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重组人骨形态发生蛋白2调控腰椎融合胰岛素样生长因子Ⅰ的表达
背景：骨形态发生蛋白2的成骨活性在许多实验中已被充分证实，但诱导成骨是一系列生物活性因子复杂的网络调节过程，不是单一因子的作用。目的：定量分析重组人骨形态发生蛋白2用于兔腰椎融合过程中，胰岛素样生长因子Ⅰ基因的表达水平。方法：将60只新西兰大白兔随机分为3组，分别在L5-6横突间植入自体骨、同种异体骨及复合骨(载有75μg重组人骨形态发生蛋白2的同种异体骨)，植入后7，14，21，28，35 d，取L5-6横突间植骨融合所形成的骨痂，应用实时荧光定量RT-PCR检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因的表达。结果与结论：3组胰岛素样生长因子Ⅰ的表达均随着植入时间的延长逐渐增加，至28 d 时达到高峰，随后下降。植入后7 d，自体骨组胰岛素样生长因子Ⅰ的表达高于复合骨组、异体骨组(P <0.05)；植入后14 d，自体骨组、复合骨组胰岛素样生长因子Ⅰ的表达高于异体骨组(P <0.05)；植入后21，28，35 d，复合骨组胰岛素样生长因子Ⅰ的表达高于自体骨组、异体骨组(P <0.05)。结果表明重组人骨形态发生蛋白2可有效促进骨融合过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的表达。
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碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵和外膜孔蛋白表达水平的研究
目的 探讨我国临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM和外膜孔蛋白OprD 2 表达水平及其与碳青霉烯类抗生素耐药性之间的关系.方法 收集我国15个省市28所医院临床分离的铜绿假单胞菌655株,琼脂稀释法测定该菌加入外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(CCCP)前后对亚胺培南和美罗堵南的MIC;RT-PCR检测外排泵MexAB-OprM和孔蛋白OprD 2 的表达水平;十二烷基硫酸钠一聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)检测外膜孔蛋白OprD 2 .结果 收集到的655株铜绿假单胞菌菌株对亚胺培南和美罗培南敏感率分别为52.5%和59.2%,加入CCCP前后其对亚胺培南和美罗培南的敏感率无明显变化;52.0%(51/98)美罗堵南耐药株MexAB-OprM显著高表达(P<0.05),43.7%(59/135)亚胺培南耐药株OprD 2 显著低表达(P<0.05),14.8%(20/135)亚胺培南耐药株OprD 2 表达缺失;SDS-PAGE和Western-blot显示与标准菌株PAO1相比.OprD2 表达水平减低菌株ZZ20显影减低,表达缺失菌株BJ1不显影.结论 MexAB-OprM表达升高和OprD<.2 表达降低甚至缺失是我国铜绿假单胞菌对美罗培南和亚胺培南耐药的重要机制.
关键词： 铜绿假单胞菌 外排泵 外膜孔蛋白 羟基氰氯苯腙 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 -
肝衰竭患者外周血单核细胞 HLA-DR 的表达
目的：探讨不同病因所致肝衰竭患者外周血单核细胞 HLA-DR基因mRNA表达及其意义。方法随机选取肝衰竭患者40例，其中嗜肝病毒感染10例、药物性肝损伤10例、酒精性肝损伤10例、自身免疫性肝病10例。10名健康对照为本院健康志愿者。应用 RT-PCR 法检测各组患者外周血单核细胞 HLA-DR 基因 mRNA 表达，并动态观察 HLA-DR 基因 mRNA 表达的变化，及其与病程发展及临床症状的关系。结果RT-PCR 结果显示嗜肝病毒感染组、正常对照组、药物损伤组、酒精损伤组、自身免疫组 HLA-DR 基因 mRNA 表达分别为（137．51±5．22）、（18．14±1．29）、（19．64±2．03）、（11．25±1．22）、（26．61±2．31），且呈逐渐降低趋势，组间差异均有统计学意义（P ＜0．05）。对不同病因组患者单核细胞 HLA-DR mRNA 表达进行动态观察发现，17例死亡患者 HLA-DR mRNA 表达持续下降直至患者死亡；另外23例患者，经治疗各组 HLA-DR mRNA 表达逐渐恢复至接近正常水平，临床症状同步改善。结论外周血单核细胞 HLA-DR mRNA 表达与肝功能衰竭的严重程度密切相关。
关键词： 肝衰竭 HLA-DR 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 -
尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)在舌鳞癌中的表达及意义
目的:探讨尿路上皮癌胚抗原Ⅰ (UCA1) mRNA在舌鳞状细胞癌中的表达及其与舌鳞癌病理分级和临床分期的关系.方法:采用SYBR Green Ⅱ实时荧光定量反转录聚合酶链反应实验方法,从6种基因中筛选出在40对舌鳞癌组织及配对正常舌组织样本中表达有明显差异的基因UCA1,扩大样本量至93例,检测UCA1 mRNA在两者中的表达.应用SPSS13.0软件包分析UCA1 mRNA表达量与舌鳞癌患者临床病理学特征的关系.结果:UCA1 mRNA在93例患者的肿瘤组织中平均表达量为0.7213,在正常舌组织中为0.2756,表达量有显著差异(P＜0.001);UCA1 mRNA的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小无关(P＞0.05),与舌鳞癌的病理分级和临床分期有显著相关性(P＜0.05).结论:UCA1 mRNA高表达与舌鳞状细胞癌密切相关,对舌鳞癌的诊断、判断病理分级和临床分期具有重要意义.
关键词： 舌鳞状细胞癌 UCA1 肿瘤分子标志物 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 -
川崎病患儿外周血单个核细胞中γ干扰素诱导蛋白10表达的意义
目的 探讨川崎病(KD)患儿外周血单个核细胞(PBMC)中γ干扰素诱导蛋白-10(IP-10)mRNA表达意义.方法 实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测42例KD及40例健康儿童PBMC中IP-10 mRNA表达.结果 KD组PBMC中IP-10 mRNA表达水平为0.741±0.161,明显高于健康对照组0.388±0.063(t=12.988 P=0);KD冠状动脉损伤(CAL)亚组PBMC中IP-10 mRNA表达水平为0.825±0.142,高于无冠状动脉损伤(non-CAL)亚组0.708±0.158(t=2.233 P=0.031);静脉注射人免疫球蛋白(IVIG)治疗后IP-10 mRNA表达水平为0.421±0.119,较治疗前0.728±0.170下降(P＜0.05),与健康对照组比较无显著性差异(P＞0.05);未予IVIG治疗者常规治疗后IP-10 mRNA表达水平为0.674±0.140,较常规治疗前0.780±0.131轻度下降,但无显著性差异(P＞0.05).结论 IP-10在KD患儿PBMC中表达增加,参与KD的发病过程,并与KD CAL发生有关,对PBMC中IP-10 mRNA表达抑制可能是IVIG治疗KD的作用机制之一.
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造血干细胞分化过程中HOXB6基因表达及干预研究
目的 探讨脐血造血干细胞(HSC)向粒-单系(CFU-GM)、红系(CFU-E)和淋巴系祖细胞(CFU-TL)增殖分化过程中HOXB6基因的表达情况及全反式维A酸(ATRA)对其的影响.方法 1.采用造血干/祖细胞体外培养技术,以ATRA持续干扰人类脐血造血干/祖细胞,观察HSC经人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和植物血凝素(PHA)分别诱导后,在培养第3天、第7天和第12天的CFU-GM、CFU-E及CFU-TL集落生成情况.2.采用实时荧光定量RT-PCR技术(FQ-RT-PCR)检测造血干细胞增殖分化过程中HOXB6基因的表达水平.结果 1.人类造血干细胞向CFU-GM、CFU-E和CFU-TL增殖分化过程中,各组细胞HOXB6基因均有表达.2.随时间推移,CFU-GM HOXB6 mRNA在增殖分化的第3天开始表达,第7天表达强烈,第12天表达明显减弱;CFU-E HOXB6 mRNA表达在第3天、第7天和第12天均持续增强;而在CFU-TL中,HOXB6 mRNA表达在第7天强烈,第12天表达减弱.3.与对照组比较,ATRA可上调各组HOXB6基因的表达.结论 1.在人脐血CFU-GM、CFU-E和CFU-TL的不同增殖分化阶段,HOXB6基因呈现持续稳定的表达,提示HOXB6基因与人类造血干细胞增殖分化过程密切相关.2.HOXB6基因在人类造血干细胞向CFU-GM、CFU-E和CFU-TL的正常增殖分化过程中呈现时间上的规律性.3.低浓度(60 umol·L-1)的ATRA能显著上调HOXB6基因的表达.
关键词： HOXB6基因 适血干细胞 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 -
细胞间黏附分子-1在急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠模型中的表达
目的 探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠模型中的表达及其意义.方法 雄性SD大鼠α-异硫氰酸萘酯(ANIT)50 mg/kg一次灌胃,建立急性肝内胆汁淤积性肝损伤动物模型,实时荧光定量PCR检测灌胃后大鼠24、48、72 h肝组织中ICAM-1 mRNA表达量,全自动生化分析仪检测其血清总胆红素(TB)、结合胆红素(DB)、ALT、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)水平.取大鼠肝组织行病理学检查.采用SPSS 12.0软件进行统计学分析.结果 模型组24、48、72 h肝组织ICAM-1 mRNA表达量分别为3.43±0.58、5.32±0.67、2.54±0.41,均显著高于对照组(Pa＜0.05);模型组24、48 h肝组织ICAM-1 mRNA表达量分别与同一时间点的血清TB、DB、ALT、GGT水平呈正相关(Pa＜0.05),模型组72 h肝组织ICAM-1mRNA表达量与其72 h时血清TB、DB、ALT、GGT水平无相关性(Pa＞0.05);模型组24、48、72 h肝组织ICAM-1 mRNA表达量均与同一时间点肝组织病理损伤程度分级呈正相关(Pa＜0.05).结论 ICAM-1在肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠肝组织中基因表达增高,其参与了胆汁淤积性肝损伤的病理过程.
关键词： 细胞间黏附分子-1 基因 胆汁淤积 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 -
结直肠癌中miR-31的表达及预测靶基因的生物信息学分析
目的 检测microRNA-31(miR-31)在结直肠癌中的表达及功能,预测其靶基因并进行生物信息学分析,为研究其作用和调控机制奠定基础.方法 采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测8种结肠癌细胞株、40例结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者癌组织及匹配的正常黏膜组织及33例结直肠腺瘤组织中miR-31的表达情况,并分析癌组织中miR-31表达与患者临床特征的关系.MTS法观察转染miR-31模拟物(mimics)组、抑制剂(inhibitor)组和对照组(miR-Control)及空白细胞组细胞生长的差异,Western blot检测空白细胞组、miR-31 mimics和inhibitor 三组细胞PCNA蛋白的表达.TargetScan、DIANA-microT、miRanda等软件预测miR-31的靶基因,并进行KEGG功能和信号通路富集分析.结果 miR-31在8种结肠癌细胞株中高表达,同时CRC患者癌组织中的表达高于腺瘤及正常黏膜组织(P＜0.05).其中癌组织和匹配的正常黏膜相比,miR-31表达明显上调(P=0.035),但腺瘤和正常黏膜相比,差异无统计学意义(t=0.122,P=0.904).miR-31的表达与临床病理特征间未见明显关系(P均＞0.05).转染miR-31 mimics后,miR-31的表达明显上调且和miR-Control组及空白细胞组相比,miR-31 mimics组细胞生长加快;而转染miR-31 inhibitor组miR-31表达显著降低,细胞生长活力明显受抑制.同时转染miR-31 inhibitor组PCNA蛋白表达较miR-31 mimics组和空白细胞组显著降低.生物信息学分析miR-31靶基因功能集中于转录后及翻译水平的调节、细胞连接、迁移及细胞运动等生物学过程.信号通路主要富集于内吞作用、轴突导向、T细胞受体信号通路、Wnt及MAPK信号通路.结论 miR-31在结直肠癌中高表达,且miR-31可以促进细胞生长和增殖,其靶基因可能通过调节多种生物学过程发挥作用.
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转录介导的扩增技术与real-time RT-PCR在人类免疫缺陷病毒检测中的应用
目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HIV RNA,探讨TMA技术扩增HIV RNA的敏感性及其与实时荧光定量反转录聚合酶链反应的比较.方法:利用TaqMan探针、特异性引物、鼠白血病反转录酶、T7-RNA聚合酶及PCR底物等建立TMA扩增体系.通过扩增一组10倍梯度稀释的HIV RNA转录标准品,评价TMA体系的灵敏性.收集60例HI感染患者的血浆,同时采用TMA试剂与Cobas Amplicor HIV-1 Monitor l.5版试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用线性回归和Bland-Altman法分析两种技术的相关性和一致性.结果:成功建立了TMA扩增体系,这种技术可以检测低至10 copies/mL的HI转录标准品.60份HI感染者血浆样本中,TMA及Cobas均检测到阳性46份,均阴性l2份,TMA检测阴性而Cobas检测阳性样本2份,检测一致率为96.7％.两种技术阳性检出率差异无统计学意义(P＞0.05).对其中46份TMA检测和Cobas检测均有定量结果的血浆进行线性回归分析,两种技术有非常好的相关性(r=0.997,P＜0.001).Bland-Altman分析显示两种检测方法定量Lg差值平均值为0.02,44份(95.7％)样本在95％的一致性界限内.结论:TMA技术具有高灵敏性潜能.TMA与real-time RT-PCR检测血浆中HIV RN具有非常好的相关性与一致性.
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不同试剂盒对乙脑病毒RNA提取效能的比较
目的 比较常见的3种商售RNA提取试剂对乙脑病毒检测的相对效率、耗时和成本,为实验室应用及检测结果的评价提供依据.方法 对乙脑病毒参考株悬液作10-1～10-4系列稀释,选用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit、Sangon生物公司的RNA提取试剂盒和Invitrogen公司的Trizol试剂3种核酸提取方法提取上述样本RNA,用TaqMan实时荧光定量反转录聚合酶链反应对其提取效率进行评价,并比较3种试剂(盒)的耗费时间和价格.结果 对不同稀释度乙脑病毒样本的检测,均以QIAGEN公司QIAamp Viral RNA MiniKit检测的敏感度高.以该试剂盒的提取效率为100%,则Invitrngen和Sangon生物公司RNA提取试剂(盒)的提取效率分别为77.4%～86.8%和64.2%～74.1%.3种试剂(盒)对cDNA起始模板量的估计也有明显的影响,差别达到1～3个数量级,以QIAGEN公司的试剂盒敏感.3种试剂(盒)提取RNA耗时分别为60 min、100 min和70 min,价格效率比分别为46元、23元和20元.结论 RNA提取试剂可影响JEV荧光定量PCR检测的结果,各实验室应根据实验目的 和实验室条件,合理选择病毒RNA提取试剂盒.
关键词： 乙脑病毒 RNA提取 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 -
转移抑制基因NM23-H1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
目的 探讨肿瘤转移抑制基因(nm23-H1)mRNA 在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC临床病理特征间的关系.方法 采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time qRT-PCR)方法检测48例NSCLC癌组织、10例癌旁正常肺组织以及10例良性疾病肺组织中nm23-H1 mRNA的表达水平.结果 nm23-H1 mRNA在NSCLC组的表达水平为(0.599±0.566),明显低于癌旁组的(1.232±0.328)及良性疾病肺组的(1.443±0.427)(P＜0.01);NSCLC组中NM23-H1的低表达与肿瘤病理类型、癌细胞分化程度、淋巴结转移和临床分期有关(P＜0.05),而与患者年龄、性别以及吸烟情况无关(P均＞0.05).结论 NSCLC组织中nm23-H1低表达,其表达量降低与NSCLC的侵袭、转移和预后有关.
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2013～2014年平顶山市流感病毒实验室检测结果分析
目的：分析平顶山市2013～2014年流感病毒实验室检测结果，及时掌握流感病毒类型，为防控工作提供依据。方法采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应对哨点医院（平顶山市第一人民医院）采集的流感样病例标本进行核酸检测，并用狗肾传代细胞（MDCK），通过血凝、血抑实验分离毒株。结果2013～2014年共检测流感样病例标本1296例，阳性标本231例，总阳性率为17.82%。2013年阳性标本主要集中在1～3月，以新甲型H1N1型流感病毒为主；且11～12月为高发时期， B型流感病毒为绝对优势毒株。2014年阳性标本主要集中在1～3月，以新甲型H1N1型流感病毒为主；且8～12月为高发时期，季节性H3型流感病毒为唯一检出类型。2013～2014年共分离出32株毒株，其中B型Yamaga-ta系7株，新甲型H1N1型1株，季节性H3型24株。结论应及时分析流感病毒特征及流行趋势，尽力避免流感大流行的发生。
