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应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活基因
目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV全S蛋白反式激活相关基因.方法以HBV全S表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HBV全S蛋白反式激活基因差异表达的cD-NA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取35个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得33个已知基因序列,和2个未知基因,通过生物信息学分析获得其全长序列,其中之一命名为全S蛋白反式激活基因1(CSTP1),已在GenBank中注册,注册号:AY553877.未知基因的功能还正在研究中.结论应用SSH技术成功构建了HBV全S反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV全S反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
关键词： 乙型肝炎病毒全S蛋白 反式激活 抑制性消减杂交 克隆 -
乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶反式调节蛋白1基因的克隆化研究
目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(DNA Polymerase)逆转录酶(RT)反式调节新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制.方法以HBV DNA聚合酶逆转录酶表达质粒pcDNA3.1(-)-RT转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆RT反式调节作用的新的靶基因.结果对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被HBV DNA聚合酶逆转录酶反式调节,故命名为DNA多聚酶反式调节蛋白1(DNA PTP1),已在GenBank中注册,注册号AY450389.DNAPTP1基因的编码序列全长为435个核苷酸(nt),编码产物由144个氨基酸残基(aa)组成.结论逆转录酶反式调节新靶基因DNAPTPl的发现,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒E1蛋白反式激活基因
目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV E1蛋白反式激活相关基因.方法以HCV E1表达质粒pcDNA3.1(-)-E1转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HCV E1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到89个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1 000 bp插入片段.挑取46个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得44个已知基因序列和2个未知基因.通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录.结论应用SSH技术成功构建了HCV E1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HCV E1反式调节的靶基因及致肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据.
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应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白的反式激活基因
目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(TP)反式激活基因的差异表达的cDNA消减文库,克隆TP反式激活相关基因.方法以TP表达质粒pcDNA3.1(-)-TP转染HepG2细胞,以空载休pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落聚合酶链反应(PCR)分析,得到34个200～1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,显示14种已知基因编码蛋白和1种未加功能基因序列,可能是TP反式激活靶基因.结论成功构建乙型肝炎病毒TP反式激活基因差异发达的cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
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肝硬化患者发生的肝细胞癌差异表达基因文库的构建及初步筛选
目的与肝硬化对比,研究肝细胞癌中差异表达的基因,构建在肝硬化基础上发生癌变的肝细胞之差异表达的cDNA消减文库.方法采用抑制性消减杂交获得差异表达基因片段,T/A克隆,蓝白斑筛选,在自动测序仪上进行基因测序,做同源性分析.结果经过巢式PCR扩增后,得到差异表达的cDNA,琼脂糖凝胶电泳显示为一弥散条带;35个差异表达的克隆被分离,基因表达序列标签长度在1l2～755bp之间.序列分析揭示28个克隆是来自以前描述过的基因,而另外7个在GenBank/EMBL/DDBJ数据库没有匹配序列,可能代表新基因.结论实验结果表明从肝硬化发展至肝细胞癌涉及到多个基因的差异表达;本研究在成功地构建出消减基因文库的同时,也证明了抑制性消减杂交技术对寻找差异表达基因是十分适用的.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制.方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析.结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1 000 bp的插入片断.挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因).结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与细胞基因表达及恶性转化相关的蛋白质编码基因,为HCV NS5A可能存在的调控机制提供新的线索.
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大鼠部分肝切除后再生肝组织中上调表达基因的克隆与分析
目的克隆肝再生中差异表达的基因,为终阐明肝再生的调控机制奠定基础.方法采用大鼠短间隔连续肝切除(SISPH)模型,用抑制性消减杂交技术(SSH)研究4～8 h之间差异表达的基因.结果用SSH分析0、4 h、8 h和12 h模型的4～8 h再生肝,筛选出33个与肝再生有关的上调表达序列标记(EST),其中17个为已在肝再生中报道的已知基因,6个为首次报道的已知基因,10个为大鼠中尚未报道的新基因,并对新基因在NCBI进行注册.结论在肝再生中SSH是一个分离肝再生差异表达基因的强有力工具,这些差异基因的分离,尤其是在肝再生中首次报道的已知基因和新基因的分离,可为进一步阐明肝再生的机制奠定基础.
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差异表达基因分析
细胞在增殖、分化及对外界刺激反应过程中,可伴随某些特殊基因的表达.利用这一特性,通过比较细胞在不同状态及不同分化阶段基因表达的差异,可以发现与细胞分化/生长相关的基因.近年来国外学者发展了几种能有效进行差异表达基因分析的技术和方法,包括差异显示PCR、代表性差异分析、抑制性消减杂交及DNA微阵列等.本文主要对目前主要技术方法作一综述.
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申克孢子丝菌酵母相和菌丝相cDNA消减文库的构建
目的 筛选与申克孢子丝菌酵母相与菌丝相双相转换相关的差异表达基因,为探讨其双相转换的分子的机制奠定基础.方法 应用抑制性消减杂交技术,构建高特异性的申克孢子丝菌菌丝相(mycelium,M)和酵母相(yeast,Y)的正反cDNA消减文库,并对其差异表达的基因进行生物信息学分析.结果 M+Y文库获得751条表达序列标签,平均长度为690.98 bp,经拼接后获得101条非冗余序列.Y+M文库获得875条表达序列标签,平均长度为575.9 bp,拼接获得249条非冗余序列.经BLASTN比对,这些差异表达基因中,某些结构基因和功能不明的细胞分子类基因可能与双相转换有关.结论 成功构建了高特异性的申克孢子丝菌菌丝相和酵母相的正反cDNA 消减文库,为进一步筛选申克孢子丝菌的双相转换基因奠定了基础.
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应用抑制性消减杂交技术克隆筛选丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建新基因丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2(HCVFBP2)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVFBP2反式激活相关基因.方法:以HCVFBP2表达质粒pcDNA3.1(-)-FBP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后选取48个克隆,进行菌落PCR分析,均得200～1000bp插入片断.挑取30个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得28个已知功能基因序列和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明HCVFBP2生物学功能提供理论依据.
关键词： 丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2 反式激活 抑制性消减杂交 -
新基因XTP3反式激活基因TPA的克隆化研究
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因.方法:依据我室构建的HBVX蛋白反式激活基因XTP3差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因XTP3TPA的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究.结果:发现了HBV XTP3反式激活作用的新的靶基因,命名为XTP3TPA.结论:这一发现为阐明HBVXTP3蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向.
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应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCV NS2蛋白的反式调节基因.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)-NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析.结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α-2-HS-糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled-coil-helix结构的新蛋白、未知功能基因.结论:成功构建HCV NS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索.
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应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP4反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5A-TP4反式激活相关基因,了解该基因的可能、生物学功能.方法:以NS5A-TP4表达质粒pcDNA3.1(-)-TP4转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,从总RNA中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到63个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得20种已知功能基因序列和5个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据.
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应用抑制性消减杂交技术克隆肾癌转移相关基因
目的:应用抑制性消减杂交技术构建人高侵袭性肾癌细胞和低侵袭性肾癌细胞间差异表达的cD-NA消减文库,筛选并克隆肾细胞癌转移相关基因.方法:采用涂有Matrigel胶的Transwell小室分离回收高、低侵袭性肾癌细胞,分别从高侵袭性肾癌细胞与低侵袭性肾癌细胞中提取polyA+RNA,合成双链cDNA,经RsaI酶切后将高侵袭性肾癌细胞cDNA分为两组并加上接头1和接头2,再与过量低侵袭性肾癌细胞cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,PCR产物与pMD18-T载体连接并转化JM109大肠杆菌构建成cDNA消减文库,文库扩增后随机挑取克隆进行测序及同源性分析.结果:文库共包含185个阳性克隆,随机挑取50个阳性克隆分析,其中45个克隆有插入片段.将其中15个有插入片段的克隆进行测序,表明源于7个已知基因.结论:利用抑制性消减杂交技术,从一对同源的高低转移表型差异的细胞株中获得了7条可能与肾癌转移相关的cD-NA序列,他们可能在促进肾癌转移中起到重要作用.
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用SSH方法构建BTCC患者尿脱落细胞差异表达基因的cDNA消减文库
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)方法构建膀胱移行细胞癌(BTcc)患者与正常人尿脱落细胞差异表达基因cDNA消减文库.方法:分别从BTCC患者与正常人尿液中提取总mRNA,用SMART技术反转录成cDNA,经过HaeⅢ酶切后将BTCC尿脱落细胞cDNA分为两组并接上接头,再与过量正常膀胱尿脱落细胞cD-NA进行两轮消减杂交及两轮抑制性聚合酶链反应(PCR),使得差异表达的DNA片段得以富集.PCR产物与T/A载体连接并转化大肠杆菌JMl09构建成差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后,随机挑取克隆进行酶切、测序及同源性分析.结果:PCR鉴定有317个克隆载有主要在200～900 bp之间呈随机分布的插人片段,片段插入率达82.6%,证实建库成功.对20个质粒测序结果经同源性比对分析,其中20个片段源于17个已知基因,1个克隆在GenBank中未检索到与其有相似性的基因序列,表明它们可能为BTCC差异表达的新基因.结论:该消减杂交文库质量可靠,其成功构建为进一步筛选、克隆BTCC差异表达基因提供了依据.
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哈萨克族食管癌差异表达基因的研究
目的筛选并克隆在哈萨克族食管鳞癌与正常食管组织之间差异表达的基因.方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析,构建哈族食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定食管癌组织特异表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析.结果成功构建了消减效率高的哈族食管鳞癌cDNA消减文库,对其中6个克隆的插入cDNA片断进行测序,经检索Genbank表明:这些差异表达基因与跨膜受体、乳腺癌转录因子、蛋白剪接基因及染色体1、8不同区域有较高的同源性.结论通过抑制性消减杂交技术构建了哈族食管鳞癌cDNA消减文库,并分析鉴定了部分差异表达基因,为进一步筛选鉴定食管鳞癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等提供了依据.
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重组β-干扰素上调HepG2细胞表达基因抑制性消减杂交技术筛选
目的利用抑制性消减杂交技术筛选重组β-干扰素(IFN-β)上调HepG2细胞表达基因.方法以重组IFN-β 2 000U·mL-1刺激对数生长期HepG2细胞,设经0.9%氯化钠注射液作用的HepG2细胞为阴性对照组;制备HepG2细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录合成cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与阴性对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行基因文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果成功构建了重组IFN-β作用HepG2后差异表达的cDNA消减文库.扩增后得到50个200～1 000bp插入片段的克隆,随机挑选其中31个插入片段测序,通过生物信息学分析获得其全长基因序列,共获得20种编码基因,其中1种为未知功能的新基因.结论通过该方法可筛选得到IFN-β作用于HepG2细胞后上调表达的部分基因,包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.
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人肺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选
目的 筛选高低转移能力人肺癌细胞株PG-BE1和PG-LH7间差异表达基因.方法 进行两次抑制性消减杂交,第一次以PG-BE1细胞株为实验方、PG-LH7株为驱动方构建正向消减文库;第二次以PG-LH7株为实验方、PG-BE1为驱动方构建反向消减文库.筛选出来的阳性克隆进行测序,并在Gene Bank数据库中进行同源性比较.结果 2个消减文库共得到122个阳性克隆,随机选取10个克隆测序并进行同源性分析,发现其中9条序列来自于已知基因,另外1条序列为新的基因序列标签.结论 成功构建了高低转移力人肺癌细胞株的双向消减杂交文库.
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肾阴虚证cDNA文库的构建
目的 探讨肾阴虚证的相关基因.方法 以辨病与辨证相结合,从糖尿病、慢性肾炎、狼疮性肾病以及亚健康状态等肾阴虚证入手,应用RNA微量扩增、抑制性消减杂交、基因克隆等技术和方法,分别构建肾阴虚证的cDNA子消减文库,再运用核酸分子杂交原理和PCR进一步筛选上述消减文库中的相同部分,以构建肾阴虚证的共同文库,然后将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒.结果 该研究成功地构建了肾阴虚证的cDNA文库,其中正向消减文库共获得625个阳性克隆,反向消减文库获得736个阳性克隆.结论 该研究初步构建了肾阴虚证的cDNA文库,为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础.
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应用抑制性消减杂交技术研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达
目的:研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达.方法:常规方法建立大鼠热适应模型,分别从正常大鼠及热适应大鼠肝脏细胞中提取总RNA并抽提mRNA,按照SSH常规操作方法,构建cDNA消减文库,筛选阳性克隆并加以鉴定以得到带有差异表达基因的克隆.结果:成功构建具有高消减效率的热适应大鼠肝脏细胞cDNA消减文库,筛选鉴定后发现6个克隆含有差异表达基因.测序结果显示其中3个分别为热休克蛋白基因Hspel、线粒体细胞色素氧化酶C亚单位和NADH脱氢酶亚单位Ⅲ基因ND3.结论:三种基因的差异表达证明了线粒体呼吸链功能的增强在细胞的代偿功能中的重要作用,线粒体在热适应时动物体对高温的代偿性反应中发挥着参与热耐力形成、提高机体抗热损伤能力的重要作用.
