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丹参对肝星状细胞间质胶原酶及Ⅰ型胶原基因表达的调节
目的 观察丹参对HSC-T6细胞间质胶原酶及Ⅰ型胶原基因表达的影响.方法 以不同浓度的丹参(0.8、0.4 g/L)作用于培养的肝星状细胞株HSC-T6细胞48 h,收集细胞,提取总RNA；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定间质胶原酶(MMP13)及Ⅰ型胶原的基因表达水平.结果 MMP13基因表达水平在丹参0.8、0.4 g/L两组分别为0.25 ±0.05、0.27±0.06,而空白对照组为0.26±0.04.Ⅰ型胶原基因表达水平在丹参0.8、0.4 g/L两组分别为0.76±0.10、1.55±0.23,而空白对照组为3.12±0.46.结论 丹参可明显抑制HSC-T6细胞Ⅰ型胶原的基因表达,且与剂量有关；但对间质胶原酶的基因表达无明显影响.
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复方861对肝星状细胞间质胶原酶及Ⅰ型胶原基因表达的影响
目的 观察复方861对HSC-T6细胞间质胶原酶(MMP13)及Ⅰ型胶原基因表达的影响.方法 以不同浓度的复方861(1.00、0.50、0.25 g/L)作用于培养的肝星状细胞株HSC-T6细胞48 h,收集细胞,提取总RNA;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定MMP13及Ⅰ型胶原的基因表达水平.结果 MMP13基因表达水平在复方861 1.00、0.50、0.25 g/L 3组分别为1.03±0.16、0.60±0.08、0.33±0.04,而空白对照组为0.26±0.04.Ⅰ型胶原基因表达水平在复方861 1.00、0.50、0.25 g/L 3组分别为0.12 ±0.01、0.34±0.04、0.67 ±0.10,而空白对照组为3.12±0.46.结论 复方861可明显促进HSC-T6细胞间质胶原酶的基因表达,并明显抑制Ⅰ型胶原的基因表达；且该作用与剂量有关.
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褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响
目的:探讨褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响.方法:将HSC-T6细胞分为空白对照组、阴性对照组及药物组,用不同浓度的褐藻素培养HSC-T6细胞.采用CCK-8检测在24 h、48 h和72 h褐藻素对HSC-T6细胞活力变化的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blot法分别检测Bcl-2和Bax的蛋白表达.结果:与空白对照组相比,CCK-8检测的结果表明,褐藻素在一定浓度范围内(15 ～ 75 μmol/L)内能显著抑制HSC-T6细胞的活力(P＜0.01),呈剂量和时间依赖性.流式细胞术结果显示,24 h后高浓度(60 μmol/L)组对HSC-T6细胞周期影响的效果显著(P＜0.01),G1期比例显著下降(P＜0.01),G2期和S期的比例显著升高(P＜0.01),48 h后低浓度(15 μmol/L)和中浓度(30 μmol/L)组对HSC-T6细胞周期的阻滞作用增强,呈剂量依赖性(P＜0.05);低、中、高浓度组早期凋亡率和总凋亡率都显著升高,呈剂量依赖性(P＜0.05).蛋白印迹法实验结果表明,低、中、高浓度组Bax的蛋白表达显著上调,中、高浓度组Bcl-2的蛋白表达显著下调(P＜0.05).结论:褐藻素可以通过使细胞周期阻滞于S期和G2期而抑制HSC-T6细胞生长;同时能通过下调Bcl-2和上调Bax的表达而诱导HSC-T6细胞凋亡.
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三甲益肝颗粒含药血清对HSC-T6细胞形态、增殖和凋亡的影响
目的 观察三甲益肝颗粒(San Jia Yi Gan granula,SJG)含药血清对HSC-T6细胞形态、增殖和凋亡的作用,探讨SJG抗肝纤维化的细胞学基础.方法 雄性SD大鼠30只按随机数字表法分为5组,每组6只,分别为生理盐水对照组(Control)、水飞蓟宾组(Sily)、低剂量SJG组(SJG-L)、中剂量SJG组(SJG-M)和高剂量SJG组(SJG-H).SJG按低、中、高(1.7、3.4、6.8 g/kg)3个剂量灌胃大鼠制备含药血清,并用不同体积分数(5%、10%、20%、40%)SJG含药血清干预HSC-T6细胞株,用倒置相差显微镜观察HSC-T6细胞形态学的变化,MTT法检测SJG药物血清对HSC-T6细胞增殖的影响,流式细胞仪检测SJG药物血清诱导HSC-T6细胞早期凋亡.结果 含药血清干预后,细胞形态发生明显改变:药物组细胞较对照组细胞明显减少,细胞间隙较宽,细胞皱缩,核染色质浓集呈球形.MTT实验结果显示各组药物血清均可抑制HSC-T6细胞的增殖,SJG-M、SJG-H组对HSC-T6细胞增殖的抑制均显著高于Sily组(P<0.05),SJG-L组与Sily组对HSC-T6 细胞增殖的抑制无显著差异(P>0.05).SJG-M、SJG-H组凋亡率分别为(7.09±1.04)%、(11.63±1.53)%,显著高于Sily组[(4.38±1.07)%]、SJG-L组[(4.17±0.30)%]和对照组[(1 74±0 11)%].与对照组比较,各药物血清干预组细胞凋亡数明显增加,以SJG-H组增加为明显.结论 SJG含药血清可显著抑制HSC-T6细胞的活化、增殖,并诱导其凋亡.
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鳖甲煎改良方含药血清对肝星状细胞增殖、周期及凋亡的影响
目的 探讨鳖甲煎改良方含药血清对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)-T6增殖、周期及凋亡的影响.方法 分别用高剂量[28.4 g/(kg·d)]、中剂量[14.2g/(kg·d)]与低剂量[7.1 g/(kg·d)]的鳖甲煎改良方及与鳖甲煎改良方高剂量相同剂量的鳖甲煎丸灌胃大鼠以制备含药血清.将等体积不同剂量的鳖甲煎改良方含药血清分别处理HSC-T6细胞,以等体积鳖甲煎丸含药血清处理的细胞为阳性对照组,生理盐水处理的细胞为空白对照组,正常大鼠血清处理的细胞为正常对照组.CCK-8检测不同处理组HSC-T6细胞的增殖情况,并绘制其增殖曲线;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测经不同处理的HSC-T6细胞的周期,Annexin V-PI染色法检测其凋亡;在mRNA及蛋白水平分别检测经不同处理的HSC-T6细胞的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)基因及其编码蛋白的表达变化.结果 CCK-8检测结果显示,鳖甲煎改良方含药血清对HSC-T6细胞增殖具抑制作用,高剂量与中剂量组的增殖速度慢于正常对照组、阳性对照组和空白对照组(P ＜0.05,P＜0.01),且该抑制作用呈剂量-效应关系.FCM检测证实,鳖甲煎改良方含药血清可将HSC-T6细胞阻滞于S期,能诱导HSC-T6细胞的凋亡,与正常对照组比较,其凋亡诱导率差异具有统计学意义(P＜0.01).mRNA与蛋白水平检测结果显示,与空白对照组和阳性对照组比较,高剂量组能在基因与蛋白水平显著下调HSC-T6细胞PCNA的表达.结论 鳖甲煎改良方含药血清能明显抑制HSC-T6细胞的增殖,诱导HSC-T6细胞的凋亡,并能下调其PCNA基因及其编码蛋白的表达.
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Nrf2通路在齐墩果酸所致肝纤维化中的作用研究
目的 以HSC-T6细胞为模型,研究Nrf2通路对齐墩果酸所致肝纤维化的影响.方法 设置空白组、低剂量组(10μmol/L)、中剂量组(20 μmol/L)、高剂量组(40μmol/L),给予齐墩果酸24 h后检测α-SMA与核内Nrf2蛋白表达以及Ⅰ型胶原含量;分别采用siRNA沉默、Sulforaphane(SFN)激动Nrf2后,给予齐墩果酸,检测α-SMA与核内Nrf2蛋白表达以及Ⅰ型胶原含量的变化.结果 ①给予齐墩果酸后,核内Nrf2蛋白表达上调,中高剂量组α-SMA蛋白表达上调,Ⅰ型胶原含量明显增多;②空白组与低剂量组采用siRNA沉默Nrf2后,α-SMA蛋白表达上调、Ⅰ型胶原含量增多,高剂量组采用siR-NA沉默Nrf2后,α-SMA蛋白表达下调,Ⅰ型胶原含量减少;③给予5μmol/L SFN激动Nrf2后,α-SMA蛋白表达下调,与Ⅰ型胶原含量降低.结论 Nrf2通路可以抑制齐墩果酸所致的肝纤维化.
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三甲益肝颗粒含药血清对HSC-T6细胞TGF-β1mRNA和TIMP-1 mRNA 表达的影响
目的:观察三甲益肝颗粒(S-JC)含药血清对肝星状细胞HSC-T6细胞转化生长凶子β1(TGF-B1)mRNA和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)mRNA表达的影响. 方法:不同的剂量的三甲益肝颗粒(1.7,3.4和6.8 g/kg)灌胃大鼠,制备含药血清,作用于HSC-T6细胞48 h,以逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞TGF-β1 mRNA和TIMP-1mRNA表达的影响. 结果:水飞蓟宾组,三甲益肝颗粒低、中、高剂量组的TGF-61 mRNA,TIMP-1 mRNA表达水平分别为1.65±0.05,1.67±0.04,1.23±0.07,0.72±0.02,2.23±0.12,2.17±0.12,1.41±0.03,0.49±0.09,与对照组的TGF-β1 mRNA和TIMP-1 mRNA表达水平(2.11±0.11,2.72±0.11)比较,具有显著性差异(P<0.05). 结论:三甲益肝颗粒降低HSC-T6细胞TGF-β1 mRNA,TIMP-1 mRNA表达水平,从分子水平上证明其抗肝纤维化的作用.
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积雪草酸抑制HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达
目的:研究外源性TGF-β对肝星状细胞系(HSC-T6)的激活作用,以及积雪草酸抑制HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的药理作用.方法:用LDH和MTT实验测定积雪草酸对HSC-T6细胞的细胞毒性和细胞增殖的影响.检测HSC-T6细胞受不同剂量和不同时间TGF-β刺激后表达Ⅰ型胶原蛋白的佳剂量和时间.以不同剂量的积雪草酸作用于TGF-β活化的HSC-T6细胞,提取细胞总蛋白,以Western Blot方法检测积雪草酸对TGF-β活化的HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响.结果:TGF-β刺激HSC-T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白的佳剂量为1 ng/mL,佳时间24 h.10～30 μmol/L积雪草酸可以抑制TGF-β诱导的HSC细胞Ⅰ型胶原蛋白表达.结论:外源性TGF-β可激活HSC-T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白;积雪草酸抑制HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达.
