首页 > 文献资料
-
N-乙酰半胱氨酸抑制亚砷酸钠诱导心肌细胞凋亡和自噬作用的研究
目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制亚砷酸钠诱导H9C2细胞凋亡和自噬作用及机制.方法:用亚砷酸钠诱导H9C2细胞构建凋亡和自噬模型.采用CCK-8比色法检测细胞的存活率,Hoechst 33258核染色法观察凋亡细胞的形态和数量改变,双氯荧光素染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western Blot法测定蛋白P53、Bcl-2、Bax及LC3的表达水平,以及磷酸化ERK1/2蛋白及ERK1/2蛋白总量的表达水平.结果:与对照组相比,15μM亚砷酸钠处理的H9C2细胞存活率显著降低,细胞内ROS水平明显增加,凋亡细胞数量明显增多,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值明显增大(P＜0.01).1 mM NAC预处理后显著减少H9C2细胞内ROS的生成和促凋亡蛋白P53和Bax的表达,诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高,同时降低自噬相关蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值.亚砷酸钠处理诱导ERK1/2蛋白磷酸化(P＜0.01),而NAC和亚砷酸钠共处理抑制了ERK1/2蛋白的磷酸化.结论:亚砷酸钠降低H9C2细胞的存活率,增加细胞内ROS的生成,诱导细胞凋亡和自噬.NAC通过降低H9C2细胞内的ROS水平和抑制ERK1/2蛋白的磷酸化拮抗亚砷酸钠诱导的细胞凋亡和自噬.
-
姜黄素对H2O2诱导H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用
目的 研究姜黄素对H2O2诱导H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护效应.方法 将细胞按随机数字表法分为空白对照组、H2O2诱导组及姜黄素低、中、高剂量组,每组设6个复孔.除空白对照组外,其余各组加入200μmol/L的H2O2进行干预,姜黄素低、中、高剂量组分别加入10、20、40μmol/L姜黄素进行干预.干预后24 h,利用荧光显微镜观察细胞形态,CCK8法检测姜黄素对细胞增殖的影响,测定细胞培养上清中LDH、肌酸激酶(creatine Kinase,CK)、AST活性及MDA含量,检测细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性.结果 与H2O2诱导组比较,姜黄素低、中、高剂量组LDH[(247.36±28.04)U/L、(195.14±21.37)U/L、(132.27±16.33)U/L比(247.58±28.34)U/L]、AST[(67.27±10.58)U/ml、(54.81±8.60)U/ml、(42.14±5.95)U/ml比(84.34±12.36)U/ml]、CK[(1.34±0.66)U/ml、(0.95±0.42)U/ml、(0.71±0.39)U/ml比(1.56±0.74)U/ml]活性及MDA[(227.39±32.05)nmol/ml、(185.11±24.37)nmol/ml、(143.50±16.37)nmol/ml比(274.19±36.51)nmol/ml]含量降低(P<0.05),细胞裂解液中SOD[(17.67±1.36)U/mg、(21.54±1.72)U/mg、(28.37±2.36)U/mg比(14.37±1.22)U/mg]、CAT[(19.58±3.87)U/mg、(25.34±4.06)U/mg、(30.21±4.83)U/mg比(14.77±3.25)U/mg]和GSH-Px[(1.99±1.17)U/mg、(2.56±1.29)U/mg、(3.04±0.45)U/mg比(1.67±0.87)U/mg]活性升高(P<0.05).结论 姜黄素可改善H2O2诱导H9C2心肌细胞氧化应激损伤,保护心肌细胞.
-
参芎葡萄糖注射液对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用
目的:探讨参芎葡萄糖注射液(Shenxiong glucose injection,SGI)对过氧化氢(H2O2)诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用及其机制.方法:体外培养H9c2心肌细胞,用H2O2(300 μmol·L-1)处理0.5h,建立H9c2心肌细胞H2O2氧化损伤模型,SGI组:H9c2细胞用(100,200,400 μ mol·L-1)SGI处理6h后,另设空白组与模型组,再用H2O2处理0.5h.利用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(MMP);用MTS法检测细胞存活率;用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;用蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)的表达情况.结果:在300 μmol·L-1H2O2作用细胞0.5h的情况下,细胞存活率降低至50％左右,降低的程度合适,且实验结果重复性好,因此后续实验用该条件建立氧化损伤模型.与模型组比较,SGI预处理6h能显著升高细胞存活率(P ＜0.05,P＜0.01),减少LDH的外漏和MDA的生成(P＜0.05,P＜0.01),显著增加SOD,GSH-Px和CAT的活性(P＜0.01),明显减少H9c2细胞内ROS含量(P＜0.01),并使MMP丢失减少(P＜0.01),Western blot表明,SGI能显著上调Bcl-2的表达,下调Caspase-3的表达(P＜0.05,P＜0.01).结论:参芎葡萄糖注射液能保护H9c2心肌细胞对抗H2O2诱导的氧化损伤,其作用机制可能与其提高细胞清除ROS能力和抑制细胞凋亡有关.
-
益心解毒方对AngⅡ诱导的H9c2细胞NADPH氧化酶表达作用机制的研究
目的:采用H9c2心肌细胞系,研究益心解毒方含药血清抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞Nox2、Nox4型NADPH氧化酶表达的影响.方法:取对数生长期的H9c2心肌细胞,同步化后进行实验,实验分为正常组、模型组、益心解毒方组、二亚苯基碘(DPI)对照组.采用乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法测定H9c2心肌细胞内活性氧(ROS)水平;RT-PCR法和Western-blot法测定Nox2亚基和Nox4亚基的表达量.结果:研究发现,与模型组比较,益心解毒方含药血清能抑制ROS和Nox2、Nox4亚基表达的增高,其中益心解毒方低剂量组作用为显著(P＜0.01,P＜0.05).结论:结合课题组前期的动物实验研究表明,益心解毒方在改善心功能、减缓心室重构等方面药效显著,而抑制NADPH氧化酶活性,降低心肌ROS水平可能是其发挥药效的重要机制.
-
四君子汤(生晒参/红参)对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡的保护作用研究
该研究首先筛选了四君子汤(红参)等药液组体外干预H9c2心肌细胞的给药浓度,优选其中高、中、低3个剂量组进行后续实验;建立了体外H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡模型以考察四君子汤(生晒参/红参)对其保护作用,从而为优选用于临床治疗缺血性心脏病的四君子汤中的人参炮制品提供参考,以更好地体现其疗效;并考察其对SOD,MAD和LDH等指标影响以初步阐明作用机制.结果表明,四君子汤中用红参较生晒参对H2O2诱导心肌细胞损伤保护作用为好,二者均可提高SOD活性,减少MDA产生和LDH释放,从而明显减少心肌细胞凋亡数量,起到一定的保护作用.
-
荭草对H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤保护作用的谱效关系研究
目的:研究荭草中花穗、带叶嫩枝和粗茎对H2O2诱导H9c2心肌细胞氧化损伤的保护作用,探讨其抗心肌缺血的药效物质基础.方法:建立荭草中花穗、带叶嫩枝和粗茎的UPLC指纹图谱,对色谱峰进行归属确认,同时观测荭草中花穗、带叶嫩枝和粗茎不同配比组合物对心肌细胞氧化损伤的保护作用(应用MTF法作为浓度筛选和细胞存活率判定指标,并检测丙二醛含量),将各组合物活性信息与其相应的UPLC指纹图谱化学信息进行相关性分析研究,推测药效物质基础.结果:荭草中带叶嫩枝和花穗对H2O2诱导H9c2心肌细胞氧化损伤具有明显的保护作用,谱效相关性研究发现,3～5,11 ～14,18 ～ 19,21 ～ 25号色谱峰与抗氧化活性呈正相关.结论:通过谱效研究,推测了荭草抗氧化损伤的活性成分,为荭草药材深层次研究开发奠定一定的实验基础.
-
基于MI-RI大鼠心肌细胞代谢组学研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制
四逆汤是经典《伤寒论》中的急救方,由附子、甘草(炙)、干姜组成,研究建立体外H9c2心肌细胞MI-RI模型,通过观察正常对照组、MI-RI模型组、四逆汤作用组和缺甘草四逆汤作用组细胞的形态学特征,测定各组细胞的存活率、LGH和CK活性.同时收集各组细胞培养液并采用GC-MS技术进行检测,对采集数据进行多元统计分析(PCA,PLS-DA,OPLS-DA),得到17个代谢标志物(指认15个),并对其相对含量及代谢途径进行分析.研究结果显示四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中氮的代谢等生物代谢途径得以实现的.研究也证明四逆汤与缺甘草四逆汤对MI-RI模型损伤H9c2心肌细胞均具有明显的保护作用,且四逆汤组保护作用更加显著.
-
黄芪总苷、赤芍总苷及丹参总酮对微波辐射后H9c2心肌细胞保护作用研究
目的 探讨黄芪总苷、赤芍总苷及丹参总酮对微波辐射后H9c2心肌细胞活性氧及心肌酶谱改变的保护作用.方法 H9c2心肌细胞随机分为正常对照组(C)、辐射对照组(R)、1mg/l给药组(L)、3 mg/L给药组(M)和9 mg/L给药组(H).黄芪总苷、赤芍总苷及丹参总酮采用1 mg/L,3 mg/L,9 mg/L 3个剂量预处理48 h后,采用平均功率密度为30 mW/cm2的微波辐射H9c2心肌细胞,于辐射后30 min检测细胞中ROS含量、培养基中CK及LDH活性.结果 辐射对照组心肌细胞中ROS含量和培养基中CK及LDH活性明显升高(P＜0.05或P＜0.01);黄芪总苷、赤芍总苷和丹参总酮组对上述指标改变呈现不同程度的改善作用;与辐射对照组比较,心肌细胞中ROS含量,黄芪总苷3个剂量给药组、赤芍总苷低剂量、丹参总酮低和高剂量给药组均明显降低(P ＜0.05或P＜0.01);CK及LDH活性于黄芪总苷中、高剂量组及丹参总酮中剂量组明显降低(P＜0.05).结论 30 mW/cm2微波辐射可引起H9c2心肌细胞CK、LDH活性及ROS含量升高;黄芪总苷、赤芍总苷及丹参总酮对上述指标改变的改善效果良好,其中黄芪总苷改善效果佳,佳有效剂量为3 mg/L.
-
芍药苷对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用
目的 探讨芍药苷对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用.方法 培养H9C2心肌细胞,用不同浓度的H2O2(50、100、200、400、800、1600μmol/L)作用于心肌细胞4 h,选出H9C2心肌细胞氧化损伤模型的浓度.以50、100、200μmol/L的芍药苷预处理心肌细胞24 h,以选出的浓度为400μmol/L的H2O2建立氧化损伤模型,采用MTT法检测H9C2心肌细胞的活力,化学试剂盒检测心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量.多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD检验.结果 各H2O2浓度组细胞活力显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);各芍药苷浓度组细胞活力高于H2O2模型组,且随着芍药苷浓度的升高而升高,差异具有统计学意义(P<0.05);各芍药苷浓度组细胞活力低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);各芍药苷浓度组细胞LDH漏出量、MDA含量显著低于H2O2模型组,且随着芍药苷浓度的升高而降低,差异具有统计学意义(P<0.05);各芍药苷浓度组细胞LDH漏出量、MDA含量高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);各芍药苷浓度组细胞SOD含量显著高于H2O2模型组,且随着芍药苷浓度的升高而升高,差异具有统计学意义(P<0.05);各芍药苷浓度组细胞SOD含量显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 芍药苷对H2O2诱导的H9C2心肌细胞的损伤有明显的保护作用.
-
Uqcrc1的 RNA 干扰片段筛选及其对 H9C2心肌细胞耐受缺氧/复氧损伤的影响
目的：筛选泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白（Ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1， Uqcrc1）高效的 RNA 干扰片段，探讨 Uqcrc1基因沉默对大鼠 H9C2心肌细胞耐受缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤的影响。方法制备三种针对Uqcrc1的RNA干扰片段，采用RT-PCR和Western blot检测Uqcrc1 RNA干扰片段转染后Uqcrc1基因和蛋白的表达，从中筛选出有效的RNA干扰片段及转染浓度，采用MTT法和LDH试剂盒分别检测H/R损伤后H9C2心肌细胞的存活率和LDH漏出率。结果靶序列为CCGUUGCUGUAGCUAACAAdTdT的siUqcrc1片段对Uqcrc1 mRNA的抑制作用明显，在转染浓度为200 nmol/L时对Uqcrc1蛋白表达抑制明显。靶向Uqcrc1的RNA干扰片段转染降低了H9C2心肌细胞耐受H/R损伤的能力。与阴性对照组相比，Uqcrc1基因沉默组H9C2心肌细胞H/R损伤后的存活率显著降低，LDH漏出率升高（P＜0.01）。结论 Uqcrc1在心肌细胞耐受H/R损伤中起了重要作用，它可能是心肌保护的又一个关键靶点。
-
Apelin-13对H9c2心肌细胞增殖及ERK1/2信号通路活化的影响
目的 分析Apelin-13对H9c2心肌细胞增殖及ERK1/2信号通路活化的影响.方法 体外培养后的H9c2心肌细胞分为对照组、Apelin-13组、U0126(ERK1/2抑制剂)组和Apelin-13+U0126四组.对照组:只使用10％的FBS和DMSO处理;Apelin-13组:在对照组基础上分别加入浓度为0.0001,0.001,0.01和0.1μmol/L的Apelin-13(n=5);U0126干预组:在对照组基础上加入浓度为10μmol/L的U0126;Apelin-13+U0126组:在对照组基础上分别加入0.1μmol/L的Apelin-13和10μmol/L的U0126.各组依次恒温培养24 h后,采用MTT法测定H9c2心肌细胞在490 nm处各组的光密度值(OD值,n=5)并计算其细胞增值率,采用Western blot法测定各实验组ERK1/2信号通路磷酸化水平.结果 与对照组比较,U0126干预组所测各细胞指标差异无统计学意义(P>0.05).与对照组比较,Apelin-13组的干预显著升高各组H9c2心肌细胞的OD值,促进了H9c2心肌细胞的增殖,升高了心肌细胞的p-ERK1/2表达量;并且0.001～0.1μmol/L Apelin-13四组间,细胞增值率及p-ERK1/2表达量有显著的统计学差异,随Apelin-13剂量的增加,各组的OD值、细胞增殖率及p-ERK1/2表达量亦显著升高(P<0.05).与Apelin-13组比较,Apelin-13+U0126组H9c2心肌细胞的OD值、细胞增值率及p-ERK1/2表达量显著降低(P<0.05).结论Apelin-13促进了H9c2心肌细胞的增殖,并存在显著的剂量依赖性,Apelin-13通过ERK1/2信号通路调控了H9c2心肌细胞的细胞增殖.
关键词： Apelin-13 H9C2心肌细胞 ERK1/2信号通路 -
人参皂苷Rb1通过抑制PI3K/AKT信号通路保护脂多糖诱导的心肌细胞炎症反应
目的 探究人参皂苷Rb1在脂多糖(LPS)诱导的H9C2心肌细胞炎症反应中的作用及分子机制.方法 建立LPS诱导的H9C2心肌细胞炎症反应模型.在用1μg/ml的LPS诱导H9C2心肌细胞炎症反应前,使用100μM人参皂苷Rb1或1μM PI3K抑制剂Wortmannin预处理1 h,2 h后收集细胞样本.利用qPCR检测白介素-6(IL-6),白介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平;用ELISA试剂盒检测细胞上清IL-6,IL-1β,TNF-α的蛋白表达;用WB实验检测p-AKT和AKT的表达水平.结果 人参皂苷Rb1显著抑制LPS诱导的IL-6,IL-1β,TNF-α的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.001)表达水平;人参皂苷Rb1显著抑制LPS诱导的PI3K/AKT信号通路的激活(P<0.001);PI3K抑制剂Wortmannin也能显著抑制LPS诱导的p-AKT表达水平以及IL-6,IL-1β,TNF-α的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.001)表达水平.结论 人参皂苷Rb1通过抑制PI3K/AKT信号通路阻止LPS诱导的心肌细胞炎症反应.
-
LATS2基因通过Wnt信号通路对H9C2心肌细胞保护的作用机制研究
目的 探讨大肿瘤抑制因子2(LATS2)基因对缺氧复氧(H/R)诱导的H9C2心肌细胞凋亡及Wnt信号通路的影响.方法 LATS2 siRNA或LATS2过表达质粒转染H9C2心肌细胞,并分别转染阴性对照siRNA及空载体(vector),转染48 h后,通过Western blotting检测转染后的各组细胞中LATS2的蛋白表达;建立H/R模型,细胞分为正常对照组(Control组)、单纯缺氧复氧组(H/R组)、H/R+LATS2-siRNA组和H/R+pcDNA3.1-LATS2组,流式细胞术检测各组细胞凋亡率及活性氧(ROS)含量;Western blotting检测凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)及Wnt信号通路β-连环蛋白(β-catenin)和c-myc的蛋白表达.结果 siRNA组和PcDNA3.1组的LATS2蛋白表达与Control组差异无统计学意义(P>0.05),而LATS2-siRNA组LATS2的蛋白表达显著低于Control组(P<0.05),pcDNA3.1-LATS2组LATS2的蛋白表达显著高于Control组(P<0.05);与Control组比较,H/R组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著升高(P<0.05),与H/R组比较,H/R+LATS2-siRNA组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著升高,H/R+pcDNA3.1-LATS2组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著降低(P<0.05).结论 抑制LATS2基因表达可诱导心肌细胞凋亡及上调Wnt信号通路,而抑制LATS2基因表达反之.
-
天麻素抑制血清剥夺诱导的H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡作用
目的:通过构建血清剥夺诱导的大鼠H9C2心肌细胞模拟心肌缺血,从细胞层面探讨天麻素(gastrodin,Gas)对H9C2心肌细胞自噬(autophagy)及凋亡(apoptosis)的作用及其机制.方法:体外培养的大鼠H9C2心肌细胞随机分为对照组、血清剥夺(3 ～48 h)处理组、Gas(20 μmol·L-1,1h)处理组、Gas(20μmol·L-1,1h) +3-MA(5 mmol·L-1,1h)共同处理组和3-MA(5 mmol·L-1,1h)处理组.采用免疫荧光双标记检测方法在荧光显微镜下观察细胞内LC3蛋白水平的变化;应用逆转录聚合酶链式反应检测Bax和Bcl-2的mRNA水平的变化;采用蛋白质印迹分析方法检测自噬相关蛋白Beclin-1,ATG5和LC3以及凋亡相关蛋白Caspase-3,Bax和Bcl-2蛋白的表达及其变化规律.结果:血清剥夺(3～48 h)诱导H9C2心肌细胞自噬水平增强;天麻素预处理可下调血清剥夺诱导的H9C2心肌细胞的自噬及凋亡水平;天麻素通过抑制H9C2心肌细胞的自噬,下调细胞的凋亡水平.结论:天麻素通过抑制血清剥夺诱导的H9C2心肌细胞自噬,从而发挥抗凋亡的心肌保护作用.
-
香青兰及其含药血清对H9c2心肌细胞三种缺氧／复氧损伤模型的影响
目的:比较香青兰醇提物及其含药血清对H9c2心肌细胞3种缺氧／复氧损伤模型的影响,考察香青兰对心肌缺血／再灌注损伤的保护作用.方法:体外培养H9c2心肌细胞,以Na2S2O4,N2和厌氧袋为缺氧环境分别建立缺氧／复氧损伤模型,以T-SOD,MDA,LDH为指标,考察香青兰醇提物(1,10,100 μg·mL-1)及其含药血清对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响.结果:与模型组比较,香青兰醇提物及其含药血清能明显抑制缺氧／复氧损伤H9c2心肌细胞LDH释放和MDA含量,升高T-SOD活力(P＜0.05或0.01).结论:香青兰醇提物及其含药血清对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤具有保护作用,提示香青兰具有保护心肌缺血／再灌注损伤的作用.
关键词： 香青兰 血清药理学 H9C2心肌细胞 缺氧/复氧损伤 心肌缺血/再灌注损伤 -
非选择性腺苷受体激动剂5'-N-乙基酰胺基腺苷的体外心肌保护作用及其机制研究
目的 研究腺苷A2A和A2B受体是否参与[5'-(N-ethylcarboxamido) adenosine,NECA]的抗心肌缺血再灌注损伤作用及其相关机制.方法 利用H9c2心肌细胞建立模拟缺血/再灌注损伤模型,给予非选择性腺苷受体激动剂5'-N-乙基酰胺基腺苷[5'-(N-ethylcarboxamido) adenosine,NECA]及选择性腺苷A2A受体拮抗剂(SCH58261,SCH)、选择性腺苷A2B受体拮抗剂(MRS1706,MRS),采用CCK-8法测定细胞活性、JC-1染色检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)、Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶试剂盒测定细胞内H2O2水平,活性氧试剂盒检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,MitoSox Red超氧化物指示剂检测线粒体内活性氧水平.结果 5'-N-乙基酰胺基腺苷明显改善缺血/再灌注损伤引起的细胞活性和线粒体膜电位的降低,显著抑制缺血/再灌注损伤导致的细胞和线粒体内活性氧含量的升高,腺苷A2A及A2B受体拮抗剂均可阻断5'-N-乙基酰胺基腺苷的上述作用(P＜0.01或P＜0.05).结论 5'-N-乙基酰胺基腺苷可减轻H9c2心肌细胞的缺血/再灌注损伤,腺苷A2A、A2B受体共同参与5'-N-乙基酰胺基腺苷的心肌保护作用,其机制可能与调节线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的开放及线粒体活性氧的产生有关.
-
益心解毒方抑制H9C2心肌细胞凋亡的作用机制
目的 研究益心解毒方对H9C2心肌细胞凋亡的抑制作用及可能机制.方法 实验分为正常组、模型组、益心解毒方组和槲皮素组,采用缺氧缺糖/复氧复糖诱导H9C2心肌细胞凋亡,研究益心解毒方的保护作用.运用CCK-8法检测细胞存活率,镜下观察细胞的形态改变,Fluo-3AM荧光染色法检测细胞内钙超载,Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡的情况,实时荧光定量PCR检测Fas和FasL的基因表达,Western Blot 测定p-Akt和caspase-8蛋白的表达.结果 与正常组比较,模型组细胞存活率显著下降,细胞皱缩变形,细胞发生钙超载,凋亡细胞增多,Fas和FasL的mRNA表达增加,caspase-8蛋白表达升高,p-Akt表达降低,均有统计学差异(P<0.05).与模型组比较,益心解毒方组细胞存活率增加,细胞形态有改善,细胞钙超载减轻,凋亡细胞的数量减少,p-Akt蛋白的表达上调,FasL mRNA和caspase-8蛋白的表达下调,均有统计学差异(P<0.05).结论益心解毒方能抑制H9C2心肌细胞凋亡,其作用机制可能与减轻钙超载和调控外源性凋亡途径相关.
-
益心解毒方对Nox2和Nox4亚基过表达的心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响
目的：通过观察益心解毒方含药血清对Nox2、Nox4亚基过表达的H9 c2心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响，揭示其作用环节是否与干预相应亚型的 NADPH 氧化酶调控环节有关。方法采用PCR方法扩增Nox2、Nox4基因全长序列，经双酶切、连接载体和转化后提取重组质粒，经酶切鉴定的阳性质粒进行DNA测序，测序正确后按照lipofectamine 2000试剂的说明书瞬时转染H9 c2细胞，转染后的心肌细胞分组给予不同的药物干预，24 h 后检测 NADPH 氧化酶活性。结果①含有Nox2／Nox4亚基的重组质粒载体通过测序鉴定，结果与GenBank报道的完全一致。②通过荧光显微镜下观察转染72 h后的H9 c2细胞，可见大量发绿色荧光的细胞，流式细胞术计数结果显示转染率均在60％左右，符合实验要求。③空质粒载体组、模型组、益心解毒方组的NAD－PH氧化酶活性表达明显高于正常组（ P＜0．01，P＜0．05）；模型组和益心解毒方组的NADPH氧化酶活性表达高于空载体组（ P＜0．01）；模型组NADPH氧化酶活性表达均明显高于其他各组，而益心解毒方各组的NADPH氧化酶活性表达均明显低于模型组（ P＜0．01， P＜0．05）。结论成功构建大鼠心肌细胞Nox2、Nox4亚基的重组质粒载体，该重组质粒载体可以在心肌细胞中过表达，益心解毒方可以有效地降低NADPH氧化酶活性的表达。提示此复方治疗心衰的机制可能是抑制了Nox2和Nox4型NADPH氧化酶的表达。
关键词： 益心解毒方 H9C2心肌细胞 过表达 NADPH 氧化酶活性 -
银杏内酯B对H2O2诱导H9C2心肌细胞损伤保护作用研究
目的:研究银杏内酯B(ginkgolide B,GB)对H2O2诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用及机制.方法:将对数生长期的H9C2心肌细胞随机分为4组:空白对照、H2O2(200μmol/L)干预、GB(100μmol/L)+H2O2(200μmol/L)干预、GB(200μmol/L)+H2O2(200 μmol/L)干预,每组设10个复孔.经药物干预16h后观察各组细胞形态,采用MTT法检测细胞存活率;检测培养液中心肌酶(AST、CPK、LDH)活性;测定细胞中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;酶联免疫法(ELISA)测定培养液中炎性因子(CRP、TNF-α、IL-1、IL-6)含量水平;采用流氏细胞术检测细胞凋亡状况并计算细胞凋亡率,采用反转录PCR(RT-PCR)技术检测细胞中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达并计算bcl-2/Bax表达比值,Western blot法检测细胞中NF-κB蛋白表达并进行半定量分析.结果:与H2O2干预组比较,GB(100、200μ mol/L)+H2O2(200μmol/L)干预组细胞培养液中AST、CPK活性和TNF-α、IL-6、CRP、MDA含量均显著降低,SOD、CAT活性显著升高,细胞凋亡率显著降低;bcl-2 mRNA表达显著上调、Bax mRNA表达显著下调,bcl-2/Bax表达比值显著升高,差异均具有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01);其中GB(200μmol/L)+H2O2(200μmol/L)干预组细胞生存状态明显改善、存活率显著升高,LDH活性、IL-1含量以及NF-κB蛋白表达量显著降低,细胞中GSH-Px活性显著升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论:GB对H2O2诱导损伤H9C2心肌细胞具有保护作用,作用机制可能与GB能够有效改善抗氧化酶活性、抑制氧化应激损伤,上调抑凋亡基因bcl-2表达、下调促凋亡基因Bax表达,提高bcl-2/Bax表达比值,下调NF-κB蛋白表达,降低炎性因子含量相关.
-
橙皮素对脂多糖诱导H9C2心肌细胞活性氧水平的影响
目的 探讨橙皮素对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导H9C2心肌细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响.方 法 使用不同浓度橙皮素(0.0625、0.125、0.25 μmol/L)和LPS(1 μg/ml)共同孵育H9C2心肌细胞120min,DCFH-DA探针检测H9C2细胞ROS水平,荧光显微镜定性观察以及流式细胞仪定量检测各组细胞荧光强度,以观察不同浓度橙皮素对LPS诱导H9C2心肌细胞产生ROS的影响.选择0.25 μmol/L橙皮素和LPS(1 μg/ml)共同孵育H9C2心肌细胞30、60、120min,观察橙皮素对LPS诱导H9C2心肌细胞产生ROS的时间相关性.结果 橙皮素干预可以浓度依赖性的缓解LPS诱导H9C2心肌细胞ROS产生;在60、120min,橙皮素能够抑制LPS诱导H9C2心肌细胞ROS产生.结论 橙皮素能够抑制LPS诱导的H9C2心肌细胞ROS产生,从而降低心肌细胞氧化应激水平,其有可能成为心肌保护新的潜在药物.
