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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5～8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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丹参含药血清对肝星状细胞增生的抑制作用
目的:研究丹参含药血清对肝星状细胞(HSC)的增生抑制作用,并探讨中药抗肝纤维化筛选平台的建立.方法:测定HSC-T6细胞的细胞生长曲线和克隆形成率,观察其细胞增生状况.取原始血清体积分数的80%,40%,20%,10%,5%的丹参含药血清作用于HSC-T6细胞,观察其增生抑制效应及量效关系.结果:HSC-T6细胞的细胞群体倍增时间为10.57 h,克隆形成率为82.4%,说明该转化细胞系的活力较好,增生能力较强.在5-80%浓度范围之内,丹参含药血清抑制HSC细胞增生作用呈剂量依赖性(经直线回归分析,相关系数r=0.9487).结论:丹参含药血清能明显抑制HSC-T6细胞增生,呈剂量依赖性.
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苯丙芘诱导口腔上皮细胞癌变过程的差异基因表达谱分析
目的:检测并分析苯丙芘诱导的口腔上皮细胞癌变过程中基因表达的变化,寻找在口腔上皮细胞癌变过程中起重要作用的基因.方法:使用课题组前期建立的一株永生化细胞系,以及经过苯丙芘诱导而逐步产生的具有成瘤性的肿瘤细胞系[首代成瘤细胞(HB-56P)及典型鳞状细胞癌细胞(HB-94P)],通过Affymetrix U133 plus 2.0基因芯片,检测在永生化细胞(HIOEC)向成瘤细胞转化过程中的基因表达变化.使用GenSpring 7.0进行标准化及单因素方差分析,通过Venn图分析差异基因在癌变不同阶段的变化,并进一步通过GO术语进行注释.对部分基因使用实时定量PCR在细胞系中进行了验证.结果:在HIOEC向HB-94P转化过程中,共有883条差异基因,大部分集中于肿瘤发生的早期阶段.差异基因主要涉及大分子代谢、信号传导等生物学过程,具有过渡金属离子结合能力、腺核苷酸结合能力及激酶活性.其蛋白产物主要是膜结合蛋白,位于核内或细胞骨架.IGFBP3、S100A8、MAP2K、KRT6B、GDF15和MET的表达基本符合芯片结果.结论:本研究检测了苯丙芘相关口腔上皮细胞癌变过程中基因表达的变化,为苯丙芘相关的口腔癌分子发病机制研究提供了基础.
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淋巴母细胞端粒酶活性和成瘤性的关系
目的 EB病毒相关的淋巴母细胞(lymphoblastoid cell lines,LCLs)有较高的端粒酶活性.本实验旨在分析淋巴母细胞成瘤性与端粒酶活性的关系. 方法 采用端粒重复扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)分别测定淋巴细胞源性肿瘤细胞以及EB病毒相天淋巴母细胞的端粒酶活性,并对淋巴母细胞的成瘤性进行体内体外试验. 结果 5株EB病毒相关的LCLs端粒酶活性与细胞传代次数有关,它们都能在免疫缺陷小鼠体内致瘤. 结论 容易形成集落的细胞系更容易在小鼠体内致瘤,也具有更高的端粒酶活性.
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EB病毒相关淋巴母细胞样细胞系的建立及鉴定
目的 由于EB病毒与肿瘤的关系极为复杂且存在争议,淋巴母细胞样细胞系LCLs(lymphoblastoid cell lines)没有肿瘤形成过程中的复杂因素,从而成为了研究EBV介导的细胞永生化的佳模型.本实验旨在建立EBV原型株相关的永生化淋巴母细胞系,为后期LCLs的端粒酶活性及其体内外成瘤性的相关研究提供基础. 方法 利用体外培养B95.8细胞产生EB病毒原型株感染正常人外周血淋巴细胞培养传代得到5株EB病毒相关淋巴母细胞,并用RT-PCR对其进行了基因表达、流式细胞仪进行细胞表面标记以及核型的鉴定. 结果 淋巴母细胞样细胞系能不断传代,能表达EBV基因,具有成熟B细胞表面标记;细胞传代过程早期未发生核型改变. 结论 建立了5株永生化细胞株,分别为LCL1-5、LCL2-5、LCL3-5、LCL4-30、LCL5-30.
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软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性
目的:分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件,并对冬凌草甲素(oridonin,ORI)的抑瘤性和没食子酸乙酯(ethyl gallate,EG)促瘤性进行评价.方法:1)摸索实验条件:采用6孔板固态培养法,按不同密度(每孔500～20000个)将肿瘤细胞系(Hela,K562和HepG2)和转化细胞系(Bhas 42)与软琼脂混合铺板,计数克隆形成率.2)HepG2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50μg· mL-1的ORI溶液混合后铺板;Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3μg·mL-1的EG溶液处理后,镜下观察细胞达到转化状态后,与软琼脂混合铺板培养.经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响.3)利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响.结果:细胞接种密度为每孔1 000个左右时,利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好.ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低HepG2细胞的克隆形成率(P＜0.01),且对细胞增殖有抑制作用.EG随给药浓度增加可显著升高Bhas42的克隆形成率(P＜0.01),但对细胞增殖影响不显著.结论:软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标,可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性.该实验结果与细胞周期分析结果相互印证.两者的有机结合,可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析.
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真菌Cercospora beticola的12种毒素贝第高林对癌基因ras转导的肾上腺细胞生长的作用
AIM: To explore different effects of 12 beticolins, Cercospora beticola toxins, on ras-transformed adrenocortical cell growth inhibition and their functional mechanism.METHODS: Beticolin-induced inhibition was measured with survival cell number determined by an automated photocolorimetric method. The penetration of beticolin was examined by confocal microscopy. Ras protein determined by Lowry method were separated by 14 % SDS-PAGE and electroblotted to Immobilon-P transfer membrane and detected with pan-Ras (Ab-3) monoclonal antibody. The Ca2+ chelation by beticolin was investigated using a calcium ionophore. RESULTS: Cell growth inhibition was found dose- and time-dependently at submicromolar level for beticolin-1, -2, and -13 (IC50 ≤250 nmol/L) and for beticolin-0, 6, and-11 (400 nmol/L ＜ IC50 ≤ 500 nmol/L ). The inhibition by beticolin-1 was immediate, independent of cell culture step and not reversible for 3-day treatment. Beticolin-3 and -4 were slightly active (1 μmol/L ＜ IC50 ≤ 2μmol/L) and beticolin-7, -9, -12, and -5 were inactive at micromolar level. The beticolin-induced cell growth inhibition was correlated with the hydrophobicity of these compounds. Beticolin-1 fluorescence in RTAC cells was detected by confocal microscopy whereas beticolin-3 and -12 were not even after a 24 h incubation period.Beticolin-1-induced cell growth inhibition was partially reverted by calcium ionophore suggesting a role of intracellular Ca2 + chelation by beticolin-1 on cell growth inhibition. Furthermore, beticolin-1 blocked up Ras p21 translocation to membrane and induced accumulation of Ras in the cytosol as an inactive form by different ways.
