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精子抗原肽的合成及其在酶联免疫吸附法检测抗精子抗体中的应用价值
目的:以合成精子抗原肽为抗原建立酶联免疫吸附测定法( ELISA)检测抗精子抗体(AsAb).方法:通过PS3全自动合成仪合成精于肽P10G、YLP12和SP17抗原肽,经反相高效液相色谱(HPLC)纯化和质谱鉴定,分别包板制备ELISA试剂盒,并检测血清标本.结果:成功合成3种目的肽,质谱分析结果主峰分子量与理论值基本一致,HPLC结果显示其纯度为97.5％、97.78％和95.5％.以3种合成肽为抗原建立ELISA检测AsAb,与商品化试剂盒比较,均显示极好的一致性(Kappa值＞0.75).结论:全自动固相多肽合成技术可用于高纯度的精子抗原肽合成,所合成的P10G、YLP12和SP17抗原肽均具有较好的抗原活性,可作为ELISA的包被抗原用于AsAb检测.
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人抑制素βB亚基片段的合成及其单克隆抗体的制备
目的合成人抑制素βB亚基两个片段βB(1-28) (GLECDGRTNLC-CRQQFFIDFRLIGWNDW), βB(85-115) (LSTMSMLYFDDEYNIVKRDVPNMIVEECGCA) 并制备其单克隆抗体.方法应用固相多肽合成法人工合成了2个βB亚基片段,以化学合成的片段作为半抗原,经抗原的制备、单抗的制备获得4株杂交瘤细胞株.单抗的鉴定及特异性分析实验表明这些单克隆抗体具有特异性,敏感性和实用性.对抑制素α,βA,βB亚基的单抗进行了进一步的纯化.用纯化后的单抗进行了乳腺癌的免疫组化研究.结果相关肿瘤组织对各亚基单抗的免疫组化反应无明显差异;乳腺癌对各亚基单抗的免疫组化反应阳性率无明显差异.结论在现有实验的基础上建立血清抑制素的测定方法是可能的.
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人抑制素βA亚基片段的合成及抑制素α亚基、βA亚基单克隆抗体的制备
目的合成人抑制素α亚基1个片段和βA亚基两个片段βA(1-28) (GLECDGKVNICCKKQFFVSFK-DIGW-NDW), βA(82-114) (VPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECG)并制备了相应的单克隆抗体.方法应用固相多肽合成法人工合成了1个抑制素α亚基片段和2个βA亚基片段,以化学合成的片段作为半抗原,经抗原和单抗的制备获得7株杂交瘤细胞株.测定了单抗的滴度、特异性和相对亲和力.结果单抗的鉴定及特异性分析实验表明这些单克隆抗体具有特异性、敏感性和实用性.结论在这些实验的基础上建立测定血清抑制素水平的方法是可能的.
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痛稳素和痛稳素(10～17)对孤啡肽对抗内吗啡肽-1及内吗啡肽-2镇痛作用的影响
目的研究痛稳素及其碳末端八肽在小鼠脑内对孤啡肽对抗内吗啡肽-1及内吗啡肽-2镇痛作用的影响.方法以固相多肽合成法合成了痛稳素及其碳末端八肽,侧脑室注射孤啡肽、痛稳素及其碳末端八肽,用辐射热甩尾法测定痛阈.结果孤啡肽可对抗内吗啡肽-1及内吗啡肽-2的镇痛作用;痛稳素及其碳末端八肽不影响小鼠的基础痛阈,但可逆转孤啡肽对抗内吗啡肽-1及内吗啡肽-2的镇痛作用.结论痛稳素及其碳末端八肽在脊髓以上水平可逆转孤啡肽对抗内吗啡肽-1及内吗啡肽-2的镇痛作用.
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孤啡肽及其片段的合成、痛觉调节作用和对免疫功能的影响
目的:研究孤啡肽(NC)与其4个片段(NC(1-15)NH2, NC(1-13)NH2, NC(1-11)NH2, NC(1-5)NH2) 在痛觉调节和免疫活性上的变化,探讨NC的构效关系.方法:固相多肽合成法合成NC及其片段;甩尾法测定它们对小鼠的痛敏作用和对吗啡镇痛作用的拮抗;T细胞玫瑰花结形成百分率和红细胞免疫粘附能力评测对免疫功能的影响.结果:虽然NC及其片段均有痛敏作用并可拮抗吗啡的镇痛作用,但NC(1-11)NH2和NC(1-5)NH2比母体活性约降低100倍,而NC(1-13)NH2和NC(1-15)NH2与母体有相同的活性.NC及片段(0.3～3 nmol·kg-1)对T细胞免疫功能均有促进作用;NC(1-11)NH2(0.3 nmol·kg-1)对红细胞的免疫粘附能力有促进作用;NC(1-5)NH2(0.3～30 nmol·kg-1)不影响红细胞的免疫功能.结论:C端在NC的构效关系中有重要的作用.
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普兰林肽的固相合成
目的:探索普兰林肽的固相合成、氧化条件及纯化方法.方法:采用Fmoc固相多肽合成法,以Rink Amide-AM树脂做载体,HBTU/HOBt/DIEA做缩合剂,逐步缩合得到全保护线性普兰林肽树脂,以TFA/苯甲硫醚/苯酚/H2O/EDT/TIS配比的裂解液脱除保护基团,分别采用空气,二甲基亚砜,双氧水氧化两个半胱氨酸的巯基形成一对二硫键,半制备反相高效液相色谱法纯化.结果:合成含37个氨基酸以及一对二硫键的普兰林肽经RP-HPLC和MALDI-TOF-MS确证,粗品纯度在50.0％以上,粗品经半制备型反相高效液相色谱纯化,所得精肽的纯度大于95.0％,总收率为30.5％.结论:该方法简单,合成的产品成本低,纯度高,可为工业化生产提供借鉴.
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人胸腺肽α1的固相合成及体外活性研究
目的对胸腺肽α1的固相合成工艺进行研究,并对合成产物进行活性评价.方法采用对碱敏感的Nα-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基的保护基,以Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin为起点,逐个延伸固相合成法合成胸腺肽α1.与Nα-Fmoc-基团配套的保护策略还有:叔丁氧羰基(Boc)保护Lys的侧链氨基,叔丁酯基(OtBu)保护Asp、Glu的侧链羧基,叔丁氧基(tBu)保护Ser、Thr的侧链羟基,三苯甲基(Trt)保护Asn的侧链酰胺基.采用DCC-HOBt缩合剂法进行接肽反应,茚三酮定性显色法和水杨醛定量自由氨基检测法控制反应进程,肽段后用TFA-DCM(V∶V=1∶1)定量地从树脂上切除.结果胸腺肽α1总产率为33.2%.纯化后的产物,经SDS-PAGE和RP-HPLC鉴定,纯度为98.8%以上,活性与日达仙对照品相当.结论 Nα-芴甲氧羰基保护策略的固相合成方法操作简便、条件温和、副反应少,产品纯度高、收率高.
关键词： 药物化学 制备 固相多肽合成 胸腺肽α1 Nα-芴甲氧羰基(Fmoc) -
缩宫素的制备
以Rink Amide树脂为载体,Fmoc保护的氨基酸为原料,采用Fmoc/tBu固相多肽合成法,按缩宫素的肽序列合成还原型缩宫素粗肽,环化后经制备型RP-HPLC纯化得纯度为99％的缩宫素,总收率34.0％.
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一组含卤素阳离子抗菌肽的制备、抗菌活性和溶血毒性测定
本研究以抗菌肽F-K-K-L-L-K-K-L-R-K-F-NH2(1)为模板,通过卤素苯丙氨酸的替换和硫醚键环化的方式,设计了10条具有新型结构的阳离子抗菌肽(2～11),用固相合成法合成直链肽,碱性条件下环化生成环肽.采用反相高效液相色谱法分离纯化,以微量肉汤稀释法测定抗菌肽的低抑菌浓度(MIC),使用脱纤维羊血测定其溶血毒性.结果显示,改造后得到的抗菌肽10的抗菌活性比1有显著提高,对大肠埃希菌的MIC为1μg/ml,活性是1的4倍;对耐药鲍曼不动杆菌的MIC为4μg/ml,活性是1的8倍.
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胸腺素α1的分离纯化
化学合成胸腺素α1采用阴离子交换色谱和制备型RP-HPLC两步纯化.阴离子交换色谱以pH8.0的Tris-HCl为缓冲液,0～0.35mol/L NaCl溶液离子强度梯度洗脱;制备型RP-HPLC采用C18柱,流动相A为0.1%三氟乙酸-H2O,流动相B为0.1%三氟乙酸-90%乙腈,线形梯度10%～35%B,0～60min洗脱,流速2.0ml/min,检测波长214nm.纯化结果采用分析型RP-HPLC和Tricine-SDS-PAGE检测,终产物纯度达98.8%以上.
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胸腺五肽肽库制备及其免疫活性分析
目的合成胸腺五肽D型氨基酸取代肽库,并测定对T淋巴细胞的免疫活性.方法利用组合化学技术,采用简便的茶袋法固相合成制备肽库化合物,对得到的粗肽进行分离纯化,质谱和高效液相色谱(HPLC)测定纯度,免疫活性测定采用氚标记胸腺嘧啶掺入法.结果粗肽得率平均在54%左右.通过HPLC分离得到纯肽,经质谱及HPLC分析,所制类似物相对分子质量与胸腺五肽一致,精制后的肽得率平均在36.4%左右.对T淋巴细胞增殖反应的影响作用发现,肽库中两个类似物具有明显刺激T淋巴细胞增殖的活性作用.结论D-氨基酸置换的胸腺五肽类似物对T淋巴细胞的免疫调节作用比胸腺五肽作用更强.
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痛稳素碳末端八肽翻转孤啡肽对抗吗啡镇痛的作用
目的观察痛稳素碳末端八肽在小鼠脑内对孤啡肽对抗吗啡的镇痛作用的影响. 方法固相多肽合成法合成了痛稳素碳末端八肽,用辐射热甩尾法测定痛阈,观察(1)小鼠脑室注射(icv)孤啡肽对吗啡镇痛作用的影响;(2) 小鼠脑室注射(icv)痛稳素碳末端八肽对小鼠基础痛阈的影响;(3)小鼠脑室联合注射(icv)痛稳素碳末端八肽和孤啡肽对吗啡镇痛作用的影响.结果孤啡肽可对抗吗啡的镇痛作用;痛稳素碳末端八肽本身不影响小鼠的基础痛阈,但可逆转孤啡肽对抗吗啡的镇痛作用.结论痛稳素碳末端八肽在脊髓以上水平可以逆转孤啡肽对抗吗啡的镇痛作用.
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巨细胞病毒抗原性肽段的固相合成及其抗原性的初步评价
目的合成巨细胞病毒结构蛋白的强抗原性表位肽段,并对其抗原性进行初步评价.方法根据巨细胞病毒结构蛋白的抗原性表位,以Fmoc基团保护的氨基酸为原料,用固相多肽合成技术(SPPS)合成了具有强抗原性的部分肽段,以高效液相色谱技术鉴定纯化,并用酶联免疫吸附剂试验对其抗原性进行了初步评价.结果成功合成了包含巨细胞病毒的结构蛋白强抗原性表位的两个肽段,纯度达95%以上,并且具有很高的抗原性.结论固相多肽合成技术可以用于制备巨细胞病毒的抗原性表位肽段,并且所合成肽段具有良好的抗原活性,可以作为抗原用于巨细胞病毒感染的检测.
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α-芋螺毒素TxIB氧化折叠路径研究
目的 阐明TxIB线性肽通过一部氧化法,在体外被氧化折叠形成含有两对二硫键活性肽的具体路径,为后续大量人工合成该活性肽的方法研究提供基础.方法 采用N-9芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法人工合成TxIB线性肽,用高效液相和质谱分析法,监测研究TxIB一步氧化折叠过程中所经历的路径.结果 TxIB氧化路径经历了1对二硫键(1SS)、2对二硫键(X-2SS)折叠中间体后,终形成稳定的含有2对二硫键(N-2SS)的氧化型TxIB.结论 芋螺毒素TxIB折叠路径与前期研究的水蛭素氧化折叠路径一致.
关键词： α-芋螺毒素TxIB 固相多肽合成 切割 氧化折叠路径 -
Ald1-Helicokinin I的合成研究
目的:用荧光非天然氨基酸Aladan(Ald)改造昆虫神经肽Helicokinin I.方法:采用多肽固相合成法合成Ald1-Helicokinin I,基质辅助激光解吸电离质谱确证,经反相高效液相色谱法纯化,纯度达97%以上.结果与结论:Ald1-Helicokinin I的合成具有快捷、简便、高效等特点,终收率31.8%,且Ald1-Helicokinin I可作为荧光探针,进一步研究配体跟受体的相互作用.
关键词： helicokinin I 神经肽 固相多肽合成 -
人精子蛋白17抗原肽的合成及其在抗精子抗体检测中的应用研究
目的:合成人精子蛋白17的线性B细胞表位肽(118-127aa),并以此为抗原建立抗精子抗体(AsAb)检测的ELISA方法. 方法:用PS3全自动多肽合成仪合成人精子蛋白17抗原肽,并经反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定.该合成肽作为ELISA法的包被抗原来检测血清中的AsAb(IgG).结果:合成了实验所需要的抗原性肽段,高效液相色谱法(HPLC)结果显示其纯度为95.5%.以该合成肽为抗原建立的检测AsAb(IgG)的间接ELISA方法,与商品化试剂盒相比符合率为93.3%.结论:所合成的人SP17抗原肽具有较好的抗原活性,可作为间接ELISA法的包被抗原用于抗精子抗体的检测.
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精子抗原肽P10G和YLP12的合成及在ELISA检测中的意义
目的 人工合成精子肽P10G和YLP12,以此为抗原建立检测抗精子抗体(AsAb)的酶联免疫吸附测定法(ELISA).方法 用PS3全自动合成仪合成精子肽P10G和YLP12,经反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定.分别包板制备ELISA试剂盒,用以检测血清中的AsAb.结果 成功合成两种目的肽,质谱结果显示其相对分子质量均与理论相对分子质量相吻合,高效液谱法(HPLC)结果显示其纯度为97.5％和97.8％.以该两种合成肽为抗原,建立AsAb的ELISA,与商品化试剂盒比较均显示极好的一致性(Kappa值为0.77和0.79,＞0.75).结论 全自动固相多肽合成技术可用于合成高纯度的精子抗原肽,所合成的P10G和YLP12均具有较好的抗原活性,可作为包被抗原用于AsAb的ELISA检测.
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固相合成法制备环肽Hymenistatin-1及其含statine的类似物
目的 研究固相合成法制备Hymenistatin-1[HS-1,序列为cyclo-(-Pro-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu-Ile-Ile-)]及其statine类似物的工艺步骤和影响因素.方法 采用Fmoc或Boc保护α-氨基,以HBTU/NMM为缩合剂进行直链肽接肽反应、以BOP/HOBt/DIEA为缩合剂进行环化固相合成HS-1及其类似物.用色谱仪和质谱仪对合成的环肽及其杂聚肽类似物进行纯化鉴定.结果 多肽合成收率可达65%,经反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱对合成的多肽进行纯化后纯度均达到90%以上,通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪(MALDI-MS)检测所合成的环肽及环肽类似物的分子质量与理论分子质量相符.结论 成功合成出了较高纯度的目标多肽化合物.
关键词： 固相多肽合成 HS-1 Statine类似物 纯化 -
精子肽的固相合成及其在免疫性不孕诊断中的应用研究
目的 合成特异性精子肽,并对其抗原性进行初步评价,从而探讨检测抗精子抗体的ELISA 试剂盒制备.方法 应用固相多肽合成技术,以Fmoc基团保护的氨基酸为原料,合成特异性精子肽.以高效液相色谱(HPLC)技术鉴定纯化,并用ELISA检测其抗原性.结果 成功合成了所需肽段,HPLC 结果显示纯度达95%以上.该合成肽包被的ELISA试剂盒检测抗精子抗体的结果,与商品化试剂盒相比较符合率达90.6%.结论 固相多肽合成技术可用于合成高纯度特异性的精子肽,且所合成肽段具有良好的抗原活性,包板建立的ELISA方法可以用于免疫性不孕中抗精子抗体的检测.
