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P.gingivalis感染对血管内皮细胞VCAM-1表达的影响
目的:观察牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)ATCC 33277和W83感染对血管内皮细胞血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)转录和翻译的影响.方法:建立体外P. gingivalis感染血管内皮细胞模型,反转录-聚合酶链式反应检测VCAM-1基因表达;蛋白质印迹技术检测VCAM-1膜蛋白表达变化.采用SAS 8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析.结果:P. gingivalis感染后4 h即诱导VCAM-1mRNA表达(与对照组比较,P<0.05),8 h达高峰,24 h有持续的高表达;P.gingivalis感染后4 h即诱导VCAM-1蛋白表达(P<0.05),8 h有持续的高表达,24 h表达到达高峰(P<0.05).P.gingivalis W83诱导VCAM-1表达的能力强于ATCC 33277(P<0.05).结论:P.gingivalis感染可引起血管内皮细胞VCAM-1高表达,提示P.gingivalis可能在动脉粥样硬化炎症病理反应中有重要的意义.
关键词： 牙龈卟啉单胞菌 动脉粥样硬化 血管细胞黏附分子-1 -
龈下菌斑及冠状动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌的同源性检测
目的:检测牙周袋内牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌(P.g)与冠状动脉粥样硬化斑块中牙龈卟啉单胞菌的同源性,探讨慢性牙周炎发生发展与冠心病的相关性.方法:选取15例患有冠状动脉粥样硬化型心脏病伴有慢性牙剧炎的患者,分别收集其龈下菌斑样本和冠状动脉粥样硬化斑块样本,提取细菌DNA,PCR检测样本中的P.g 16SrDNA基因,扩增产物行基凶序列的测定.结果:龈下菌斑中的P.g 16SrDNA基因与冠状动脉粥样硬化斑块巾的P.g 16SrDNA基凶具有高度同源性.结论:牙周致病菌与冠心病发生发展密切相关,慢性牙周炎是冠心病的危险因素之一,为冠心病及慢性牙周炎的防治提供了依据.
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牙龈卟啉单胞菌菌毛质粒构建和蛋白纯化
目的: 构建牙龈卟啉单胞菌菌毛基因原核表达质粒,纯化菌毛融合蛋白.方法: 提取牙龈卟啉单胞菌DNA,通过PCR 法克隆菌毛基因,构建质粒并转化至感受态细胞中,选取佳条件诱导融合蛋白,通过谷胱甘肽巯基转移酶亲和层析法,纯化融合蛋白;免疫印迹法验证蛋白的准确性.结果: 实验显示低温高浓度诱导12 h 时构建的质粒融合蛋白表达量多;免疫印迹法检测在预期大小处显示特异性印迹条带.结论: 成功的获得了纯度较高的牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白.
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多功能纳米微球检测牙龈卟啉单胞菌的实验研究
目的:建立基于磁编码微球和上转换荧光编码微球灵敏性检测牙龈卟啉单胞菌的新方法.方法:用溶胶凝胶法分别制备磁编码微球和上转换荧光编码微球,与牙龈卟啉单胞菌单克隆抗体结合后捕捉牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、变形链球菌混合菌液中的牙龈卟啉单胞菌.用外置980 nm近红外激光器的荧光显微镜、透射电镜及扫描电镜评估该法的检测效果.结果:制备的磁编码微球及上转换荧光编码微球的分散性好、粒径均匀、形貌均一,磁编码微球的磁性较强,上转换荧光编码微球的荧光强度较高;混合菌液中纳米微球可特异性捕捉牙龈卟啉单胞菌,检测极限为10 CFU/ml.结论:本实验所建立的检测系统可灵敏检测混合菌液中的牙龈卟啉单胞菌.
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慢性间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化
目的:探讨间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化.方法:将32只6周龄雄性SD大鼠随机分成4组(n=8):常氧对照组(A组)、常氧牙周炎组(B组)、间歇性低氧组(C组)、间歇性低氧合并牙周炎组(D组).用正畸结扎丝结扎双侧上颌第二磨牙颈部和高糖饮食方法建立牙周炎模型,常氧和低氧组分别在常氧和模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征条件下饲养8周,采集大鼠实验牙龈沟液标本,实时荧光定量PCR方法检测牙龈卟啉单胞菌的变化.结果:所有的大鼠均检出牙龈卟啉单胞菌.D组牙龈卟啉单胞菌的量明显高于其他3组(P＜0.05);B组牙龈卟啉单胞菌的量高于A组(P＜0.05).结论:慢性间歇性低氧可加重牙周炎病程,与龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的增加有关.
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B类Ⅱ型清道夫受体在牙龈卟啉单胞菌影响泡沫细胞形成中的作用
目的:观察牙龈卟啉单胞菌(P.g)诱导泡沫细胞形成过程中B类Ⅱ型清道夫受体(SR-BⅡ)的表达变化,并初步探讨其相关的作用机制.方法:用P.g和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)共同刺激小鼠腹腔巨噬细胞,观察泡沫细胞的形成.采用Western blot和RT-PCR法检测泡沫细胞形成过程中SR-BⅡ表达含量的变化.用siRNA沉默SR-BⅡ的表达后检测泡沫细胞的形成情况.结果:P.g以及ox-LDL刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,油红O染色观察到泡沫细胞的形成明显增多.在泡沫细胞形成过程中,P.g可以诱导SR-BⅡ表达增加,采用siRNA干扰SR-BⅡ表达后,P.g对泡沫细胞形成的促进作用减弱.结论:P.g可以促进SR-BⅡ的表达,调控SR-BⅡ表达可以改变泡沫细胞的形成.
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牙龈卟啉单胞菌感染对血管内皮细胞与单核细胞黏附的影响
目的：研究Pg感染对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与单核细胞黏附的影响。方法：建立Pg感染HUVEC细胞株EA．hy926的体外模型，虎红染色法观察Pg381和Pg33277菌株感染HUVEC 6 h和24 h后，HUVEC与人单核细胞株THP-1细胞黏附量的变化。结果：培养6 h时Pg381感染组的THP-1细胞黏附量相对值为0．210±0．025，高于Pg33277感染组（0．078±0．024，P＜0．05）和空白对照组（0．062±0．022，P＜0．05），Pg33277感染组和空白对照组无差异。24 h时3组间无差异（P＞0．05）。结论：Pg381感染HUVEC后能显著促进其与单核细胞的黏附。
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唾液、血清和脓液对电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌的影响
目的:观察唾液、血清和脓液对电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌的影响.方法:利用免疫磁分离捕获牙龈卟啉单胞菌后进行电化学阻抗测量,观察唾液、血清和脓液对电化学测菌法检测限和检测灵敏度的影响.结果:唾液对电化学测菌法的检测限无影响,但可降低其检测灵敏度;血清对电化学测菌法的检测限和检测灵敏度均无明显影响;脓液明显影响电化学测菌法对牙龈卟啉单胞菌的检测.结论:应用电化学测菌法检测样本时应避免脓液的污染.
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乳铁蛋白对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的影响
目的:探讨乳铁蛋白( Lactoferrin,Lf)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)胰酶样蛋白酶(TLP)活性的影响.方法:在BHI培养基中加入不同浓度的乳铁蛋白和一定浊度的P.g进行厌氧培养.测定培养物上清液和菌细胞上清液中TLP活性及蛋白质含量,计算TLP的比活.结果:乳铁蛋白对P.g结合态TLP活性有明显的抑制作用,高浓度的牛乳铁蛋白对P.g游离态TLP活性有明显抑制作用,但低浓度的牛乳铁蛋白对其抑制不明显.结论:乳铁蛋白抑制P.g TLP的活性,提示其对牙周病可能具有防治作用.
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不同fimA型牙龈卟啉单胞菌降解上皮细胞间连接蛋白能力的初步研究
目的:研究不同fimA型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)破坏上皮细胞间连接能力,探讨fimA基因型与致病力差异之间的关系.方法:应用不同fimA型P.g菌株ATCC 33277(Ⅰ型),WCSP115(Ⅱ型),WCSP1.5(Ⅲ型),W83 (Ⅳ型),3501(V型),4702(Ib型)分别与口腔上皮细胞系KB细胞在标准条件下共同孵育,于孵育后0.5、1和3h,收集细胞蛋白,应用Westen- blot检测N-钙粘素(N-cadherin)和β-连环素(β-Catenin)的动态表达.结果:与对照组比较,各fimA型P.g对KB细胞N-cadherin和β-Catenin蛋白的表达均有明显的降解作用；其中ⅡfimA型组N-cadherin和β-Catenin蛋白的表达量低于其它fimA型组.结论:P.g可破坏上皮细胞间连接成分,破坏上皮细胞的完整性,而Ⅱ型fimA型P.g水解上皮细胞间粘合连接蛋白的能力强于其它fimA型.提示fimA基因型的不同可能是P.g的致病力差异的基因基础.
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抗牙龈卟啉单胞菌IgY的制备及抑菌效果
目的:使用牙龈卟啉单胞菌(P.g)诱导产蛋母鸡特异性IgY抗体产生及制备,特异性IgY抗体抑制P.g及其它牙周病病因菌生长.方法:采用免疫接种、水稀释、盐析、液体培养抑菌及ELISA等方法,诱导、提纯IgY抗体,抑制P.g及其它牙周病病因菌生长.结果:诱导产生的IgY抗体经硫酸铵盐析提取纯度达87.6%～89.1%,IgY特异性结合牙龈卟啉单胞菌抗原的结合效价1∶ 1 600.制备的抗牙龈卟啉单胞菌IgY抗体与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌等牙周病致病菌的交叉免疫反应抗原结合效价分别为1∶ 800、1∶ 800、1∶ 6 400、1∶ 12 800.抗牙龈卟啉单胞菌IgY在5.0、1.0、0.1 g/L时,分别与牙龈卟啉单胞菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌、伴放线放线杆菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、粘性放线菌、变形链球菌等厌氧菌在(1×108) CFU/L和(5×108) CFU/L时培养24 h和72 h均有不同程度的抑制其生长作用.结论:牙龈卟啉单胞菌免疫产蛋母鸡诱导产生的特异性IgY抗体在一定的浓度内有抑制牙龈卟啉单胞菌生长,以及抑制多种牙周病致病菌生长的作用.牙龈卟啉单胞菌与这些牙周病病因均存在着共同抗原,其可能具有防治牙周病的前景.
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牙龈卟啉单胞菌对牙龈上皮细胞焦点黏附成分paxillin和FAK的作用
目的:研究牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)对牙周组织的破坏机制,探讨菌毛的致病作用.方法:应用Western blot法检测P.gingivalis ATCC 33277及其fimA缺陷突变株对Hela细胞及永生化人牙龈上皮细胞 (immortalized human gingival epithelial cells, IHGE细胞) 的焦点黏附成分——焦点黏附蛋白paxillin和焦点黏附激酶 (focal adhesion kinase,FAK) 蛋白表达的影响.结果:P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突变株能够使HeLa细胞和IHGE细胞的paxillin和FAK发生降解,fimA缺陷突变株对paxillin和FAK的降解能力较野生株显著减弱.在IHGE细胞中,paxillin和FAK的降解呈时间依赖性和MOI依赖性.结论:菌毛介导的P.gingivalis的黏附和侵入可能对焦点黏附成分的降解起促进作用,IHGE细胞较Hela细胞更适用于牙周致病菌的研究.
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不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对牙龈成纤维细胞表达白细胞介素-8的影响
目的:研究不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)对人牙龈成纤维细胞表达IL- 8的影响,探讨fimA基因型与Pg致病力差异之间的关系.方法: Pg ATCC 33277(Ⅰ型),WCSP115(Ⅱ型),WCSP1.5(Ⅲ型),W83(Ⅳ型)分别与牙龈成纤维细胞在标准条件下共同孵育,于孵育后1、3、6、12 h收集细胞和上清,应用实时荧光定量RT- PCR和ELISA法分别检测牙龈成纤维细胞IL- 8 mRNA和蛋白的动态表达.结果:与对照组比较,各fimA型Pg对牙龈成纤维细胞IL- 8 mRNA和蛋白的表达均有明显的促进作用(P<0.01);其中ⅡfimA型组IL- 8 mRNA和蛋白的表达量明显高于其它fimA型组,不同时间点IL- 8 mRNA相对表达量分别为20.42±2.21～103.01±12.50,蛋白分泌水平为(137.46±4.97～323.24±13.74) pg/ml;而Ⅲ fimA型Pg组的表达水平弱于其它fimA型组,IL- 8 mRNA相对表达量为3.61±0.39～12.88±1.56,蛋白分泌水平为(44.83±3.68～189.19±87.34) pg/ml, 差异有统计学意义(P<0.05).结论:Pg可促进牙龈成纤维细胞IL- 8 mRNA和蛋白的表达,且各fimA型Pg的促进作用有所差异.提示: fimA基因型的不同可能是Pg的致病力差异的基因基础.
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免疫磁分离技术在电化学测菌法特异检测牙龈卟啉单胞菌中的应用
目的:探讨结合免疫磁分离技术实现电化学测菌法特异检测牙龈卟啉单胞菌的可行性.方法:利用结合特异抗体的磁颗粒捕获分离目的菌,观察免疫磁分离前、后检测样本的阻抗变化.分析磁颗粒、杂菌、抗体浓度、反应时间、温度、pH值对阻抗测量的影响.结果:与初始菌液相比,免疫磁分离后的阻抗值增加,但无统计学差异(P＞0.05)；磁颗粒和杂菌未对阻抗测量产生明显干扰；抗体浓度为1∶10稀释时系统阻抗变化明显；抗原抗体结合30 min时系统阻抗变化大,延长时间未见增加；温度在25～ 37℃范围内,系统阻抗变化较平稳,超过37℃时,系统阻抗值出现下降趋势；pH在7.0～7.5之间时,系统阻抗值较平稳.结论:免疫磁分离技术能够与电化学测菌法结合,实现细菌的特异检测.
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牙龈卟啉单胞菌对正畸治疗病人牙周状况影响的研究
目的:观察牙龈卟啉单胞菌对正畸治疗病人牙周状况的影响,以便有效地控制正畸过程中牙龈炎性反应的发生发展,避免不可逆性的牙周损害.方法:收集41例正畸治疗中发生牙龈炎性反应的病人、20例正畸治疗前牙周健康者和35例慢性牙周炎病人的龈沟液标本,应用16SrDNA PCR技术检测各样本中的牙龈卟啉单胞菌,并分析其与临床指标(GI)之间的关系.结果:牙龈卟啉单胞菌的检出率分别为:正畸治疗组70.73％、正常对照组35.00％、牙周炎组85.71％；正畸治疗组的检出率明显高于正常对照组；牙周炎组显著高于正畸治疗组和正常对照组,三者之间有显著性差异(P＜0.05)；牙龈卟啉单胞菌的检出率随着牙周病变程度的增加而升高,与牙龈指数呈正相关关系(P＜0.05).结论:牙龈卟啉单胞菌与正畸治疗中的牙龈炎性反应和发展密切相关.
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牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌IL-1β和IL-6的影响研究
目的:研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)上清液对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分泌IL-1β、IL-6的影响.方法:酶消化法原代培养HUVECs,并对细胞进行来源鉴定,用5×106CFU/mL的Pg上清液刺激HUVECs 6、12、18、24 h后,RT-PCR检测IL-1β、IL-6 mRNA的表达;同时ELISA方法测定IL-1β及IL-6蛋白的水平.结果:Pg上清液刺激HUVECs后,IL-1 βmRNA水平在12、18h时蛋白明显高于对照组(P＜0.05);IL-6 mRNA水平在12 h的表达明显高于对照组(P＜0.05).IL-1β蛋白在18、24 h的表达明显高于对照组(P ＜0.05);IL-6蛋白在12、18、24h3个时点均明显高于对照组(P＜0.05).结论:5×106 CFU/mL Pg上清液可促进人脐静脉内皮细胞IL-1β和IL-6的基因及蛋白表达,提示Pg感染可能在As的发生发展中起一定作用.
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牙龈卟啉单胞菌侵入口腔上皮细胞后基因表达变化的初步研究
目的:采用差异显示反转录PCR技术,比较牙龈卟啉单胞菌侵入口腔上皮细胞后基因表达的变化,初步筛选与细菌侵入宿主细胞相关的毒力致病基因.方法:提取纯培养状态和侵入KB细胞后的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277细菌总RNA；反转录PCR技术显示cDNA表达条带；筛选并回收差异表达条带,二次扩增cDNA,经测序和BLAST同源性比对,初步分析细菌侵入KB细胞后表达差异基因的功能.结果:共筛选获得3条牙龈卟啉单胞菌侵入KB细胞后表达存在差异的基因HX 01、HX 02、HX 03；BLAST同源性比对结果显示,HX 01与牙龈卟啉单胞菌ABC转运蛋白编码基因PG 0683具有96％的同源性；HX 02与牙龈卟啉单胞菌PepO)编码基因PG 0159具有97％的同源性；HX 03未找到类似同源性基因序列.结论:牙龈卟啉单胞菌在侵入KB细胞后发生了细菌毒力基因的表达变化,跨膜蛋白ABC转座子和PepO可能参与细菌侵入宿主细胞的致病过程.
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牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞cGMP生成的影响
目的:体外研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)cGMP水平的影响.方法:用Pg ATCC 33277分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10、1∶50、1∶250干预HUVEC,并以未受Pg ATCC 33277干预的HUVEC作为阴性对照,分别培养4、12、36 h,在倒置显微镜下观察各组细胞形态；125I cGMP放射免疫试剂盒检测各组HUVECcGMP的水平.结果:与对照组相比,Pg ATCC 33277分别以MOI 1∶10、1∶50、1∶250干预HUVEC 4、12、36 h后,实验各组HUVEC的细胞形态未见明显改变,仍呈典型的“铺路石”状单层贴壁生长；Pg ATCC 33277 MOI1∶250时可呈时间依赖性地降低HUVEC cGMP水平,而同一时间点内,各浓度组的cGMP水平并无明显差异.结论:短时间内,Pg ATCC 33277对HUVEC的细胞形态无明显影响,但可降低HUVEC cGMP的生成,HUVECNO生物利用度下降.
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牙龈卟啉单胞菌对兔血管平滑肌细胞分泌IL-1β、IL-6的影响
目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)上清液对体外培养的兔血管平滑肌细胞分泌IL-1β、IL-6的影响.方法:组织块法培养兔腹主动脉血管平滑肌细胞,并对其细胞来源进行鉴定.用4.3×106 CFU/mL的Pg上清液刺激细胞12、24、48h后,通过ELISA检测IL-1β、IL -6的水平；同时用RT-PCR检测其mRNA表达的情况.结果:Pg上清液刺激24h和48 h时能促进血管平滑肌细胞分泌IL-6,分别与同一时间点的对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),而且24 h时,IL-6表达强,而IL-1β的表达低,明显低于相同时间的对照组和其他时间点的实验组(P＜0.05).RT-PCR检测显示,4.3×106 CFU/mL的Pg 上清刺激血管平滑细胞12、24、48 h后细胞内均有IL - 1β、IL-6的基因表达,在24 h时,血管平滑肌细胞的IL-Iβ基因表达减少,而IL-6基因表达增加.结论:Pg上清液可促进细胞合成和分泌IL-6,在动脉粥样硬化的发生发展过程中可能发挥一定作用.
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应用电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌的初步研究
目的:探讨应用电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌的可行性.方法:应用电化学阻抗谱方法测量去离子水溶液中特定细菌(牙龈卟啉单胞菌)的电化学阻抗,获得针对特定细菌的敏感阻抗谱,建立特定频率下细菌浓度与系统交流阻抗值之间的函数关系,依据函数关系和测得的电化学阻抗值分析待检样品内特定细菌的浓度.结果:当频率低于104 Hz时,系统的交流阻抗值随去离子水溶液中牙龈卟啉单胞菌浓度的增加而减小;当设定频率为1.2 kHz、待测细菌(牙龈卟啉单胞菌)浓度为103～109/mL时,牙龈卟啉单胞菌浓度C的对数与系统阻抗值Z呈良好的线性关系(R2 =0.98),logC(细胞数/mL)=-0.007 Z(kΩ)+ 10.792;单一浓度检测用时约40 min.结论:基于电化学阻抗原理的电化学测菌法有可能成为简便、快速检测牙周致病菌的新方法.
