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柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV基因的克隆及阻断
从柔红霉素产生菌SIPI-1482菌株基因组DNA中PCR扩增得dnmV及其上游dnmU基因片段.利用同源重组对SIPI-1482菌株的dnmV基因进行基因阻断,得到一株遗传稳定的破坏子.验证了在该菌株中进行同源重组所需交换臂长度.
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RNAi的作用机制及其应用
由双链RNA介导的,序列特异的转录后基因沉默的过程称为RNAi(RNA interference).它是双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达的过程,是一门新兴的基因阻断技术.RNAi有望成为今后分析人类基因组功能的有力工具,在病毒感染、肿瘤、移植免疫等疾病的治疗上有很诱人的广阔前景.
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阻断CD40/CD40L共刺激通路延长大鼠移植肝脏存活时间
T细胞介导的免疫应答在移植排斥反应中起重要作用,共刺激信号在T细胞活化中是不可或缺的,CD40/CD40L可提供共刺激信号.我们利用腺病毒介导CD40Ig融合基因阻断CD40/CD40L通路,探讨其延长移植肝脏存活的机制.一、材料和方法1.材料:CD40、白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D公司),羊抗兔CD40多克隆抗体(Abcam公司).
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胃肠道及肝脏疾病的分子生物学与基因治疗
分子研究已经成为生物和临床医学研究不可缺少的部分,对疾病的分子和遗传机制研究的深化促进了对疾病发生机制的认识,并为疾病的诊断、治疗及预防提供了新的启示.人类疾病按分子机制可分为单基因性、复合基因性及获得性基因疾病.基因治疗据此可分为4种:基因替代、基因增强、基因阻断和基因疫苗.目前基因治疗在多方面取得了显著进展,但其靶向性和安全性在用于临床治疗前尚待进一步研究.胃肠道和肝脏疾病的分子诊断将来会成为处理病人的一部分,并完善现有诊断、治疗及预防策略.
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RNAi技术的特征及应用前景
RNAi(RNA interference)即RNA干扰,是近几年发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术.是一种双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程,也就是序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS).
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黑暗链霉菌安普霉素生物合成基因aprG的克隆和功能研究
从安普霉素产生菌S.tenebrarius H6总DNA中已克隆得到8.2kb的安普霉素抗性基因连锁片段.对距离抗性基因下游4.5kb的SacI-Sau3AI片段进行测序分析,发现了一个新的891bp开放阅读框架.推测其编码为296个氨基酸的蛋白质.经BLASTX程序分析,没有发现与之同源的基因,是一个新基因,该基因命名为aprG.构建基因阻断穿梭载体pSPU58,经接合转移导入S.tenebrariusH6,筛选单交换阻断变株,并用Southern blot验证阻断变株的aprG已经被破坏.经发酵分析,阻断变株不再合成安普霉素,表明aprG与安普霉素生物合成直接相关.
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Geldanamycin产生菌生物合成相关基因的克隆与分析
目的从geldanamycin产生菌吸水链霉菌(S.hygroscopicus)中克隆生物合成基因,为阐明生物合成机制及改造其结构奠定基础.方法以链霉菌/大肠埃希氏菌穿梭cosmids pKC505为载体构建了插入片段为20~30kb的S.hygroscopicus总DNA文库.以利福霉素中与3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合成相关基因为探针,经菌落杂交,Southern杂交筛选同源基因片段.测序结果与Genbank进行同源性比较分析,并以attp-噬菌体载体KC515利用基因阻断实验对克隆的基因片段进行功能鉴定.结果构建的基因文库含重组基因比率高、基因组覆盖率高,稳定性好.经同源基因探针杂交,从文库中筛选出9个阳性cosmids克隆pCGB20、pCGB26、pCGB28、pCGB29、pCGB36、pCGB45、pCGB49、pCGB63、pCGB75.测序分析表明,cosmidpCGB20中BamHI-BamHI 8kb片段两端的不完整ORF编码蛋白与竹桃霉素(oleandomycin)PKS Module 5、Module 6(一致性为79%)和红霉内酯合成酶ORF2(一致性为75%)、ORF1(一致性为73%)、ORF3(一致性为70%)高度同源;BamHI-BamHI 3kb片段一端与编码类结核分枝杆菌的磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶家族中半胱氨酸脱硫酶的DNA有同源性,该家族与AHBA合成酶关系密切.Cosmid pCGB20的BamHI-BamHI 8kb及BamHI-BamHI 3kb基因片段已通过基因阻断实验初步鉴定,证明它们参与geldanamycin生物合成.而其他cosmids阳性克隆的序列分析及功能研究尚在进行中.
关键词: geldanamycin 生物合成基因 基因文库 基因阻断 -
龟裂链霉菌工业菌中zwf1基因的阻断对土霉素生物合成影响
目的 运用代谢工程手段对龟裂链霉菌工业菌(Industrial Streptomyces rimosus,SRI)进行基因改造,提高土霉素(oxytetracycline,OTC)产量.方法 利用pKCl139质粒阻断SRI基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)编码基因zwf1.结果筛选得到一株OTC高产突变株,将突变株与原始菌株进行发酵,发现OTC产量比原始菌株提高了36.2%.结论 SRI基因组中zwf1基因的缺失使细胞合成土霉素的能力增强;龟裂链霉菌中初级代谢关键基因调控会影响次级代谢.
关键词: 龟裂链霉菌工业菌 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 基因阻断 土霉素生物合成 -
AHBA合酶基因的筛选与放线菌素D产生菌的发现
根据3,5-AHBA合酶基因序列的保守性所设计的简并引物,通过PCR的方法,从20株未知产物放线菌菌株中,获得两个AHBA合酶基因阳性菌株(S.violaceusniger 4353和Streptomyces rochei 4088).同源性分析显示,克隆到的3,5-AHBA合酶与已知的3,5-AHBA合酶蛋白序列有一定的同源性(86%~87%).对其中一株阳性菌株4353(S. violaceusniger 4353)的发酵活性产物进行了化学分离纯化和TLC、HPLC-UV、MS、1H.NMR和13C-NMR等分析结构鉴定,表明其发酵产生的一个活性成分为放线菌素D.基因单交换阻断实验结果证明,4353菌株所产生的放线菌素D确实与3,5-AHBA合酶基因相关.本文对获得这一结果的可能原因进行了讨论.
关键词: 3 5-AHBA合酶基因 基因阻断 放线菌素D -
反相高效液相谱型分析检测吸水链霉菌17997变株发酵新产物
以吸水链霉菌17997为出发菌株,分别阻断格尔德霉素(geldanamycin,GA)生物合成酶基因簇中的I型聚酮合酶(type Ipolyketide synthase,pks)基因的第6模块,单加氧酶(monooxygenase,gdmM)基因和氨甲酰基转移酶(carbamoyltransferase,ct)基因得到3种变株(pks-)、(gdmM-)和(ct-).比较变株与原株发酵产物的HPLC谱型,结合紫外吸收图谱分析.检测结果表明各变株的GA生物合成均被阻断,并产生3个不同于原始菌株的新物质.这证明基因操作所涉及的pks,gdmM和ct基因是GA生物合成的必需基因;这些基因的阻断可产生不同于原株的新物质.HPLC谱型比较可以在多样化代谢产物的产生菌中快速、准确地发现基因工程变株发酵产物的变化,指导新化合物的分离鉴定,样品用量甚微,是化学早期鉴别的有力工具.
关键词: 反相高效液相色谱 吸水链霉菌17997 基因阻断 化学早期鉴别 -
RNAi的研究进展
RNAi(RNA interference,即RNA干扰)是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的[1-2].RNAi是近几年发现和发展起来的新兴基因阻断技术.
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RNA干扰的研究进展
随着人类基因组计划中基因测序的完成,生物学的焦点已经转移到研究基因的功能和它们的调解上,为了确定基因的功能,迫切需要建立有效、经济的分析基因功能的技术.近年来对基因阻断技术的研究有很大进展,并显示了良好前景.基因阻断主要在DNA和mRNA两个水平,后者主要包括反义技术、肽核苷酸及RNA干扰(RNA interference,RNAi).RMAi是一项新兴的生物工程技术,即与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的广泛存在于生物体中的序列特异性基因转录后的沉默过程.