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基因工程鼠Muc1-MBP融合蛋白的制备及其免疫活性测定
目的:制备鼠Muc1-MBP融合蛋白,探讨其免疫活性.方法:将pMAL-Muc1转化大肠杆菌,通过IFTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定Mucl的表达,Amylose resin亲和层析纯化Muc1-MBP.将Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测小鼠血清Muc1特异性抗体的水平;MTT法测定小鼠抗Muc1特异的CTL活性;ELISPOT法测定脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌.结果:获得稳定表达Muc1的菌株,制备了分子量67 kD较纯的Muc1-MBP融合蛋白.Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠产生高效价Muc1特异抗体,效价在8 000~16 000之间,Muc1-MBP融合蛋白可诱导CTL杀伤活性,对人乳腺癌MCF-7和小鼠Lewis肺癌LLC1靶细胞的杀伤率分别为(74.5±5.9)%和(60.5±10.4)%,与对照组比P<0.05,差异显著;Mucl.MBP融合蛋白免疫可诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,特异性活化Th1细胞.结论:成功制备莺组鼠Muc1-MBP融合蛋白,其不仅能诱导特异体液免疫应答,而且可诱导细胞免疫应答,尤其能诱导对人类MCF-7细胞较小鼠lewis肺癌LLC1细胞更加强烈的CTL杀伤活性,提示异种同源蛋白疫苗具有比同源蛋白疫苗更好的抗肿瘤作用.
关键词： 鼠Muc1 Muc1-MBP融合蛋白 CTL活性 异种同源蛋白 肿瘤疫苗 -
超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价
目的：评价超滤技术去除纯化后重组 MUC1-MBP融合蛋白（MUC1-MBP）溶液中内毒素的效果，阐明超滤技术对去除内毒素的作用。方法：选取表达 MUC1-MBP大肠杆菌基因工程菌，分别通过 CM Sepharose FF离子交换层析（CM）（CM 组）、CM 联合 Phenyl Sepharose 6 FF 疏水层析（C6）（CM＋C6组）、CM 加超滤（CM＋超滤组）以及CM联合C6加超滤（CM＋C6组＋超滤）进行纯化，并去除内毒素；采用 SDS-PAGE 分析蛋白纯度；鲎试剂显色基质法检测内毒素表达水平。结果：SDS-PAGE分析，在预期相对分子质量62000处呈现单一条带， Quantity One分析纯度＞96％；CM组与CM＋C6组内毒素表达水平均较高，但2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与 CM 组比较， CM＋超滤组内毒素表达水平明显降低（P＜0.01）；与 CM＋C6组比较， CM＋C6超滤组内毒素表达水平明显降低（P＜0.01）；CM＋超滤组与CM＋C6＋超滤组内毒素表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：CM或 CM联合 C6均不能有效去除内毒素，其中 C6对去除内毒素几乎无作用；CM加超滤可有效去除内毒素，超滤技术在去除内毒素中发挥重要作用。
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重组人MUC1-MBP融合蛋白的抗肿瘤作用
目的:研究重组人MUC1-MBP的抗肿瘤作用.方法:用重组人MUC1-MBP皮下注射途径免疫健康鼠,采用MTT法测定小鼠抗MUC1特异的CTL活性;通过免疫鼠成瘤及荷瘤鼠治疗实验检测其对肿瘤的预防和治疗作用.结果:MUC1-MBP免疫鼠CTL对MCF-7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为(47.7±4.3)%和(67.5±6.5)%;免疫鼠成瘤结果免疫组小鼠共长5个肿瘤,存活时间明显延长,对照组共长51个,平均生存时间23 d;荷瘤鼠治疗结果显示治疗组小鼠肿瘤平均体积386mm3,对照组小鼠肿瘤平均体积4 000 mm3.结论:重组人MUC1-MBP具有明显的治疗、预防肿瘤和抑制肿瘤转移的作用,有希望发展成人类抗肿瘤疫苗.
关键词： Muc1-MBP融合蛋白 CTL活性 肿瘤疫苗 -
重组人MUC1-MBP融合蛋白诱导小鼠Th1活化
目的 检测重组MUC1-MBP融合蛋白对小鼠Th1细胞的活化作用.方法 通过生物活性法测定MUC1-MBP免疫鼠脾细胞培养上清液中IL-2、IFN和血清中TNF水平;通过免疫组织化学染色法检测CD4+T细胞在肿瘤组织中的浸润.结果 MUC1-MBP免疫鼠脾细胞分泌IL-2和IFN及血清TNF水平较对照组明显增高;MUC1-MBP诱导小鼠CD4+T细胞在肿瘤组织中浸润.结论 重组人MUC1-MBP融合蛋白可激活小鼠Th1细胞.
关键词： Muc1-MBP融合蛋白 Th1细胞 细胞因子 -
重组鼠Muc1-MBP融合蛋白疫苗体内抗肿瘤作用
目的:研究重组鼠Muc1-MBP蛋白的体内抗肿瘤作用.方法:采用皮下注射法将不同剂量Muc1-MBP蛋白免疫小鼠,2 wk/次,共免疫3次.在第3次免疫后4 d,给予C57BL/6小鼠尾静脉注射LLCl细胞,或给予5 Gy x射线照射的ICR小鼠背部皮下注射MCF-7细胞.注射3 wk后剥离并测量肿瘤大小;肿瘤组织行常规HE染色.免疫组织化学染色分析肿瘤周围浸润的淋巴细胞亚群.结果:LLCl细胞尾静脉接种后21 d,肺肿瘤结节对照组,Muc1-MBP 0.15 g/L组小鼠分别为54和39个(100%),Muc1-MBP 0.3 g/L组小鼠共计17个(60%),提示Muc1-MBP 0.3 g/L组可显著抑制肺癌的生长(P<0.05),Muc1-MBP0.15 g/L组作用较弱.皮下接种MCF-7细胞后21 d,对照组,Muc1.MBP0.15 g/L组小鼠100%(6/6)可见乳腺癌瘤体形成,平均体积分别为(142.8±70.2)和(96.1±53.4)mm~3,Muc1.MBP 0.3 g/L组瘤体形成66.7%(4/6),平均体积为(54.5±46.7)mm~3.表明Muc1-MBP 0.3 g/L组免疫后可显著抑制人乳腺癌移植瘤生长(P<0.05),Muc1-MBP 0.15 g/L组作用较弱.免疫组化结果显示MucI-MBP免疫组肿瘤周围有大量CD4~+和CD8~+T的细胞浸润到肿瘤周围.结论:Muc1-MBP诱导免疫能够明显抑制LLC1,MCF-7细胞的生长,为临床应用研究奠定了基础.
关键词： MUC1 Muc1-MBP融合蛋白 异种同源蛋白 肿瘤疫苗
