瞬时受体电位1与心血管疾病关系研究进展

近年来,以高血压、冠心病等为主要疾病谱的心血管疾病,发病率、病死率呈逐年上升趋势.研究发现,经典瞬时受体电位(TRPC)在心血管疾病的发生、发展中扮演了重要的角色.TRPC通道是钙库操控性通道(SOCs)的成员之一,位于胞膜,并介导Ca(2+)跨膜转运,影响细胞的增殖、迁移等基本生物学行为.

瘦素对大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨瘦素对大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 体外培养大鼠的主动脉VSMC,按照不同浓度瘦素的处理方法将细胞分为对照组、小剂量组(瘦素40 μg/L)、中剂量组(瘦素80μg/L)、高剂量组(瘦素100 μg/L)及联合组(瘦素100μg/L+脂联素30 mg/L),对照组细胞不做任何处理.孵育24 h检测VSMC活性、VSMC凋亡率及增殖细胞核抗原(PCNA)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)mRNA表达水平.结果 与对照组比较,小、中、大剂量各组及联合组VSMC的增殖率与PCNA mRNA表达水平明显升高、VSMC凋亡率与caspase-3 mRNA表达水平明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).小、中、大剂量各组VSMC的增殖率和PCNA mRNA表达水平逐渐升高、VSMC凋亡率和caspase-3 mRNA表达水平逐渐降低(P＜0.05).中剂量组与大剂量组VSMC的增殖率明显高于联合组,VSMC凋亡率明显低于联合组,差异有统计学意义[(17.9±1.0)％和(19.3±1.0)％ vs (16.9±4.0)％,(2.5±0.6)％和(1.5±0.4)％ vs(1.0±0.4)％,P＜0.05].Spearman相关分析显示,血清瘦素水平与VSMC的增殖呈正相关(r=0.37,P＜0.05),与VSMC的凋亡率呈负相关(r=-0.19,P＜0.05).结论 瘦素可以促进平滑肌细胞的增殖,抑制平滑肌细胞凋亡,这一作用可以被脂联素所抑制.

罗格列酮联合依折麦布对脂化后血管平滑肌细胞胆固醇逆转运的影响及可能机制的研究

目的 探究罗格列酮联合依折麦布对脂化血管平滑肌细胞(SMC)胆固醇含量的影响及可能机制.方法 将原代大鼠胸主动脉SMC分空白对照组、泡沫细胞组、依折麦布3.0、10.0、30.0μmol/L组、罗格列酮组(25.0tμmol/L)、联合组(罗格列酮25.0 μmol/L+依折麦布30.0 μmol/L).采用酶荧光法检测各组细胞内总胆固醇(TC)及游离胆固醇(FC)的含量,并计算胆固醇酯(CE)值.RT-PCR检测肝X受体α(LXRα)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)mRNA表达,Western blot检测LXRα和ABCA1蛋白表达量.结果 泡沫细胞组较空白对照组LXRα和ABCA1 mRNA(0.2980±0.0247 vs1.0010±0.0554,0.3022±0.0266 vs1.0009±0.0526)以及蛋白表达均减少(P＜0.05),TC、FC和CE含量显著增加(P＜0.05);与泡沫细胞组比较,依折麦布组3.0、10.0、30.0tμmol/L、罗格列酮组和联合组LXRα和ABCA1 mRNA及蛋白表达均增加,依折麦布组则呈现浓度依赖性;依折麦布组30.0 μmol/L、罗格列酮组和联合组TC、FC和CE含量减少(P＜0.05);且联合组LXRα和ABCA1 mRNA及蛋白增加更为明显(P＜0.05).结论 罗格列酮与依折麦布联合,显著减少细胞内胆固醇含量,增加SMC内的胆固醇逆转运效率,其机制可能与LXRα-ABCA1通路有关.

大鼠主动脉中膜平滑肌细胞向成骨样细胞转化中骨保护素和核转录因子κB受体配体的变化及意义

目的 研究大鼠主动脉中膜平滑肌细胞(SMC)向成骨样细胞转化过程中骨保护素(OPG)/核转录因子κB(NF-κB)受体的配体(RANKL)的变化及意义. 方法 体外培养大鼠主动脉SMC,随机分为成骨样细胞组、阿托伐他汀组和SMC组,每组再分为早、晚2个亚组.成骨样细胞组在正常SMC培养液中加入β-磷酸甘油和维生素C,他汀组在加入以上物质的同时再加入阿托伐他汀.早期组在第7天,晚期组在第14天进行检测.采用Von Kossa染色、钙离子含量测定、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、骨钙素的Western blot检测来判定钙化情况;采用实时定量PCR检测OPG和RANKL的mRNA表达情况. 结果 成骨样细胞组中钙离子含量、Von kossa染色、ALP活性、骨钙素均高于他汀组(F=0.27、2.48、6.14、10.21,均P＜0.05).SMC组无论早晚期均有大量的OPG表达(早期2.71±0.08,晚期2.69±0.02),但无RANKL表达;他汀组(早期3.52±0.05,晚期2.50±0.03)和成骨样细胞组(早期4.18±0.10,晚期2.30±0.11)的早期OPG表达上升而晚期下降,而两组RANKL表达在钙化中一直呈升高趋势(分别由1.01±0.19升高全2.40±0.10及1.70±0.07升至3.22±0.11).SMC组、他汀组、成骨样细胞组随钙化程度的加重,OPG/RANKL比值呈逐步下降趋势(F=52.93,2.33,均P＜0.05);同一组中,晚期亚组随着钙化的加重,OPG/RANKL比值也较早期明显下降(F=38.71,1.74,均P＜0.05). 结论 OPG/RANKL的比值与 SMC向成骨样细胞的转化程度呈负相关,且阿托伐他汀具有抑制钙化的作用.

辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞增殖的影响

目的 观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞(SPC)和内皮祖细胞(EPC)增殖的影响,筛选新一代包被洗脱支架药物. 方法 采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入小同浓度辛伐他汀(0.01～10.00μmol/L)培养6～48 h后,平滑肌肌动脉蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定异硫氰酸荧光素结合的植物凝集素(FITC-UEA-I)和DiI结合的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染阳性细胞为正在分化的EPC,并在倒置荧光显微镜下计数. 结果 辛伐他汀显著抑制骨髓源SPC增殖,0.01μmol/L辛伐他汀作用24 h,SPC数量减少了(5.8±3.1)%(对照组与0.01μmol/L辛伐他汀组分别为4070±184与3833±126,P<0.05).辛伐他汀可促进EPC增殖,其促进作用随辛伐他汀浓度增加及作用时间延长而增加,1.00μmol/L辛伐他汀作用24 h EPC数量增加(2.0±0.1)倍(对照组与1 μmol/L辛伐他汀组分别为1249±146与3762±138,P<0.01). 结论 辛伐他汀抑制SPC增殖,促进EPC增殖,局部应用有抑制再狭窄和促进损伤血管再内皮化可能.

钙离子拮抗剂和β受体阻滞剂的抗动脉粥样硬化作用

动脉粥样硬化(AS)是指在动脉及其分支的动脉壁内膜及内膜下有脂质沉着(主要是胆固醇及胆固醇酯),同时伴有中层平滑肌细胞移行至内膜下增殖,使内膜增厚,形成黄色或灰黄色状如粥样物质的斑块.

野生型蛋白激酶GIα腺病毒抑制低氧肺动脉平滑肌细胞表型转换及细胞增殖

目的 观察携带野生型蛋白激酶GIα腺病毒(Ad-PKGIα)抑制低氧诱导人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)表型转换及其增殖的影响,探讨其在低氧肺血管重建(HPVR)中的作用.方法 组织块法建立人PASMC细胞系.Ad-PKGIα转染PASMC;采用荧光显微镜观察转染效率;RT-PCR、Western blot检测PASMC中PKGIα mRNA表达、Ad-PKGIα转染对低氧PASMC表型转换中平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin)表达的影响.流式细胞仪检测Ad-PKGIα转染后低氧对PASMC细胞周期的影响;~3H-TdR掺入法检测PASMC增殖.结果 (1)Ad-PKGIα转染后PASMC中PKGIα mRNA水平、磷酸化PKGIα蛋白水平显著增高.(2)常氧时PASMC中SM-α-actin蛋白表达为44.25±5.34;3% O_2处理12 h PASMC中SM-α-actin蛋白表达水平降至32.18±4.19,处理24 h SM-α-actin蛋白表达水平降至21.90±2.44.(3)低氧条件下,PASMC开始增殖,随着低氧时间延长,PASMC增殖逐渐增加,至24 h PASMC增殖多[(14 924±1491)次/min].与未转染对照组、腺病毒空载体组比较,Ad-PKGIα转染组PASMC增殖明显受到抑制.(4)低氧使未转染对照组和腺病毒空载体组的PASMC进入有丝分裂期,随着低氧时间延长,G_0/G_1期细胞比例逐渐减少,S+G_2/M期细胞比例逐渐增加.Ad-PKGIα转染后常氧状态下PASMC G_0/G_1期细胞比例下降、S+G_2/M期细胞比例上升趋势均明显减缓.结论 PKGIα基因在低氧肺血管重建信号转导途径中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一.

钙池操纵性钙内流在慢性缺氧致肺动脉平滑肌细胞内钙浓度升高中的作用及机制

目的 探讨钙池操纵性钙内流(SOCE)在慢性缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)细胞内Ca2浓度([Ca2+]i)改变和细胞增殖中的作用及机制.方法 原代培养大鼠PASMC,分为常氧组(21％O2)和缺氧组(4％O2),活细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测PASMC增殖,细胞内钙浓度检测系统检测[Ca2+]i和SOCE,并观察钙池操纵性钙通道(SOCC)拮抗剂SKF96365和氯化镍对缺氧组PASMC SOCE的影响.结果 缺氧24 h、36 h、48 h、60 h,PASMC增殖和升高[Ca2+]i的效应呈时间依赖性,缺氧60h促进PASMC增殖(吸光度值1.12 ±0.09比0.71 ±0.05;P ＜0.05)和[Ca2+]i升高[(214.8±20.4)nmol/L比(115.2±13.2) nmol/L;P＜ 0.05]的作用明显.含硝苯地平(5 μmol/L)的无钙Krebs液孵育PASMC,环匹阿尼酸(CPA,10 μmol/L)导致PASMC[Ca2+]i小幅升高,△[Ca2+]i峰值为(113.3±49.3)nmol/L,慢性缺氧(4％O2,60 h)使PASMC[Ca2+]i升高幅度增加,△[Ca2+]i峰值达(193.2±22.7)nmol/L(P＜0.05);恢复PASMC外Ca2+后,CPA使PASMC[Ca2+]i显著升高,△[Ca2+]i峰值达(328.0±56.7)nmol/L,慢性缺氧导致CPA诱导的PASMC[Ca2+]i升高更显著,A[Ca2+]i峰值高达(526.0±33.7) nmol/L(P＜0.05);SKF96365(50 μmol/L)和氯化镍(500 μmol/L)均能抑制慢性缺氧条件下CPA诱导的PASMC[Ca2+]i升高,△[Ca2+]i从(526.0±33.7)nmol/L分别降至(170.4±26.4) nmol/L和(177.4±45.9) nmol/L(P值均＜0.05).结论 慢性缺氧促进大鼠PASMC肌浆网中Ca2+释放,并增强SOCC活性,使经由SOCC内流的SOCE升高,从而导致PASMC的[Ca2+]i升高,进而促进大鼠PASMC增殖.

一氧化氮与胃食管疾病关系的研究进展

1983年,Furchgott等首次发现血管内皮细胞能够产生具有松弛平滑肌作用的"内皮细胞舒血管因子(EDRF)",5年后,Moncada等确定这种非前列腺素性弥散因子是一氧化氮(NO).近年来,关于NO与消化道生理功能及一些消化道疾病关系的研究已经取得了新的进展.

支气管哮喘与支气管热成形术

支气管热成形术是近年来新出现的一项用于治疗药物治疗效果不理想的重症哮喘的方法,它的原理是通过热能减少支气管平滑肌,减轻气道痉挛.美国进行了大量动物实验、临床前试验和临床试验皆证明了该方法是有效和安全的.该治疗技术已得到美国FDA认可,并逐步在全世界推广.

降钙素基因相关肽和受体活性修饰蛋白1对血管平滑肌细胞迁移的影响及机制

目的 探讨转染降钙素基因相关肽(CGRP)的骨髓间充质干细胞(MSC)对血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的影响,及活性修饰蛋白1(RAMP1)在其中的作用和机制.方法 分离、培养大鼠MSC和VSMC,分别应用携带CGRP和RAMP1的慢病毒载体转染MSC和VSMC,然后将MSC与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的VSMC共培养.实验分为5组:(1) AngⅡ对照组(MSC+ VSMC+ AngⅡ);(2) MSCCGRP+组(MSCCGRP++ VSMC+ AngⅡ);(3)MSCCGRP+ RAMP1 组(MSCCGRP++ VSMCRAMP1-+AngⅡ);(4) MSCCGRP+ RAMP1+组:(MSCCGRP++ VSMCRAMP1++ AngⅡ);(5) RAMP1+ (MSC+VSMCRAMP1++ AngⅡ).应用Transwell实验评价VSMC的迁移能力,Western blot检测蛋白的表达水平.结果 Transwell实验结果显示,MSCCGRP+组VSMC迁移数量[(50.8±2.6)个]少于AngⅡ对照组[(71.4±2.3)个],而多于MSCCGRP+ RAMP1+组[(30.4±3.0)个](P均＜0.05);MSCCGRP+ RAMP1-组VSMC迁移数量[(69.0±5.6)个]多于MSCCGRP+ RAMP1+组(P＜0.05),而与AngⅡ对照组差异无统计学意义(P＞0.05);RAMP1+组VSMC迁移数量[(71.6±3.4)个]与AngⅡ对照组差异也无统计学意义(P＞0.05).Western blot结果显示,MSCCGRP+组磷酸化核因子-κB P65(P-P65)蛋白表达水平低于AngⅡ对照组(0.475±0.022比0.642±0.035,P＜0.05);MSCCGRP+ RAMP1-组P-P65蛋白表达水平高于MSCCGRP+ RAMP1+组(0.670±0.030比0.373 ±0.041,P＜0.05),而与AngⅡ对照组差异无统计学意义(P＞0.05);RAMP1+组P-P65蛋白表达量(0.643 ±0.039)与AngⅡ对照组比较差异也无统计学意义(P＞0.05).结论 RAMP1对CGRP抑制VSMC迁移起促进作用,RAMP1-CGRP通过核因子-κB信号通路抑制VSMC迁移.

ORAI1在损伤导致大鼠颈动脉新生内膜形成中的作用及其与钠钙交换体1的关系

目的 利用大鼠颈动脉球囊损伤模型探讨ORAI1在血管平滑肌细胞增生形成新生内膜中的作用及其与钠钙交换体(NCX)1的关系.方法 根据是否建立颈动脉球囊损伤模型和观察时间,将Sprague Dawley大鼠分为假手术组、损伤后7d组和损伤后14 d组,每组大鼠3只;根据转染的病毒液,将Sprague Dawley大鼠分为阴性对照组(建立颈动脉球囊损伤模型后,转染阴性对照慢病毒质粒)和siORAI1组(建立颈动脉球囊损伤模型后,转染沉默ORAI1的慢病毒质粒),每组3只大鼠.采用HE染色评价颈动脉内膜的增生情况;采用Real-time PCR检测血管壁ORAI1的mRNA表达水平;采用Western blot检测血管壁核增殖核抗原(PCNA)、ORAI1和NCX1的蛋白表达水平.结果 (1)损伤后7d组和损伤后14 d组的颈动脉内膜厚度均大于假手术组[(0.54 ±0.11)μ m2和(0.89±0.12) μm2比(0.11 ±0.08) μm2,P均＜0.05],PCNA的蛋白相对表达水平均高于假手术组(1.43±0.16和1.95±0.16比1,P均＜0.05),ORAI1的mRNA表达水平均高于假手术组(1.39 ±0.14和1.78 ±0.21比0.56±0.09,P均＜0.05),ORAI1的蛋白相对表达水平均高于假手术组(1.42 ±0.19和1.78±0.22比1,P均＜0.05).(2)球囊损伤后14 d,siORAI1组的ORAI1蛋白相对表达水平低于阴性对照组(0.21 ±0.16比1,P＜0.05),颈动脉内膜厚度小于阴性对照组[(0.19±0.14) μm2比(0.91 ±0.23) μm2,P＜ 0.05],NCX1蛋白相对表达水平低于阴性对照组(0.53 ±0.13比1,P＜0.05).结论 ORAI1可能是调控血管新生内膜形成和细胞增殖的一个关键因素;ORAI1基因沉默可能会引起NCX1表达水平的降低.

二十二碳六烯酸通过活化T细胞核因子1调控低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞表型转化

目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)调控低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)表型转化的分子机制.方法 采用组织贴块法培养大鼠PASMC.将PASMC分为常氧组、低氧组(1％O2、94％ N2、5％CO2,低氧刺激12 h)、低氧(1％O2、94％ N2、5％ CO2)+DHA(10 μmol/L)组(给予DHA处理后低氧孵育12 h),低氧(1％O2、94％ N2、5％ CO2)+DHA(10 μmol/L)+过表达NFATc1组(细胞转染过表达NFATc1载体24h,然后再给予DHA及低氧刺激12 h)及低氧(1％ O2、94％ N2、5％CO2)+DHA(10 μmol/L)+敲低NFATc1组(细胞转染NFATc1小干扰RNA 24 h,然后再给予DHA及低氧刺激12 h).使用三气培养箱制造低氧环境加以干预.分别采用实时定量PCR和Western blot法检测各组细胞的NFATc1 mRNA和蛋白表达水平,分别采用免疫荧光染色、Western blot和实时定量PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平,采用实时定量PCR法检测平滑肌肌动蛋白相关蛋白22(SM22) mRNA表达水平,采用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)法检测PASMC增殖情况.结果 低氧刺激12 h,低氧组大鼠PASMC NFATc1的mRNA及蛋白表达水平均明显高于常氧组(P均＜0.05),而低氧+DHA组则均明显低于低氧组(P＜0.05).转染NFATc1过表达病毒及小干扰RNA24h后,低氧刺激大鼠PASMC 12 h,低氧组大鼠PASMC α-SMA阳性的细胞数、α-SMA蛋白及mRNA以及SM22 mRNA表达水平均明显低于常氧组(P均＜0.05),低氧+DHA组则高于低氧组(P＜0.05),低氧+DHA+过表达NFATc1组则明显低于低氧+DHA组(P＜0.05),而低氧+DHA+敲低NFATc1组又明显高于低氧+DHA+过表达NFATc1组(P＜0.05).低氧组大鼠PASMC增殖率明显高于常氧组(P＜0.05),低氧+DHA组则明显低于低氧组(P＜0.05),低氧+DHA+过表达NFATc1组则明显高于低氧+DHA组(P＜0.05),而低氧+DHA+敲低NFATc1组又明显低于低氧+DHA+过表达N FATc1组(P＜0.05).结论 DHA可通过抑制NFATc1调控低氧诱导的大鼠PASMC由收缩型向合成型转化及增殖.

二十二碳六烯酸对大鼠冠状动脉平滑肌细胞离子通道的影响

目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活性钾通道电流(IBKCa)和电压依赖性钾通道电流(IKv)的动力学影响,阐述DHA舒张血管的机制.方法 采用膜片钳技术在全细胞模式下,记录0、10、20、40、60和80 μmol/L的DHA对大鼠冠状动脉平滑肌细胞上IBKCa和IKv的影响.结果 (1)DHA可呈浓度依赖性地增加IBKCa和BKCa尾电流,对IBKCa稳态激活无影响.在指令电压+ 150 mV,不同浓度DHA(0、10、20、40、60和80μmol/L)作用下,IBKCa电流密度分别为(68.2±22.8)、(72.4±24.5)、( 120.4±37.9)、(237.5±53.2)、( 323.6±74.8)和(370.6±88.2) pA/pF(P＜0.05,n=30).DHA对IBKCa的半效作用浓度(EC50)为(36.22±2.17)μmol/L.(2)DHA对IKv和Kv尾电流呈浓度依赖性抑制,使IKv稳态激活曲线右移、稳态失活曲线左移.在指令电压+ 50 mV,不同浓度DHA(0、10、20、40、60和80 μmol/L)作用下,IKv电流密度分别为(43.9±2.3)、(43.8±2.3)、(42.9±2.0)、(32.3±1.9)、(11.7±1.5)和(9.6±1.2) pA/pF(P＜0.05,n=30).DHA对IKv的EC50为(44.19±0.63) μmol/L.结论 DHA对BKCa通道有激活作用,对Kv通道有抑制作用.DHA舒张血管的作用是对血管平滑肌细胞BKCa及Kv通道综合作用的结果.

RTA-408对晚期糖基化终末产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的作用及机制

目的 探讨RTA-408对晚期糖基化终末产物(AGE)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化的作用及其机制.方法 体外分离培养Sprague Dawley大鼠主动脉VSMC,将传代培养至第5代的细胞按照随机数字表法分为对照组(培养2d后,更换为含牛血清蛋白的培养基继续培养5d)、AGE组(培养2d后,更换为含200 mg/L AGE的培养基继续培养5d)、实验组(使用含100 nmol/L RTA-408的培养基培养2 d后,更换为含200 mg/L AGE的培养基继续培养5d)和RTA组(使用含100 nmol/L RTA-408的培养基培养2 d后,更换为含牛血清蛋白的培养基继续培养5d).收集各组VSMC,采用偶氮胂Ⅲ法检测细胞内钙离子含量,采用Von Kossa染色法检测细胞内相对钙沉积量,采用试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用Western blot检测细胞内骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、核因子E2相关因子2(Nrf2)和醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白含量.结果 (1)AGE组细胞中钙离子含量高于对照组[(2.43±0.15)mmol/L比(1.23±0.09)mmol/L,P<0.01],而实验组细胞中钙离子含量[(1.62±0.18)mmol/L]低于AGE组(P<0.01).(2)AGE组细胞内相对钙沉积量高于对照组(3.64±0.50比1.00±0.12,P<0.01),而实验组细胞内相对钙沉积量(1.56±0.37)低于AGE组(P<0.01).(3)与对照组比较,AGE组MDA含量较高[(3.79±0.27)nmol/mg蛋白比(1.99±0.15)nmol/mg蛋白,P<0.01],而SOD活性较低[(308.45±14.28)U/mg蛋白比(428.58±11.00)U/mg蛋白,P<0.01];实验组MDA含量[(2.37±0.19)nmol/mg蛋白]低于AGE组(P<0.01),而SOD活性[(391.03±22.92)U/mg蛋白]高于AGE组(P<0.05).(4)AGE组OPN和ALP蛋白相对表达量均高于对照组[分别为3.06±0.21比1.00±0.07和2.89±0.29比1.00±0.10,P均<0.01];实验组OPN(1.15±0.12)和ALP(1.45±0.15)的蛋白相对表达量均低于AGE组(P均<0.01).(5)实验组Nrf2及NQO1蛋白相对表达量均高于AGE组(分别为2.37±0.17比1.17±0.09和3.91±0.18比1.05±0.08,P均<0.01).结论 RTA-408对AGE引起的大鼠主动脉VSMC钙化有保护作用,其机制可能与激活Nrf2/NQO1信号通路从而提高细胞抗氧化应激能力有关.

二十二碳六烯酸增加大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙离子激活钾离子流的机制

目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)增加冠状动脉平滑肌细胞(SMC)大电导钙离子激活钾离子流(BK)的机制.方法酶消化法分离正常大鼠冠状动脉SMC.采用不同钾通道阻滞剂,对冠状动脉SMC的钾离子通道进行鉴定.采用全细胞膜片钳实验技术研究DHA及其代谢产物16,17-环氧二十二碳五烯酸(16,17-EDP)对冠状动脉平滑肌细胞BK通道的影响,并观察加入细胞色素P450环氧化酶抑制剂SKF525A孵育SMC后BK通道电流的变化.结果正常冠状动脉平滑肌细胞BK通道电流约占总钾离子流的(64.2±2.7)%(n=20).DHA可激活BK通道,半效浓度为(0.23±0.03)μmoL/L,但当使用细胞色素P450环氧化酶抑制剂SKF525A预孵育SMC后,DHA对BK通道的激活作用消失,而DHA代谢产物16,17-EDP可产生与DHA相同的BK通道激活作用,半效浓度为(19.7±2.8)nmol/L.结论 DHA通过细胞色素P450环氧化酶代谢途径激活平滑肌细胞BK通道,从而扩张冠状动脉.

Kindlin-2对血管平滑肌细胞迁移和黏附的影响及其机制的实验研究

目的 探讨Kindlin-2 RNA干扰对血管平滑肌细胞(VSMC)迁移、黏附以及β1整合素的影响,并进一步探讨Kindlin-2与β1整合素之间的关系.方法 构建Kindlin-2小干扰RNA(siRNA)慢病毒载体感染原代培养的VSMC.实验分为空白对照组、阴性对照组和Kindlin-2 siRNA组.通过Transwell和细胞划痕实验检测VSMC的迁移能力.细胞基质黏附实验检测VSMC黏附细胞外基质的能力.实时定量PCR和Western blot分别检测Kindlin-2与β1整合素的mRNA和蛋白表达水平.流式细胞技术检测VSMC表面总β1整合素和激活β1整合素的表达.结果 Kindlin-2siRNA慢病毒感染VSMC的效率达90％以上.Kindlin-2 siRNA组VSMC迁移数量低于空白对照组和阴性对照组(P均＜0.05),且VSMC迁移的距离较空白对照组和阴性对照组短(P均＜0.05).Kindlin-2 siRNA组VSMC黏附胶原Ⅰ的数量较空白对照组和阴性对照组少(P均＜0.05),另外A590nm也较空白对照组和阴性对照组低(P均＜0.05).Kindlin-2 siRNA组Kindlin-2 mRNA表达水平较空白对照组低了47％ (P＜0.05),但β1整合素mRNA表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义.Kindlin-2 siRNA组Kindlin-2蛋白表达水平较空白对照组和阴性对照组低(P均＜0.05),3组间β1整合素蛋白表达水平差异无统计学意义.Kindlin-2 siRNA组VSMC表面激活β1整合素表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P均＜0.05),而细胞表面总β1整合素表达水平与空白对照组和阴性对照组比较差异均无统计学意义.结论 Kindlin-2可以调节VSMC的迁移和黏附,激活VSMC表面β1整合素.

糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道开放概率的变化

目的 探讨糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(BK通道)开放概率的变化,阐明糖尿病对冠状动脉损伤的细胞电生理机制.方法 将大鼠分为正常对照组和糖尿病组,分离两组大鼠冠状动脉平滑肌细胞,单通道膜内向外型膜片钳实验技术记录两组大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK单通道电流并计算开放概率.加入BK通道激活剂DHS-1,比较正常对照组和糖尿病组大鼠冠状动脉平滑肌细胞在钙离子浓度为0.2和1μmol/L条件下BK单通道开放概率的变化.结果 正常对照组和糖尿病组在刺激电压60 mV和钙离子浓度0.2μmol/L时,BK通道开放概率分别为0.095±0.036(n =8)和0.0032 ±0.0012(n =9)；在钙离子浓度1μmol/L时,BK通道开放概率分别为0.458±0.077(n =5)和0.210 ±0.055(n =5).两种钙离子浓度下,糖尿病组BK通道开放概率均减低(P均＜0.05).在钙离子浓度为0.2μmol/L时,加入0.1μmol/L的DHS-1,正常对照组BK通道开放概率增加至0.335±0.096(n=9),与未加入时比较差异有统计学意义(P＜0.05),而糖尿病组BK通道开放概率无明显变化,为0.022±0.018(n =8),与未加入时比较差异无统计学意义.在钙离子浓度为1 μmol/L时,加入0.1μmol/L的DHS-1,正常对照组BK通道开放概率增加至0.823±0.019(n=5),与未加入时比较BK通道开放概率明显增加(P＜0.05),而DHS-1对糖尿病组BK通道激活作用较小,通道开放概率为0.446 ±0.098(n =5),但与未加入DHS-1时比较差异亦有统计学意义(P＜0.05).结论 糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK单通道开放概率下降可能是糖尿病冠状动脉功能损伤的重要原因.

E1A激活基因阻遏子过表达诱导体外培养大鼠平滑肌细胞分化

CD137分子通过活化T细胞核因子c1调控血管平滑肌细胞表型转变

目的 探讨CD137分子信号是否通过活化T细胞核因子c1(NFATc1)调控血管平滑肌细胞(VSMC)表型转变.方法 将小鼠VSMC采用组织块贴块法原代培养,细胞分为对照组、CD137刺激组和CD137抑制组,以CD137L重组蛋白及抗CD137阻断型抗体分别激动和抑制CD137信号.在小干扰RNA试验中,将小鼠VSMC分为对照序列组与si-NFATc1组并分别转染对照序列与si-NFATc1序列.采用荧光定量PCR(qRT-PCR)及Westem blot检测VSMC中NFATc1和表型蛋白、肌动蛋白α(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)、波形蛋白的表达;免疫荧光和Western blot检测核蛋白中NFATc1活化水平.采用Transwell迁移实验检测穿膜细胞数目,比较细胞迁移能力.结果 与对照组比较,CD137刺激组中VSMC中NFATc1(5.07 ±0.36比1.00±0.00)及波形蛋白(3.23±0.27比1.00±0.00)表达较高(P均＜0.05),而α-SMA(0.73±0.15比1.00±0.00)、SM-MHC(0.45±0.05比1.00±0.00)表达较低(P均＜0.05).与CD137刺激组比较,CD137抑制组NFATc1(1.56±0.27比5.07±0.36)和波形蛋白(1.21±0.17比3.23±0.27)表达较低(P均＜0.05),而α-SMA(2.01±0.43比0.73 ±0.15)和SM-MHC(2.85±0.32比0.45±0.05)表达较高(P均＜0.05).与对照序列组比较,siNFATc1组VSMC的SM-MHC、α-SMA的mRNA及蛋白水平较高,而波形蛋白表达较低(P均＜0.05).细胞迁移实验显示,CD137L刺激组细胞迁移数量高于对照组(3.85±0.31比1.00±0.00,P＜0.05),而抑制NFATc1后迁移细胞数与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CD137信号通过NFATc1参与VSMC表型调控.