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牙龈卟啉单胞菌对兔血管内皮组织中白细胞介素-33表达的影响
目的：用牙龈卟啉单胞菌感染兔建立动脉粥样硬化（AS）模型，观察感染兔主动脉血管内皮细胞中白细胞介素-33（IL-33）的变化，探讨牙龈卟啉单胞菌与AS的关系。方法将24只新西兰大白兔分为对照组和实验组。实验组每周1次静脉注射牙龈卟啉单胞菌培养液，持续12周，建立感染兔AS模型；对照组每周1次注射等量生理盐水。实验13周处死实验动物，观察主动脉血管的组织结构；通过免疫组织化学染色、实时荧光半定量聚合酶链式反应和Western blot法检测兔主动脉血管内皮细胞中IL-33 mRNA和蛋白质的表达。结果实验组血管内皮细胞IL-33 mRNA相对表达量为58.244±2.407，IL-33蛋白相对表达量为1.863±0.171，对照组IL-33 mRNA相对表达量为3.143±0.805， IL-33蛋白相对表达量为0.537±0.028；实验组IL-33的mRNA和蛋白的表达量均明显高于对照组（P<0.01）。结论牙龈卟啉单胞菌感染能促进血管内皮细胞表达IL-33，可能对AS的发生发展有一定的调节作用。
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辅助性T17细胞在牙周炎小鼠中的免疫状态研究
目的：??研究辅助性T（Th）17细胞在牙周炎小鼠中的免疫状态。方法??将7周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为牙周炎组和对照组，每组4只。牙周炎组采用口腔涂抹牙龈卟啉单胞菌（P.?gingivalis）的方法建立牙周炎动物模型。对照组涂抹PBS液。在涂抹结束后的第4周取材，流式细胞仪检测CD4+维甲酸相关核孤儿受体（ROR）γτ+（Th17）细胞；酶联免疫吸附（ELISA）检测Th17细胞相关的细胞因子白细胞介素（IL）-17A的蛋白表达。结果??牙周炎小鼠牙龈组织、颈部淋巴结和外周血中CD4+?RORγτ+（Th17）细胞在总CD4+?T细胞中的比例和细胞数量显著高于对照组（P<0.01）。与对照组相比，牙周炎组IL-17A的表达增加（P<0.05）。结论??在牙周炎的发生发展中，Th17细胞介导的细胞免疫应答增强，牙龈组织、颈部淋巴结和外周血可能是Th17细胞介导免疫应答的主要场所。
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牙龈卟啉单胞菌感染对大鼠血管平滑肌细胞细胞间黏附分子-1表达的影响
目的：观察牙龈卟啉单胞菌ATCC33277感染对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法建立体外牙龈卟啉单胞菌感染大鼠VSMC模型，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测ICAM-1基因的表达。结果牙龈卟啉单胞菌感染VSMC8、16、24h后，ICAM-1表达明显增多，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。感染16h达高峰，感染8h与感染16、24h比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论牙龈卟啉单胞菌感染可引起VSMCICAM-1高表达，这提示牙周致病菌可能参与血管壁的炎症反应，在动脉粥样硬化的发生、发展中有重要的意义。
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自锁托槽与传统托槽对牙周指数和牙龈卟啉单胞菌影响的对比研究
目的 对比正畸患者粘接自锁托槽与传统托槽后牙周指数和牙龈卟啉单胞菌的变化.方法 将正畸患者30例按托槽类型分为2组,每组15例.试验组粘接Clippy自锁托槽,对照组粘接O-PAK传统直丝弓托槽.分别在矫治器戴入前,戴入后第1、3个月检查牙周临床指标(包括菌斑指数、牙龈指数、探诊深度),同时采集龈下菌斑样本,利用实时荧光定量聚合酶链反应检测样本中牙龈卟啉单胞菌和总细菌的数量,计算出牙龈卟啉单胞菌的构成比.结果 治疗前试验组与对照组牙周指数、牙龈卟啉单胞菌构成比差异无统计学意义(P＞0.05).治疗中,2组牙周指数、牙龈卟啉单胞菌构成比均随时间延长而升高(P＜0.05)；试验组在粘接矫治器后第1、3个月,牙周指数、牙龈卟啉单胞菌构成比均低于对照组(P＜0.05).结论 与传统托槽对比,自锁托槽更利于口腔卫生维护,但仍会对口腔卫生造成不利影响.
关键词： 自锁托槽 传统托槽 牙周指数 牙龈卟啉单胞菌 实时荧光定量聚合酶链反应 -
不同细菌密度的浮游牙龈卟啉单胞菌及其生物膜对甲硝唑敏感性的体外研究
目的 比较体外培养的牙龈卟啉单胞菌在不同细菌密度的浮游状态及生物膜状态时对甲硝唑的敏感性变化.初步探讨细菌密度在牙龈卟啉单胞菌生物膜抗药机制中的作用.方法 采用微量液体稀释法,测定甲硝唑对牙龈卟啉单胞菌106CFU·mL-1和109 CFU·mL-1菌悬液(与生物膜细菌密度相同)的低抑菌浓度(MIC)和低杀菌浓度(MBC);在96孔板中形成牙龈卟啉单胞菌生物膜,分别测定甲硝唑对完整生物膜及生物膜悬液的MIC和MBC.结果 甲硝唑对106 CFU·mL-1菌悬液的MIC和MBC分别为0.063、0.125 mg·L-1;对109CFU·mL-1菌悬液的MIC和MBC分别为25、50 mg·L-1;对完整生物膜的MIC为25 mg·L-1,MBC＞125 mg·L-1;对生物膜悬液的MIC和MBC分别为25、125 mg·L-1.结论 甲硝唑对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用受细菌密度影响,细菌密度越高,对甲硝唑的抗性越大;细菌密度在牙龈卟啉单胞菌生物膜对甲硝唑的抗药机制中起到重要作用,但生物膜中胞外基质及生物膜的完整性对生物膜抗药性仍具有重要作用.
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群体感应抑制剂溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成影响的研究
目的 研究群体感应抑制剂溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响.方法 采用二倍稀释法,确定溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌的低抑菌浓度(MIC).含无水乙醇的牙龈卟啉单胞菌菌悬液作为阴性对照组,牙龈卟啉单胞菌菌悬液为空白对照组,通过光密度值测定和扫描电镜观察,研究1/4M1C、1/2MIC、MIC、2MIC等不同浓度溴化呋喃酮对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响.结果 不同实验浓度的溴化呋喃酮均可抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成.随着溴化呋喃酮浓度增加,牙龈卟啉单胞菌菌悬液的光密度值逐渐减小.1/4MIC组、1/2MIC组和MIC组形成的生物膜结构疏松,2MIC组仅见散在的牙龈卟啉单胞菌菌体,未见生物膜结构形成.结论 溴化呋喃酮在不影响细菌生长的情况下,能抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成.溴化呋喃酮的应用可能为牙周病的抗菌治疗提供一条新的途径.
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牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化
目的 克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物.方法 克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,以抗6×His Tag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白.结果 克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的 蛋白表达;Co2+亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白.结论 本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础.
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牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因的克隆及表达纯化
目的 克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因并使其在大肠杆菌中正确表达.方法 利用PCR方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建其原核表达质粒pT-BAD/fimA,获得其在大肠杆菌中的表达,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定重组蛋白.以不同质量浓度咪唑缓冲液(250、200、150、100、50 μmol·L~(-1))洗脱结合在His-tag纯化柱的目的蛋白,选择佳洗脱质量浓度.结果 克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;诱导表达后可观察到相对分子量3.8x10~4的融合蛋白,经MALDI-TOF-MS检测进一步证实为FimA蛋白.100 μmol·L~(-1)咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度高,其纯度为95%.结论 本实验成功克隆了fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到纯度较高的FimA蛋白,为后续研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒奠定了基础.
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孕妇牙周病中牙龈卟啉单胞菌和血清炎性因子与早产低体重儿的关系
目的 探讨孕妇牙周病中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)检出情况、血清炎性因子与早产低体重(PLBW)的关系.方法 通过严格筛查分别选取分娩出早产低体重儿的产妇(PLBW组)和正常分娩的产妇各30例(对照组),对其牙周状况进行检查,记录菌斑指数(PI)、出血指数(BI)、探诊深度(PD)及临床附着丧失水平(CAL),并采集产妇龈下菌斑、静脉血和脐带血,采用16S rRNA PCR法检测菌斑中P.gingivalis,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中自细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和前列腺素E_2(PGE_2)水平.结果 PLBW组牙周状况较差,P.gingivalis在PLBW组和对照组中检出率分别为56.7%和30.0%,两者差异有统计学意义(P<0.05).牙周病变程度、P.ginsivdis检出率与胎儿孕周和出生体重均呈弱负相关(P<0.05).PLBW组静脉血和脐带血中IL-1β、IL-6、PGE_2水平均较对照组高;PLBW组内患有牙周病者静脉血中IL-1β、PGE_2含量高于牙周健康者(P<0.01).结论 孕妇牙周感染可能是导致早产低体重儿的原因之一.
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Nod/Rip2信号通路参与牙龈卟啉单胞菌诱导牙髓细胞白细胞介素-6表达
目的 探讨牙龈卟啉单胞菌刺激牙髓细胞产生细胞因子的信号转导通路.方法 厌氧培养牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis),胞内感染原代培养牙髓细胞,RNA抽提,实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测Nods、Rip2,ELISA检测白细胞介素-6(IL-6)的表达水平.结果 牙髓细胞基础表达Nods、Rip2 mRNA及IL-6.P.gingivalis感染后2 h.Neds和Rip2 mRNA增高,达到高峰,6 h出现下降趋势.而P.gingivalis活菌刺激牙髓细胞能增强IL-6表达水平.结论 P.gingivalis能激活牙髓细胞固有免疫反应,通过Ned/Rip2途径进行信号转导上调细胞因子IL-6表达.
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牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人牙周膜成纤维细胞胶原吞噬作用的影响
目的 研究牙周病致病菌牙龈卟啉单胞菌脂多糖(LPS)对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)胶原吞噬作用的影响.方法 将不同质量浓度的LPS加入体外培养的hPDLF 48 h后,采用荧光定位术和流式细胞技术检测hPDLF胶原吞噬率的变化.结果 LPS导致hPDLF胶原吞噬率显著增加(P＜0.05).结论 牙龈卟啉单胞菌脂多糖具有促进hPDLF吞噬胶原的作用,可能是牙周组织破坏机制之一.
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牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的 克隆牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域(RgpAcd)基因,并将其置于大肠杆菌中作融合表达.方法 利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉单胞菌RgpAcd,然后插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定.将目的 基因片段插入原核表达载体pET-15b来构建表达质粒pET-15b/RgpAcd.重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.结果 核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后的菌体经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一个相对分子质量为5×104的融合表达蛋白产生.结论 本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌RgpAcd基因,并在大肠杆菌中表达了RgpAcd蛋白,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础.
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牙龈卟啉单胞菌在龈下菌斑和颊黏膜中的检测
目的检测牙周健康者及牙周炎患者在颊黏膜和龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的阳性率,探讨其与牙周炎发生和发展的关系.方法选取40例牙周健康者和39例慢性牙周炎患者,分别收集颊黏膜和龈下菌斑样本,提取细菌DNA,设计细菌通用引物和牙龈卟啉单胞菌的特异引物用于PCR扩增,检测牙龈卟啉单胞菌的阳性率.结果牙周健康组菌斑样本和颊黏膜样本牙龈卟啉单胞菌的阳性率分别为37.5%和32.5%,而牙周炎组菌斑样本和颊黏膜样本牙龈卟啉单胞菌的阳性率分别为69.23%和46.15%.牙周炎组菌斑的牙龈卟啉单胞菌阳性率高于牙周健康组,颊黏膜的牙龈卟啉单胞菌阳性率在组间无统计学差异;牙周炎组菌斑牙龈卟啉单胞菌阳性率高于颊黏膜,牙周健康组两部位阳性率无统计学差异.结论牙龈卟啉单胞菌除在菌斑中有高检出率外,在颊黏膜中也有较高的检出率,提示颊黏膜也是牙周细菌在口腔定植的重要部位,牙龈卟啉单胞菌也可在健康人群中检出,提示其有可能是口腔内固有菌群之一.
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不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布
目的分析不同fim A基因型牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)在慢性牙周炎患者中的分布状况.方法收集101例慢性牙周炎患者的龈下菌斑,采用常规培养法和16S rRN APCR检测P.gingivalis,并根据各fimA基因型的特异引物,用聚合酶链反应(PCR)检测不同fimA基因型菌株的分布.结果 16S rRNA PCR检测P.gingivalis阳性检出率为88.1%.大多数受检牙龈下菌斑中只检测出一种fimA基因型菌株(65.1%),各fimA基因型的总检出率:ⅠfimA为24.7%;ⅡfimA为43.8%;ⅢfimA为15.7%;ⅣfimA为40.4%;VfimA为3.4%.结论慢性牙周炎患者龈下菌斑中的牙龈卟啉单胞菌存在fimA基因多态性,ⅡfimA和ⅣfimA基因型P.gingivalis菌株与慢性牙周炎的发生发展关系密切.
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对氨基苯甲酸对牙龈卟啉单胞菌细胞形态影响的扫描电镜观察
目的观察不同浓度对氨基苯甲酸(PABA)对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)菌体形态和黏附能力的影响,从而探讨血链球菌(S.sanguis)在龈下菌斑微生态平衡中的作用.方法用1/2浓度的BHI培养基为实验培养基,分别加入不同质量浓度的PABA,对P.gingivalis进行常规培养,并对培养出的菌细胞做扫描电镜观察.结果过高或过低质量浓度的PABA均影响P.gingivalis的菌体形态,并对其黏附产生影响.结论 S.sanguis产生的PABA影响P.gingivalis的菌体形态和黏附能力,提示S.sanguis对龈下菌斑的微生态平衡具调节作用.
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免疫低下豚鼠伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌感染特征
目的研究免疫低下对青少年牙周炎(JP)特异性病原菌感染的影响.方法二次60Co全身照射制备免疫低下豚鼠及正常豚鼠各36只,随机分组,下前牙龈沟接种伴放线放线杆菌(Aa)和/或牙龈卟啉单胞菌(Pg),于2、3、6周分批处死,进行组织病理学及破骨细胞计数对比研究.结果免疫低下Aa、Pg、Aa+Pg组2、3周时牙周破坏明显,重于免疫正常组,破骨细胞计数高于免疫正常组,有统计学差异(P＜0.05).结论免疫低下加重Aa、Pg对牙周组织破坏,机体免疫状态是JP发生发展的重要环节.
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慢性牙周炎患者龈下菌斑中不同基因型牙龈卟啉单胞菌的检测
目的:建立临床标本中牙龈卟啉单胞菌(P.g)的PCR检测方法,探讨慢性牙周炎患者不同牙位的龈下菌斑中P.g基因型的差异.方法:采用培养法分离鉴定慢性牙周炎患者不同牙位龈下菌斑中P.g,同时采用 PCR检测P.g 16SrDNA、prtC和fimA基因.部分扩增产物测定了核苷酸序列.结果:在66例患者的127个龈下菌斑标本中,P.g 16SrDNA、prtC和fimA多重引物扩增的阳性率为98.4%;PCR阳性率显著高于培养法P.g的检出率(P<0.01).30.0%的患者(18/60)同时感染了不同基因型的P.g菌株.P.g 16SrDNA、prtC和fimA扩增片段的核苷酸序列同源性在98.62%～100%之间.结论:本文所建立的P.g的PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,适用于P.g的快速临床诊断.同一患者可被不同感染来源的多株P.g同时感染.
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牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株的构建
目的 构建牙龈卟啉单胞菌毒力岛基因PG0839突变菌株,为研究PG0839基因功能提供实验基础.方法 扩增1 584 bp PG0839基因片段,对聚合酶链反应(PCR)产物和pUC19载体进行BamHⅠ和EcoR Ⅰ双酶切,连接酶切产物得到质粒pPG0839-1.将2 101 bp erm基因产物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoRV位点,构建质粒pPG0839-2,作为电穿孔的供体质粒.电穿孔转化于受体菌牙龈卟啉单胞菌W83菌株,红霉素抗性培养基筛选阳性克隆,命名为PG0839基因突变菌株.结果 运用插入失活方法构建PG0839基因突变菌株,进而通过酶切、测序、PCR和反转录PCR对PG0839基因突变菌株进行验证,证实PG0839基因突变菌株构建成功.结论 本实验成功构建PG0839基因突变菌株.
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牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的 克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达.方法 利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH.克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH.重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.结果 核酸序列测定与分析表明:表达重组子pET-32a-GAPDH与NCBI核酸数据库中收录的GAPDH序列同源性达99.802%;在佳浓度的IPTG诱导下,GAPDH可高效表达.结论 本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞茵GAPDH基因,并在大肠杆菌中表达了GAPDH蛋白,为后续实验研究GAPDH的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础.
关键词： 牙龈卟啉单胞菌 3-磷酸甘油醛脱氢酶 原核表达 -
不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激中性粒细胞产生基质金属蛋白酶8和9的比较
目的 比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)刺激下人外周血中性粒细胞(PMNs)产生基质金属蛋白酶8、9 (MMP-8、MMP-9)的差异.方法 采用密度梯度离心分离法分离纯化培养PMNs,P.gingivalis ATCC33277(Ⅰ fimA)、WCSP 115(ⅡfimA)、WCSP 1.5(ⅢfimA)、W83(ⅣfimA)、WCSP 559(ⅣlimA)菌悬液与新鲜分离的PMNs悬液共孵育2 h,于5 min、30 min、1 h、2 h收集上清液,用ELISA方法检测MMP-8、MMP-9的表达.结果 不同fimA基因型P.gingivalis刺激PMNs产生MMP-8、MMP-9的能力都显著高于未受刺激组;Ⅱ fimA、ⅣfimA(W83)型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP-8在速度及昔上均高于ⅢfimA、ⅣfimA(WCSP 559)型P.gingivalis;Ⅰ fimA、ⅡfimA、ⅣfimA(W83)型P.gingivalis刺激PMNs分泌MMP9-能力高ⅢmfimA、ⅣfimA(WCSP 559)型P.gingivalis.结论 ⅡfimA、ⅣfimA型P.gingivalis的致病能力相对较强,提示P.gingivalis的毒力和致病性与fimA基因型存在相关性.
