCN的蛋白表达,用免疫共沉淀法检测DCN的泛素化水平;④采用USP2-69siRNA处理MC,用PCR检测USP2-69和DCN的mRNA表达,用time-course Western blot法检测DCN的半衰期,Westernblot法检测DCN的下游效应分子(TGF-β1和ColⅣ)的蛋白表达.结果 ①USP2-69在MC、肝细胞(BRL-3A)和足细胞(GEC)内均有表达,其在MC内的基础蛋白表达水平显著高于BRL-3A和GEC[MCs:(0.27±0.05),BRL-3A:(0.035±0.009),GEC:(0.012 ±0.004),P＜0.01].②MC总蛋白经DCN抗体免疫沉淀后,可检测到USP2-69的表达;经USP2-69抗体免疫沉淀后,可检测到DCN表达;且在MC胞质内,代表USP2-69蛋白的荧光与代表DCN蛋白的荧光存在共定位.③转染pRK5-USP2-69-HA质粒的MC内可检测到代表外源性USP2-69表达的HA蛋白,USP2-69和DCN蛋白表达的升高,同时DCN的泛素化水平明显降低.④经USP2-69 RNA干扰的MC内DCN的mRNA水平没有明显改变,但其半衰期明显缩短(3 h),且TGF-β1和ColⅣ的蛋白表达均明显升高.结论 大鼠肾MC内USP2-69可与DCN相结合,及两者在胞质内共定位,USP2-69能够降低MC内DCN的泛素化水平及提高DCN蛋白总量并促进其功能.
关键词： 饰胶蛋白聚糖 泛素特异性修饰酶2-69 系膜细胞 -
大鼠肾系膜细胞饰胶蛋白聚糖乙酰化可增强其蛋白质稳定性和功能
目的 通过细胞学研究检测大鼠肾系膜细胞饰胶蛋白聚糖(decorin,DCN)的乙酰化及其对系膜细胞泛素化的影响作用.方法 体外培养大鼠肾系膜细胞,应用免疫共沉淀、蛋白质电泳分析及RT-PCR等检测DCN的表达改变.结果 大鼠肾系膜细胞存在DCN乙酰化修饰,且DCN的乙酰化修饰抑制了DCN泛素化降解,促进了DCN蛋白质的稳定.此外增强DCN乙酰化修饰可促进转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)以及Ⅳ型胶原的下调,同时抑制肾系膜细胞的生长.结论 DCN乙酰化修饰可抑制DCN降解,增强DCN抗肾炎的作用,在防治系膜细胞增生性肾炎中可作为潜在的干扰靶点.
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DCN基因转染对大鼠肾系膜细胞生长及表型改变的影响
目的通过观察转染DCN基因的大鼠系膜细胞(MsC)生长及其一些表型的改变,为其用作细胞载体回输入大鼠肾病模型体内进行基因治疗奠定实验基础.方法采用MTT比色法和流式细胞仪技术,检测该MsC株生长情况;Northern blot和Western blot法检测其TGF-β1 mRNA、ColⅣmRNA和TGF-β1蛋白表达水平;半定量RT-PCR法检测其TIMP-2 mRNA表达的改变.结果与未转染MsC相比,转染DCN基因的MsC株的生长受到明显抑制(5 d时P＜0.05,6 d时P＜0.01);G0/G1期比例增加,S期比例降低,提示其生长缓慢;TGF-β1和ColⅣmRNA表达明显降低,TGF-β1蛋白分泌减少;TIMP-2 mRNA表达明显下调.结论转染DCN基因的MsC可被用作载体开展对大鼠系膜增生性肾炎的实验治疗.
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稳定表达饰胶蛋白聚糖基因的大鼠肾小球系膜细胞株的建立
目的研究将饰胶蛋白聚糖(decorin，DCN)基因转染大鼠肾小球系膜细胞的可行性。方法 RT-PCR法扩增大鼠DCN基因，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1A-DCN，采用脂质体将其转入大鼠MsC，经G418筛选阳性克隆，Western blot及RT-PCR法鉴定。结果成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1A-DCN，转染MsC并筛选出2个阳性克隆株。结论构建载有DCN基因的MsC载体，为其开展对肾小球疾病模型的基因治疗提供了良好的实验基础。
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饰胶蛋白聚糖的多种生理功能及其作用机制
饰胶蛋白聚糖(decorin,DCN)是一种小分子蛋白聚糖,广泛存在于细胞外基质中,富含亮氨酸,因其能够修饰胶原原纤维而得名.近年来对DCN抑制器官纤维化、抗肿瘤生长及其他生理作用等研究,尤其是可能的作用机制方面均取得了重大的进展.
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饰胶蛋白聚糖与转化生长因子β1对大鼠肾系膜细胞生长及相关信号途径的影响
目的 探讨饰胶蛋白聚糖(DCN)与转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠肾系膜细胞(MsC)生长及相关信号途径的影响.方法 经脂质体介导将DCN基因转染体外培养的大鼠肾MsC,经筛选和鉴定后,收集阳性细胞克隆的培养上清(DCN上清).采用流式细胞仪检测经TGF-β1(2 μg/L)和(或)DCN上清作用后MsC细胞周期的变化.采用Western印迹法分别检测两者单独或联合作用后,MsC磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-MAPK)、磷酸化Smad2(p-Smad2)和p21蛋白表达情况.采用免疫共沉淀方法检测阳性细胞克隆上清中DCN与TGF-β1的结合情况.结果 TGF-β1或DCN上清单独作用时均可抑制MsC的增殖,G2-M期细胞数分别为对照组的81%及86.5%,而两者共同作用时G2-M期细胞数与对照组差异无统计学意义.经TGF-β1和DCN上清单独作用12 h后,p-ERK1/2表达为对照组的4.4、3.7倍和3.2、3.7倍;p-SAPK/JNK表达为对照组的2.0、1.5倍和1.9、1.5倍;而两者共同作用组p-ERK1/2和p-SAPK/JNK表达与对照组差异无统计学意义.TGF-β1单独作用12 h后,MsC p-Smad2的表达为对照组的2.6倍,而DCN单独作用组及2者联合作用组其表达与对照组差异无统计学意义.DCN单独作用12 h后p21蛋白的表达为对照组的2.6倍,而TGF-β1单独作用及2者联合作用组其表达与对照组差异无统计学意义.阳性细胞克隆上清中DCN可以直接与TGF-β1结合.结论 TGF-β1与DCN单独作用均可抑制MsC增殖及激活MAPK信号途径,但2者共同作用时其作用相互抵消.TGF-β1激活Smad信号途径作用可被DCN阻断;DCN上调p21蛋白作用可被TGF-β1阻断.2者通过不同信号分子抑制细胞生长,其作用可能与两者相互结合有关.
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饰胶蛋白聚糖基因转染对大鼠肾系膜细胞转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体表达的影响
目的探讨饰胶蛋白聚糖(DCN)拮抗肾小球硬化进展的作用是否与其抑制系膜细胞(MsC)转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体(TGF-βR Ⅰ、TGF-βRⅡ)表达有关.方法经外源性TGF-β1刺激培养的大鼠肾MsC,采用RT-PCR、Western印迹法检测其TGF-βR Ⅰ、TGF-βRⅡ的表达.用脂质体介导法将DCN基因转染MsC,经筛选和鉴定,用RT-PCR、Western印迹法和免疫荧光法分别观察DCN基因转染对TGF-βR Ⅰ、TGF-βRⅡ表达的影响.结果经外源性TGF-β1刺激的正常MsC,其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ基因转录及蛋白表达均明显升高,且呈时间依赖性,于作用24 h达高峰.与转染空载体的MsC(1P-1)相比,转染DCN基因的MsC克隆(3D-5,7D-1)的TGF-βR Ⅰ mRNA表达分别为对照组的20%和32%,TGF-βRⅡmRNA表达分别为对照组的64%和59%;TGF-βR Ⅰ蛋白表达分别为对照组的34%和25%,TGF-βRⅡ蛋白表达分别为对照组的49%和57%.同时转染DCN基因也能阻止MsC对外源性TGF-βl刺激所致的两种受体表达升高作用.结论过表达DCN基因的MsC,其TGF-βR Ⅰ、TGF-βRⅡmRNA和蛋白表达水平均明显降低,这可能是DCN拮抗由TGF-β介导的肾小球硬化发生的重要机制之一.
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饰胶蛋白聚糖核心片段Leu155-Val260 cDNA克隆与表达
[目的]通过克隆并表达饰胶蛋白核心片断Leu155-Val260 cDNA,为进一步研究其是否具有饰胶蛋白聚糖全部或部分生物学活性功能莫定基础.[方法]根据GeneBank中报道的饰胶蛋白聚糖基因序列设计扩增Leu155-Val260cDNA片段结构区引物,将克隆正确的P155-260肽cDNA采用原核表达载体pBV220进行表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.[结果]通过测序证实所克隆的目的片段是饰胶蛋白核心片段Leu155-Val260 cDNA,表达产物经过SDS-PAGE电泳分析,得到大小与预期大小(12kd)一致的目的蛋白,可溶性达到95%以上.[结论]本研究成功地克隆并表达了饰胶蛋白聚糖核心片段Leu155-Val260 cDNA.
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重组腺病毒Ad-P2G-DCN的构建及在HEK-293细胞中的表达
目的 制备表达基质细胞衍生因子(SDF-1)拮抗剂P2G与饰胶蛋白聚糖(decorin,DCN)嵌合基因的重组腺病毒,并检测其在HEK-293细胞中的表达情况.方法 以前期构建的pET-30a+/P2G-DCN为模板,PCR扩增目的 基因P2G-DCN,并克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV;然后将化学合成的SDF-1信号肽序列插入P2G-DCN的5′端,构建为重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/SP-P2G-DCN;经PmeⅠ酶切线性化,与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,筛选重组腺病毒质粒pAd-SP-P2G-DCN.PacⅠ酶切线性化的pAd-SP-P2G-DCN通过脂质体介导转染人胚肾转化细胞系HEK-293,包装并扩增重组腺病毒Ad-P2G-DCN.荧光计数确定病毒感染滴度,并以Western blot法检测嵌合蛋白P2G-DCN在HEK-293细胞中的表达情况.结果 构建了携带P2G-DCN基因的重组腺病毒,该重组腺病毒感染HEK-293细胞后可高效分泌表达重组嵌合蛋白P2G-DCN.结论 成功构建了重组腺病毒Ad-P2G-DCN,为后续系统研究Ad-P2G-DCN在肿瘤基因治疗中的作用奠定了实验基础.
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饰胶蛋白聚糖的抗纤维化和抗肿瘤作用
饰胶蛋白聚糖(Decorin, DCN)属富含亮氨酸小分子蛋白多糖家族成员之一.大量证据表明:DCN通过结合并中和转化生长因子-β(TGF-β),干扰其与受体结合所致的胞外基质过度沉积,以产生抗纤维化和抑制疤痕形成的作用;DCN亦通过激活EGFR/MAPK/p21信号通路和抑制EGF-EGFR介导的促细胞增殖信号通路等机制,抑制肿瘤细胞增殖与转移.基于DCN以上两方面的生物活性,加之源于人体自身产生,其重组产品免疫原性较低,提示DCN对于慢性纤维化和肿瘤等疾病的防治具有潜在的药用开发价值.
