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酶联免疫斑点技术在出入境人员结核分枝杆菌快速检测中的应用
[目的]寻求一种试验周期短,特异性高的结核病检测方法.[方法]采集100份入境人员的外周抗凝全血标本,采用基于酶联免疫斑点试验(ELI SPOT)的结核感染检测试剂盒T SPOT-TB,测定结核杆菌特异抗原刺激反应的效应T淋巴细胞数量.[结果]T SPOT-TB阳性率试验对象的性别、年龄无相关性,而与标本来源地区呈相关性.[结论]T SPOT-TB的敏感性和特异性均较高,可用于口岸出入境人员结核感染的快速检测.
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酶联免疫斑点试验快速检测结核分枝杆菌感染的应用评价
目的 评价γ干扰素释放实验(IGRA)诊断活动性结核病的价值.方法 选取130例胸片异常的出入境人员,根据胸片是否存在活动性病变将研究对象分为试验组(60例)和对照组(70例),采取IGRA检测试剂盒T SPOT.TB,测定结核杆菌特异抗原刺激反应的效应T淋巴细胞数量,结合实验室痰菌涂片和培养结果评价该技术对活动性肺结核的筛查价值.结果 T-SPOT.TB在筛查临床诊断的活动性肺结核患者中的敏感性与结核菌素皮肤试验(TST)接近,分别为73.3％比78.3％特异性显著优于TST试验(结核菌素皮肤试验),为60％和27.3％;在痰菌检查阳性的活动性肺结核确诊患者和痰菌检查阴性的对照组受试者中,T-SPOT.TB诊断活动性肺结核患者的敏感性和特异性进一步提高,与TST试验相比,敏感性为93.1％比75.9％,特异性为62.7％比35.8％.结论 T-SPOT.TB检测活动性肺结核的敏感性高,优于传统的TST方法,提示该技术可用于在临床疑似结核病患者中快速筛查活动性肺结核.
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HLA-B宽特异性抗原表位Bw4对HCV特异性T细胞反应影响分析
目的 探讨HLA-B分子宽特异性抗原表位Bw4对丙型肝炎病毒(HCV)特异性T细胞反应的影响.方法 以有偿献血途径感染HCV患者86例为研究对象,采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法,进行HLA分型.采用ELISPOT技术观察HCV非结构蛋白NS3、NS4及NS5诱导T细胞分泌IFN-γ反应.结果 86例HCV感染者中Bw4/4纯合子患者29例(33.7％)、Bw4/6杂合子患者38例(44.2％)、Bw6/6纯合子患者19例(22.1％).Bw4/4纯合子、Bw4/6杂合子、Bw6/6纯合子HCV病毒载量分别为(3.98±0.32) Log(IU/ml)、(5.22±0.29) Log(IU/ml)、(5.04±0.38) Log(IU/ml),3组比较,HCV病毒载量差异具有统计学意义(P=0.0153).24例患者进行HCV非结构蛋白(NS3、NS4、NS5)诱导T细胞分泌IFN-γ反应,Bw4/4纯合子组HCV特异性T细胞反应率为50％ (5/10),反应强度中位数为70 SFU/106 PBMC(0～2020 SFU/106 PBMC),非Bw4/4纯合子组中,HCV特异性T细胞反应率为14.28％ (2/14),反应强度中位数为0 SFU/106 PBMC (0～200SFU/106 PBMC).两组比较,Bw4/4纯合子组反应强度明显高于非Bw4/4纯合子组,差异有统计学意义(P=0.0450),前者HCV特异性T细胞反应频率高于后者,差异接近有统计学意义(P=0.069).在Bw4/4纯合子组,HCV以NS5诱导的T细胞反应为主体,其反应频率为50％ (5/10),非Bw4/4纯合子组,NS5反应频率仅为7.14％(2/14),两者比较差异接近具有统计学意义(P=0.050).结论 携带Bw4/4纯合子HCV感染者,病毒载量较低,HCV特异性T细胞反应较强.Bw4可能通过增强HCV特异性T细胞免疫,进而产生对抗HCV复制的作用.
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结核杆菌抗原诱导非人灵长类特异性IFN-γ的差异性分析
目的 探讨不同的非人灵长类结核感染动物模型对结核特异性抗原产生免疫应答的差异性,为选择合适的动物模型做疫苗评价提供依据. 方法 采用流式细胞术对恒河猴和食蟹猴CD4+T和CD8+T细胞中CD69和HLA-DR阳性细胞进行了比较,并采用PPD和ESAT-6/CFP-10多肽库对2种感染结核分枝杆菌的实验猴外周血单个核细胞( PBMCs )刺激,使用酶联免疫斑点技术( ELISPOT)对IFN-γ进行检测. 结果 流式细胞术分析显示,未感染结核分枝杆菌的恒河猴中表达CD69和HLA-DR表面标记分子的CD4+T和CD8+T细胞比例明显大于食蟹猴(P<0.01). PPD刺激感染10、11个月的实验猴PBMCs、恒河猴斑点形成单位分别是食蟹猴的3、3.5倍. ESAT-6/CFP-10多肽库刺激后,恒河猴PBMCs斑点形成单位也高于食蟹猴. 结论 恒河猴PBMCs对结核特异性抗原刺激诱导产生IFN-γ比食蟹猴更为敏感,适合运用于对结核疫苗免疫指标的评价.
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ELISPOT技术检测供体特异性IFN-γ分泌频数在早期诊断急性排斥反应中的意义
目的 探讨急性排斥反应的早期诊断方法及ELISPOT技术在供体评估方面的应用价值.方法 采用小鼠腹部心脏移植模型,分为移植排斥组、实验处理组和同系移植组,每组20对.观察移植物存活时间和供心病理改变,应用ELISPOT技术检测受鼠脾细胞悬液IFN-γ活性分泌细胞频数.结果 移植排斥组及实验处理组移植物平均存活时间分别为(7.80±0.77)d、(14.80±1.01)d,同系移植组移植物存活均超过28 d,3组差异有统计学意义.移植排斥组与实验组及同系移植组相比较,移植物内心肌细胞变性坏死严重并有大量炎性细胞浸润.移植术后第7天,3组供体特异性IFN-γ活性分泌细胞频数分别为(416±19)、(44±8)、(7±2)个/2×105,其与相应移植物存活时间存在明显负相关,而与病理分级存在明显正相关.而非特异性IFN-γ活性分泌细胞频数均很低,差异无统计学意义.结论 应用ELISPOT技术检测术后早期供体特异性IFN-γ活性分泌细胞频数可作为急性排斥反应的一个早期诊断指标.此技术具有较高的灵敏性与特异性,可用于术前供体配型.
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小鼠CD4+记忆性T淋巴细胞的产生、纯化、鉴定及皮肤移植的检测
目的 建立CD4+记忆T细胞(memory T lymphocytes,Tm)的免疫磁珠分离方法,并检测其体外部分功能.方法 借助小鼠皮肤移植模型,制备受鼠脾细胞悬液,运用免疫磁珠方法分离CD4+Tm,用台盼蓝染色法和流式细胞仪检测分选所得细胞的活性和纯度,并在体外用ELISPOT技术检测其不同抗原刺激时IFN-γ活性分泌频数.结果 小鼠皮肤移植皮片平均存活时间为(13.6±0.9)d;分离所得CD4+Tm的活细胞百分率为(98.4±0.7)%;流式细胞术检测表型,其中CD4+CD8-细胞比例占(96.06±2.49)%,CD44+CD62L-细胞比例占(94.13±2.36)%,CD4+CCR7-细胞比例占(96.39±1.93)%;在无刺激物作用或者大鼠脾细胞、供体脾细胞、刀豆素A等刺激物作用时,IFN-γ活性分泌频数分别为3±1、6±3、339±14、108±9个/104,差异有统计学意义.结论 通过小鼠皮肤移植模型及免疫磁性分离技术,可制备高纯度无菌的CD4+Tm,其细胞活力不受影响,作用具有良好的供体特异性.这为深入研究Tm在移植物免疫方面的作用提供了技术资料.
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结核抗原特异性IFN-γ ELISPOT检测技术用于诊断HIV感染者人群中结核潜伏感染的研究
目的 探讨结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)检测技术在HIV感染者中用于诊断结核潜伏感染的应用价值.方法 运用自行研发的结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ ELISPOT检测方法对110例确诊的HIV感染者及205例HIV阴性健康志愿者的外周血结核特异性IFN-γ释放水平进行检测,并同时进行结核菌素皮肤试验(研).结果 ELISPOT在HIV感染和HIV/AIDS正在接受抗病毒治疗人群中的阳性率分别为24.5%和29.8%,明显高于HIV阴性健康人群7.3%(P＜0.001);对多种不同部位多肽抗原刺激以P8.10的敏感性高,但与其他抗原的差异无统计学意义(P＞0.05);不同CD4细胞计数水平对ELISPOT检测结果尤影响(P＞0.05);PPD试验在HIV感染人群中的阳性率远远低于ELISPOT检测方法,其差异有统计学意义(P＜0.0001).结论 结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ ELISPOT检测技术在艾滋病合并结核潜伏感染的早期诊断中有很大的应用价值,推荐用于艾滋病合并结核潜伏感染的辅助诊断.
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葡萄膜炎患者视网膜S抗原特异性T细胞的检测
目的 联合酶联免疫斑点法(ELISPOT)及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测葡萄膜炎患者外周血视网膜S抗原(S-Ag)特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞,探讨S-Ag介导的细胞免疫反应是否参与了人葡萄膜炎炎症发展过程.方法 选取活动期葡萄膜炎患者23例作为研究对象,以14例健康志愿者作为正常对照,采集受试者肘静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC).提取、纯化牛S-Ag,以牛S-Ag作为刺激剂与PBMCs共培养,以不加抗原作为阴性对照,以加anti-CD3单克隆抗体作为阳性对照.应用ELISPOT法检测IFN-γ分泌细胞的数量以鉴定T细胞对S-Ag的反应性,同时确定S-Ag特异性Th1细胞的频率;应用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的水平,从整体水平检测Th1型免疫反应.结果 60.9%(14例)的葡萄膜炎患者的PBMCs对S-Ag的刺激产生免疫反应,S-Ag特异性Th1细胞的频率为7.4±4.7 SFC/2×105 PBMCs.阴性对照组均未见阳性细胞染色,阳性对照中,对S-Ag有反应患者和对S-Ag无反应患者的IFN-γ分泌细胞数量相同,但较正常人均显著增多(P=0.006,P=0.004).细胞培养上清中检测到不同程度的IFN-γ表达,与阴性对照相比,对S-Ag有反应患者IFN-γ表达量显著增高(P=0.018),对S-Ag无反应患者及正常人表达量无明显变化.阳性对照中,对S-Ag有反应患者和对S-Ag无反应患者IFN-γ分泌量相同,但较正常人均增多(P=0.013,P=0.036).结论 大部分葡萄膜炎患者体内存在S-Ag特异性T细胞,这群细胞介导的Th1型免疫反应在葡萄膜炎发生、复发过程中发挥重要作用.
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酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用现状
酶联免疫斑点技术(ELISPOT)由Czerkinsky等[1]于1983年根据酶联免疫吸附实验(ELISA)而建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学新技术.起初用于检测B淋巴细胞分泌抗体的数量来推断B淋巴细胞的功能,后来用于检测T淋巴细胞分泌细胞因子的数量来推断T淋巴细胞功能.Lalvani等[2]首先将ELISPOT用于结核病的诊断后,相关报道日益增多[3].现将ELISPOT在结核病诊断中的进展综述如下.
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酶联免疫斑点法在诊断艾滋病合并结核病中的应用研究
目的 探讨T细胞酶联免疫斑点法(T SPOT)在我国用于诊断艾滋病合并结核病的应用价值.方法 应用T SPOT对35例明确诊断的艾滋病合并结核病患者的血液样本进行结核分枝杆菌特异性T细胞的检测,同时对所有患者做PPD试验进行比较.结果 在艾滋病合并结核病的所有患者、CD4<200/μl、CD4>200/μl、抗结核疗程<2个月及抗结核疗程>2个月的各组患者中,T SPOT检测的阳性检出率分别为65.71%、66.67%、60.00%、83.33%和25.00%,而PPD试验的阳性检出率仅为24.24%、25.00%、33.33%、9.09%和25.00%,其中在患者总体、CD4<200/μl组、抗结核疗程<2个月组中,T SPOT检测的阳性检出率远高于PPD试验,差异有统计学意义(P<0.05).结论 TSPOT检测的敏感性高于目前常用的PPD试验,适用于我国艾滋病合并结核病的快速诊断.
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肾移植受者术前供者反应性干扰素γ和转化生长因子β生成细胞的频数及其意义
LISPOT与肾移植术后6个月肾功能相关,可能为肾移植受者远期预后提供信息.
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流式细胞因子检测技术及其在结核病中的应用
细胞因子主要介导和调节免疫应答及炎症反应.正常情况下,细胞因子的表达和分泌受到严格的调控,病理状态下会出现异常表达,故检测细胞因子对于疾病的诊断、治疗具有重要意义.细胞因子免疫学检测方法基本原理是将细胞因子作为抗原,用针对该抗原的特异性抗体进行定量或定性的检测.既往检测技术主要采用ELISA法,由于细胞因子半衰期不同,其检测结果的准确性降低.酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospotassay,ELISPOT)检测的是分泌细胞因子的细胞数量,不受细胞因子代谢的影响,能比较真实反应体内细胞因子水平,已得到广泛研究并应用到临床结核感染的诊断中[1,2].流式细胞术(flow cytometry,FCM)能明确产生细胞因子的细胞数量,不仅可同时检测几种细胞因子,还可确定产生细胞因子的细胞亚型,是一种相对快速并能准确定量的检测细胞因子的方法.
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289例结核感染患者外周全血T-SPOT.TB检测与结核抗体IgM比较结果分析
目的 分析T-SPOT.TB检测结核感染的敏感度和特异性,其作为快速、准确的检测手段,给临床提供诊断依据,控制结核感染蔓延新法.方法 选择本院门诊及住院的结核病患者289例,分别进行T-SPOT.TB及结核抗体IgM检测.结果 外周血检测T-SPOT.TB阳性263例,结核抗体IgM检测阳性243例,对照阳性率:T-SPOT.TB检测阳性率为91.0%(263/289),结核抗体IgM检测阳性为84.1%(243/289),经统计学处理P ＜ 0.05,T-SPOT.TB检测优于结核抗体IgM检测.T-SPOT.TB优于结核抗体IgM检测,T-SPOT.TB检测诊断,可在保持高灵敏性,高特异性的同时,进一步提高结核分枝杆菌检出率.结论 对早期诊断可获得较好治疗效果的肺结核和肺外结核患者,该选择灵敏度高,特异性强,T-SPOT.TB快速检测有一定优势.
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酶联免疫斑点技术对儿童结核病诊断的应用价值
目的 研究ELISPOT试验在儿童结核病临床诊断中的应用价值.方法 对2011年11月～2012年11月入住笔者医院的32例儿童结核病患儿及38例非结核患儿进行痰涂片分析、结核抗体检测、PPD试验及ELISPOT试验检测,比较分析不同方法的检测结果并进行统计学分析.结果 ELISPOT诊断儿童结核病的敏感度为87.5％,特异性为94.7％,与PPD试验相比,敏感度和特异性均高于PPD试验,但敏感度差异无统计学意义(P =0.323),特异性差异有统计学意义(P=0.003).而与PPD强阳性诊断结核病的敏感度和特异性比较,特异性相仿(P=0.485),敏感度显著高于PPD试验(P ＜0.001).ELISPOT试验阳性率为87.5％,显著高于痰培养及结核抗体检测阳性率,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 ELISPOT试验具有相对较高的敏感度和特异性,是诊断儿童结核的快速敏感方法,在儿童结核感染早期临床诊断中有重要的应用价值.
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酶联免疫斑点检测和结核菌素试验在初治肺结核中的辅助诊断价值
目的 比较酶联免疫斑点检测(ELISPOT)和结核菌素试验(TST),探讨ELISPOT在初治肺结核中的辅助诊断价值.方法 选取初治肺结核123例和非结核疾病病例102例作为结核组和对照组,应用6 kD早期分泌靶向抗原/10 kD培养滤过蛋白融合蛋白(ESAT-6/CFP-10)作为抗原对受试者外周血单个核细胞进行ELISPOT(即ESAT-6/CFP-10-ELISPOT),检测斑点形成细胞(SFCs)的数量;同时对受试者行TST.结果 结核组ESAT-6/CFP-10-ELISPOT形成的SFCs数显著高于对照组(P=0.000).结核组中ESAT-6/CFP-10-ELISPOT的敏感度91.1%(111/123)、特异度80.4%(82/102)、阳性似然比4.60、阴性似然比0.12、阳性预测值0.85、阴性预测值0.87,TST的敏感度65.6%(59/90)、特异度45.1%(46/102)、阳性似然比1.31、阴性似然比0.76、阳性预测值0.51、阴性预测值0.60.ESAT-6/CFP-10-ELLS-POT的敏感度和特异度显著高于TST(均P=0.000).菌阳肺结核组和菌阴肺结核组间ESAT-6/CFP-10-ELLSPOT形成SFCs数量差异无显著性(P=0.166),两组ESAT-6/CFP-10-ELISPOT的敏感度分别为91.8%(67/73)和88.0%(44/50),二者比较差异无显著性(P=0.448).结论 ESAT-6/CFP-10-ELISPOT有可能作为辅助诊断初治肺结核的较为准确方法,并为菌阴肺结核提供一定的诊断依据,但诊断的特异度可能受结核潜伏感染影响.TST对初治肺结核的诊断价值较小.
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ELISPOT(酶联免疫斑点技术)对肺结核诊断价值的Meta分析
目的 评价ELISPOT方法对肺结核的诊断价值.方法 收集公开发表的有关ELISPOT对肺结核诊断价值的研究文献,根据制定的文献纳入与排除标准对文献进行筛选,利用QUA DAS量表对入选文献进行质量评价,对符合条件的研究进行Meta分析.结果 共入选17篇文献,其中中文14篇,英文3篇,16篇文献质量为优,1篇为差,共纳入研究对象2813人,Spearman相关分析结果显示不存在阈值效应,但DOR的Cochran-Q检验显示存在非阈值效应引起的异质性,异质性值P为61.8％,提示存在中等异质性,采用随机效应模型进行合并分析,得到汇总灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比分别为0.88(0.86～0.90)、0.85(0.83～0.87)、6.05(4.74～7.71)、0.14(0.11～0.18),SROC曲线A UC为0.94,Q2为0.88.结论 ELISPOT方法对肺结核具有较高的诊断价值,但是仍需进一步的扩大样本量,进行多中心的系统研究,进行相应的亚组分析与分层分析,找出异质性的来源.
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系统性红斑狼疮活动误诊为结核引发严重药物过敏一例
患者女,47岁.主因确诊系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)1年,反复发热3个月伴全身皮疹2d于2010年11月2日入院.2009年11月在某三甲医院确诊为"SLE、间质性肺炎",并给予泼尼松60mg/d、羟氯喹口服0.2g/d,环磷酰胺0.6/次,每4周1次共6次,静脉冲击治疗,2010年7月开始泼尼松10mg/d,羟氯喹0.1g/d维持治疗,2010年8月患者开始反复出现发热,体温波动在38℃左右,无咳嗽,无腹泻,无尿频、尿急及尿痛.2010年9月患者因发热到我科门诊就诊,门诊诊断考虑"SLE活动",泼尼松加量至30mg/d口服,之后患者仍间断发热,故2010年10月患者因反复发热3个月到某三甲医院就诊,并收入院,经过系列检查后诊断为"结核菌感染",感染部位不明确,依据是结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB);以特异性抗原为刺激原,应用酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)提示有反应性.
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酶联免疫斑点技术在风湿病患者结核诊断中的应用
风湿病患者由于自身免疫系统紊乱,或是由于使用激素、免疫抑制剂及抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)治疗等原因,成为结核病的易感人群,除活动性肺结核外,很多患者表现为痰菌阴性、无症状的潜在结核病感染(latent tuber-culosis infcction,LTBI),而到目前为止还没有确切有效的方法来诊断LTBI.
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基于立即早期蛋白IE62建立水痘-带状疱疹病毒感染性滴度检测方法
目的:基于水痘-带状疱疹病毒(VZV)立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点检测技术(ELISpot)建立一种新型的VZV感染性滴度的快速检测方法.方法:应用生物信息学方法设计并合成VZV-IE62蛋白的多肽抗原,牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,筛选和制备抗VZV-IE62单克隆抗体,应用Western blot和免疫荧光法等开展抗体性能评价,继而应用酶联免疫斑点技术(ELISpot)结合生物素-亲和素放大法建立新型的VZV感染性滴度检测方法,并与经典空斑计数法进行比较.结果:获得抗VZV-IE62的单克隆抗体1B7,应用于ELISpot方法可特异识别VZV感染后的细胞,以之为基础建立了新型的VZV感染性滴度检测方法.相比经典空斑计数法,该方法可显著缩短检测时间(从5至7d缩短至32 h)检测结果具有较好的一致性.结论:本研究建立了一种新型的基于VZV立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点技术的VZV感染性滴度检测方法(VZV-IE62 ELISpot),具有潜在的转化应用前景,可为VZV的防治研究提供支持.
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急性脑梗死和Alzheimer病脑脊液高水平髓鞘素抗原B细胞免疫应答
目的确认急性脑梗死(ACI)和Alzheimer病(AD)对髓鞘素碱性蛋白(MBP)、髓鞘素结合糖蛋白(MAG)和含脂质蛋白(PLP)的B细胞免疫应答.方法采用酶联免疫斑点技术检测了ACI、临床可能AD和其它神经疾病(OND)对照组患者外周血和脑脊液(CSF)中MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞.结果 ACI、AD和OND患者外周血中均可检出IgG、IgA、IgM三种表型MBP、MAG、PLP抗体分泌细胞,无显著差异.但ACI和AD患者CSF中IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞均呈显著性增高.结论 ACI急性脑缺血损伤和AD神经变性可能导致体内B细胞激活及CNS内髓鞘素反应性B细胞免疫应答,其病理意义有待探讨.
