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复方861对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原基因表达影响的研究
目的:观察复方861对HSC-T6I型胶原(CoI-Ⅰ)基因表达的影响.方法:复方861 0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml等浓度用于HSC-T6细胞48小时,以逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞Col-1基因表达的影响.结果:复方8610.25mg/mll、0.5mg/ml、1.0mg/ml等不同浓度的HSC-T6细胞基因表达水平依次为0.59±0.13、0.29±0.06、0.13±0.01,与空白对照组(2.80±0.60)比较,可明显抑制Col-Ⅰ mRNA水平(P＜0.01或P＜0.001).结论:复方861抑制HSC-T6细胞Col-Ⅰ mRNA水平,从而抑制胶原的合成,是其抗肝纤维化的作用机理之一.
关键词： 复方861 HSC-T6细胞 Ⅰ型胶原基因表达逆转录PCR -
总丹参酮对HSC-T6细胞增殖和产生胶原的影响
目的 研究总丹参酮对体外肝星状细胞(HSC-T6)增殖和胶原合成的影响.方法 采用血清刺激HSc-T6细胞,用[3H]-TdR和[3H]-Proline掺入法分别检测其增殖和胶原合成的活性.结果 总丹参酮在1.0～16.0 mg·L<'-1>浓度范围内能够浓度依赖性地抑制血清促进的HSC-T6细胞增殖和产生胶原.结论 总丹参酮对HSC-T6细胞的增殖和产生胶原有明显的抑制作用.该作用可能是总丹参酮抗肝纤维化的机理之一.
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加味四逆散含药血清对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响
目的 观察加味四逆散含药血清对大鼠肝星状细胞-T6 (HSC-T6)增殖与凋亡的影响.方法 以不同浓度的加味四逆散含药血清[(加味四逆散低浓度组(含生药量0.78 g/ml)、加味四逆散中浓度组(含生药量1.56 g/ml)、加味四逆散高浓度组(含生药量3.12 g/ml)]作用于体外培养的HSC-T6细胞,作用时间分别为12、24、48 h后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组HSC-T6.采用流式细胞仪和TUNEL法检测对HSC-T6凋亡的影响.结果 ①加味四逆散含药血清作用于大鼠HSC-T6后,细胞增殖受到抑制,呈时间和浓度依赖性,加味四逆散各浓度组与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)；加味四逆散高浓度组[48 h:(0.399±0.041)％]与鳖甲软肝片组[48 h:(0.429±0.037)％]比较差异有统计学意义(P＜0.05).②流式细胞仪分析结果:与空白对照组比较,加味四逆散各浓度组、复方鳖甲软肝片组与HSC作用12、24、48 h后,细胞凋亡增加.与鳖甲软肝片组[12 h:(8.31±0.30)％,24 h:(16.25±0.25)％,48 h:(27.12±0.39)％]比较,加味四逆散中浓度组[12h: (17.83±0.25)％,24 h:(26.06±0.26)％,48h:(39.30±2.25)％]、加味四逆散高浓度组[12h:(27.15±0.29)％,24h:(38.96±0.51)％,48h:(49.34±0.77) ％]细胞凋亡均增加(P＜0.05).③TUNEL检测,与鳖甲软肝片组[(30.0±3.92) ％]比较,加味四逆散各浓度[低浓度组(25.1±1.48)％、中浓度组(39.30±2.25)％、高浓度组(39.30±2.25)％]药物血清作用48 h后,细胞凋亡率均增加(P＜0.01).结论 加味四逆散含药血清可抑制体外HSC-T6的增殖、促讲其凋亡,以高剂量作用48 h明显.
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复方861含药血清对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达影响的研究
观察复方861含药血清对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原(CoL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(CoL-Ⅲ)mRNA表达影响.以不同剂量复方861灌胃大鼠制备的含药血清,作用HSC-T6细胞48h,应用逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达的影响.结果表明:复方8610.5、1.0、2.0、6.0g/kg等不同剂量含药血清HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达.与空白对照组比较,具有显著性(P＜0.05或P,0.01).因此,复方861可降低HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达水平,具有抗肝纤维化作用.
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柴竭抑肝纤对大鼠肝星状细胞增殖和TGF-β1/Smad信号通路的影响
目的:研究保肝护肝中药复方柴竭抑肝纤(CJYGX)通过肝星状细胞治疗肝纤维化的作用机制.方法:培养肝星状细胞T6 (hepatic stellate cell T6,HSC-T6),设空白组、秋水仙碱1.0 mg·L-1组和200,100,50,25,12.5,6.25 mg·L-1质量CJYGX组,作用24 h后通过细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测HSC-T6细胞的增殖情况,筛选合适的CJYGX药物浓度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测CJYGX(200,100,50 mg·L-1)作用HSC-T6细胞24 h后转化生长因子-β1(TGF-β1),信号转导蛋白Smad2,Smad3,Smad4,Smad7 mRNA表达变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CJYGX(200,100,50 mg·L-1)作用HSC-T6细胞24 h后TGF-β1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化.结果:①与空白组比较,200,100,50 mg·L-1 CJYGX对HSC-T6细胞具有显著的抑制增殖作用(P＜0.05).②200,100,50 mg·L-1CJYGX显著下调TGF-β1,Smad2,Smad3 mRNA的表达(P ＜0.05);200,100 mg·L-1 CJYGX显著下调Smad4 mRNA表达,并显著上调Smad7 mRNA表达(P＜0.05).③200,100 mg·L-1CJYGX显著下调HSC-T6细胞TGF-β1和α-SMA蛋白表达(P＜0.05).结论:CJYGX能抑制HSC-T6细胞的增殖,其作用机制与TGF-β1/Smad通路有关.
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基于血浆药理学的鳖甲超微粉抗肝纤维化作用研究
目的 用血浆药理学方法,体外观察鳖甲超微粉含药血浆抗肝纤维化作用.方法 采用体外肝纤维化细胞模型,以大鼠含药血浆对HSC-T6细胞增殖的影响为指标,采用效应动力学方法,确定大鼠给药方案和采血时间,并优选体系中血浆添加量.制备鳖甲超微粉和普通粉含药血浆,MTT法检测含药血浆对HSC-T6细胞增殖的影响,ELISA法测定含药血浆对HSC-T6细胞胶原分泌的影响.结果 鳖甲超微粉和普通粉含药血浆对HSC-T6细胞增殖和Ⅰ型胶原合成均有显著抑制作用(P＜0.01),超微粉组的抑制作用强于普通粉组,且有显著性差异(P＜0.01).结论 鳖甲超微粉碎后可提高其抗肝纤维化疗效.
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美洲大蠊抗肝纤维化活性部位的筛选
目的 结合体外活性筛选,对美洲大蠊提取物进行分离、纯化与活性追踪,以便获得抗肝纤维化活性较强部位.方法 用5倍量95％,90％,80％,70％,60％,50％的乙醇溶液和水制备美洲大蠊冻干粉,分别命名为美蠊-A(ML-A)、美蠊-B(ML-B)、美蠊-C(ML-C)、美蠊-D(ML-D)、美蠊-E(ML-E)、美蠊-F(ML-F)、美蠊-G(ML-G).将细胞分为3组:正常组、空白组(不含细胞)和给药组(美洲大蠊冻干粉溶液:1000,250,62.5,15.63,3.91,0.98 μg·mL-1).用MTT法对美洲大蠊不同溶剂提取物进行抗肝纤维化活性筛选,用HP20大孔树脂对筛选得到的活性部位进行分离与纯化,进行体外活性追踪.结果 美洲大蠊提取物ML-D对HSC-T6细胞有一定的抑制作用,其48 h的IC50值为389 μg·mL-1.分离ML-D得ML-D1、ML-D2、ML-D3、ML-D4、ML-D5、ML-D6和ML-D7洗脱部位,其中ML-D5、ML-D6、ML-D7及其合并物ML-HB对HSC-T6细胞细胞的生长有良好的抑制作用,48 h的IC5o值分别为115.6,116.5,121.8和110.0 μg·mL-1.结论 从美洲大蠊中提取分离得到活性部位ML-HB对HSC-T6细胞的增殖有较好的抑制作用.
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红花促进肝星状细胞胶原降解的分子机制
[目的]观察红花对肝星状细胞有关胶原降解基因表达的影响.[方法]ELISA法检测细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量,逆转录多聚酶链反应检测间质性胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达水平.[结果]与对照组比较,红花组细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量明显降低(P＜0.01),红花组间质性胶原酶基因表达水平明显增强(P＜0.01),而金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达水平明显下降(P＜0.01).[结论]红花的抗肝纤维化作用可能部分是通过增强间质性胶原酶基因表达,同时抑制金属蛋白酶组织抑制因子基因表达而完成的.
关键词： HSC-T6细胞 红花 胶原 间质胶原酶 金属蛋白酶组织抑制因子-1 -
加味四逆散含药血清对HSC凋亡影响的实验研究
目的:观察加味四逆散含药血清对大鼠肝星状细胞( HSC-T6)凋亡的影响.方法:以不同浓度的加味四逆散含药血清作用于体外培养的HSC-T6细胞,分别作用12h、24h、48h后,采用流式细胞仪和TUNEL法检测加味四逆散对HSC-T6凋亡的影响.结果:(1)流式细胞仪分析结果显示:加味四逆散各浓度组、复方鳖甲软肝片组与HSC作用12h、24h、48h后,细胞凋亡与空白对照组比较均有差异(P＜0.05)；与鳖甲软肝片组比较,除加味四逆散低浓度组作用12h时细胞凋亡无差异外(P＞0.05),其余各浓度组细胞凋亡均优于鳖甲软肝片组,差异有统计学意义(P＜0.05)；(2)TUNEL检测表明:加味四逆散各浓度药物血清作用48h后,细胞凋亡率与空白对照组及鳖甲软肝片组药物血清比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:加味四逆散含药血清可显著促进HSC-T6凋亡,且以高剂量和作用48h为明显.
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携带rIL-10基因的大鼠肝细胞及肝星状细胞对TGF-β1表达的影响
目的:观察携带大鼠白介素10(rIL-10)基因的正常大鼠肝细胞(BRL)及大鼠肝星状细胞(HSC-T6)是否可通过旁分泌作用或自分泌作用减少肝星状细胞分泌转化生长因子β1(TGF-β1),进一步探讨rIL-10抗纤维化的作用机制.方法:IL-10基因通过尾静脉高压注射干预猪血清诱导肝纤维化大鼠,造模结束时收集各实验组大鼠血浆;通过半乳糖受体介导的脂质体转染试剂及阳离子脂质体转染试剂将携带rIL-10基因的pCDNA3-rIL-10质粒与pCDNA3空质粒转染大鼠BRL细胞及HSC-T6细胞,收集转染后24及48小时细胞培养上清;另将携带pCDNA3-rIL-10质粒与pCDNA3空质粒的大鼠BRL细胞与HSC-T6细胞共培养,收集共培养24及48小时后细胞培养上清液;ELISA法检测各实验组细胞培养上清液中TGF-β1的表达.结果:rIL-10基因干预后的肝纤维化大鼠血浆中TGF-β1表达下降,携带rIL-10基因的BRL细胞及HSC-T6细胞可表达高浓度细胞因子rIL-10,HSC-T6分泌的rIL-10能减少自身表达TGF-β1水平,BRL细胞表达rIL-10通过旁分泌作用可抑制与之共培养HSC-T6上清中TGF-β1的表达.结论:rIL-10基因可通过旁分泌或自分泌作用抑制肝星状细胞分泌转化生长因子β1,进一步阐明rIL-10基因的抗纤维化作用机理.
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复方861对HSC-T6细胞基质分解素1mRNA表达水平影响的研究
为观察复方861对HSC-T6细胞基质分解素1(MMP3)mRNA表达水平的影响,复方861以0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml等浓度作用于HSC-T6细胞48小时,以逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞MMP3 mRNA表达水平的影响.结果表明,复方861 0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml等不同浓度的HSC-T6细胞mRNA表达水平依次为2.75±0.35、3.00±0.01、3.50±0.71,与空白对照组比较,可明显提高MMP3mRNA表达水平(P《0.05或P《0.01).因此,复方861提高HSC-T6细胞MMP3 mRNA表达水平,可能是其促进胶原降解,抗肝纤维化的作用机理之一.
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转化生长因子-β1促进miR-181a表达诱导肝星状细胞-T6细胞活化
目的 观察转化生长因子-β1 (TGF-β1)对miR-181a表达的影响,以及miR-181a对体外培养的肝星状细胞(HSC) T6细胞的作用.方法 TGF-β1处理HSC-T6细胞后,检测miR-181a和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.miR-181a mimics转染HSC-T6细胞后,Western印迹检测α-SMA和Ⅰ型胶原a2链(collagen I a2,Col Ⅰ A2)蛋白表达,CCK-8计数法检测细胞增殖.结果 TGF-β1处理组细胞中miR-181a和miR-181b表达量较对照组细胞明显升高,miR-181a转染组细胞中α-SMA和ColI A2表达量明显高于对照组细胞,miR-181a对HSC-T6增殖无明显影响.结论 在HSC-T6中,TGF-β1促进miR-181a表达,miR-181a可促进HSC-T6细胞活化和分泌胶原,进一步明确了TGF-β1促进HSC-T6活化的机制.
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柴胡皂苷d对氧化应激诱导的HSC-T6活化细胞内AP-1、NF-κB表达的影响及其雌激素受体机制
目的：研究柴胡皂苷d（SSd）对氧化应激诱导的肝星状细胞HSC-T6活化细胞内AP-1、NF-κB表达的影响及其雌激素受体（ER）机制，探讨植物雌激素对肝纤维化的作用机制，为临床应用植物雌激素提供理论依据。方法：体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6，采用免疫组化法，检测SSd对氧化应激诱导的HSC-T6活化细胞内α-SMA蛋白表达的影响；采用Western blot法，观察SSd对氧化应激诱导的HSC-T6活化细胞内AP-1、NF-κB表达的影响。结果：氧化应激处理HSC-T6细胞后，α-SMA、AP-1和P65/NF-κB表达明显增加。如使用雌二醇（E2）或SSd预处理HSC-T6细胞24h后再接受氧化应激处理，三种蛋白表达明显降低，这种作用可被雌激素受体（ER）完全拮抗剂ICI-182780和ERβ拮抗剂THC抑制。结论：E2、SSd可能通过调控ERβ，进而抑制核转录因子AP-1和P65/NF-κB的表达起到抑制HSC-T6活化的作用。
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氧化苦参碱黄芩苷组合物抗乙型肝炎病毒和抗肝纤维化的体外实验
目的 研究氧化苦参碱黄芩苷组合物(OB)体外抗乙型肝炎病毒和抗肝纤维化的作用.方法 培养HepG2.2.15细胞和大鼠HSC-T6细胞,分别使用OB或者氧化苦参碱处理.采用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg含量.收集HSC-T6细胞抽提总RNA,使用半定量RT-PCR法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原基因表达量;抽提细胞总蛋白,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,使用Western blot检测α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达量.结果 OB对乙型肝炎病毒抗原分泌抑制作用显著优于单独使用氧化苦参碱(两者对HBsAg抑制率的比较为:P=0.043;HBeAg为:P=0.026).OB处理组的α-SMA含量不仅在转录水平而且在翻译水平显著低于氧化苦参碱组(mRNA:P=0.013,蛋白:P=0.042);OB处理组的Ⅰ型胶原表达量同样显著低于氧化苦参碱组(mRNA:P＜0.01;蛋白:P＜0.01).结论 OB对HepG2.2.15细胞分泌乙型肝炎病毒抗原和HSC-T6细胞表达α-SMA和Ⅰ型胶原有抑制作用,且显著优于氧化苦参碱.
关键词： HepG2.2.15细胞 HSC-T6细胞 氧化苦参碱 黄芩苷 -
脯氨酰寡肽酶抑制剂体外对肝星状细胞凋亡、增殖和肝纤维化相关基因表达的影响
目的 体外探讨肝星状细胞(HSC)脯氨酰寡肽酶(POP)的生物学功能,以进一步阐述其在肝脏炎症和纤维化发生发展中的作用.方法 取HSC-T6细胞,经不同浓度的POP抑制剂(S17092)处理,采用ELISA法检测HSC-T6细胞N- 乙酰基- 丝氨酸- 天冬氨酸- 赖氨酸- 脯氨酸(Ac-SDKP)水平,使用流式细胞术和CCK8检测HSC-T6凋亡和增殖水平,采用实时定量-PCR法检测相关炎症和肝纤维化基因转化生长因子-β1(TGF-β1)、α- 平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、Ⅰ型胶原(Col I)水平,采用Western blot法检测相关蛋白(POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ)表达.结果 与对照组比,POP抑制剂干预组细胞内Ac-SDKP水平显著下降(P<0.05);POP被抑制后对HSC-T6凋亡没有显著的影响(P>0.05),但可抑制其增殖(P<0.05);与对照组比,抑制剂组HSC内α-SMA蛋白表达显著升高(P<0.05),而Smad7和PPAR-γ蛋白表达显著下降(P均<0.05);抑制剂组HSC内MCP-1和α-SMA mRNA水平显著上调(P均<0.05).结论 POP在肝星状细胞内可能发挥重要的抗炎抗纤维化作用,其机制可能与其调节Ac-SDKP及Smad7和PPAR-γ的表达有关.
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携TIMP-1基因RNAi慢病毒载体感染大鼠HSC-T6细胞抑制目的基因表达
目的：验证构建成功的携基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）基因特异性小干扰RNA的慢病毒载体对目的基因表达的抑制效应。方法以慢病毒质粒感染HSC-T6细胞，在感染6天和8天后，观察慢病毒感染效率；采用定量PCR法检测TIMP-1 mRNA水平变化；采用免疫印迹法检测TIMP-1蛋白表达变化。结果在慢病毒载体感染6天时，TIMP-1 mRNA水平较正常对照组下降约0.668倍[2-ΔΔCt为（0.668±0.046）]，下降程度明显高于阴性对照组[2-ΔΔCt为（1.001±0.041），（P<0.05）]；在慢病毒感染6天和8天时，RNAi组对TIMP-1蛋白表达具有明显的抑制作用，且以感染第6天为显著。结论构建成功的携TIMP-1基因特异性RNAi慢病毒载体能有效感染HSC-T6细胞，并抑制目的基因的表达。
关键词： HSC-T6细胞 基质金属蛋白酶组织抑制因子-1 RNA干扰 慢病毒 -
慢病毒载体介导的结缔组织生长因子基因沉默对下游基因的影响
目的 利用RNA干扰技术,以慢病毒为载体,介导结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默,并观察其对下游基因表达的影响.方法 用构建的CTGF小干扰RNA(siRNA)慢病毒转移质粒与包装质粒、包膜蛋白质粒共转染293T细胞,包装成介导CTGF基因沉默的慢病毒载体;感染肝星状细胞系HSC-T6,应用Real-time PCR和Western免疫印迹法筛选基因沉默效率高的慢病毒载体;再根据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测感染效率;应用Real-time PCR法检测CTGF基因沉默后HSC-T6中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2和Ⅰ型胶原mRNA表达水平.结果 包装的慢病毒载体感染HSC-T6细胞的效率高于50%;感染HSC-T6细胞后,CTGF的表达在mRNA和蛋白水平均受到明显抑制,其中TS1具有佳的抑制效率;HSC-T6细胞CTGF基因沉默后,其TIMP-1、TIMP-2和Ⅰ型胶原mRNA水平也显著降低.结论 包装的慢病毒载体在HSC-T6中具有较好的感染效率和CTGF基因沉默效果,基因沉默后可进一步抑制HSC-T6细胞TIMP-1、TIMP-2和Ⅰ型胶原的基因表达,这在抗纤维化的研究中具有积极的意义.
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当归芍药散含药血清对ET-1诱导的HSC-T6细胞收缩的影响
目的:通过体外实验研究当归芍药散含药血清对ET-1诱导的肝星状细胞(HSC-T6细胞)收缩的作用.方法:采用FITC-鬼笔环肽细胞骨架染色方法观察HSC-T6细胞肌动蛋白丝变化的数量;采用Ⅰ型鼠尾胶原法观察HSC-T6细胞收缩的影响.结果:当归芍药散含药血清各剂量组能有效抑制肌动蛋白丝数量增多;在第24 h,模型组(ET-1)的胶原凝胶面积明显缩小(P＜0.01);当归芍药散含药血清各剂量组可以不同程度地抑制ET-1(10 nmol/L)引起的HSC-T6细胞胶原凝胶收缩(P＜0.05).结论:当归芍药散含药血清可以抑制ET-1诱导的HSCs收缩.
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大黄素对HSC-T6细胞增殖及细胞周期影响的研究
目的研究大黄素干预对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)增殖和细胞周期的影响,探讨其抗肝纤维化的具体机制.方法 应用大鼠肝星状细胞株T6传代培养,采用不同浓度大黄素进行干预,观察各组细胞在形态学、增殖程度、细胞周期、增殖细胞核抗原(PCNA)表达等多方面的变化.结果①5～15mg/L浓度大黄素干预24h后,对T6细胞的增殖产生显著的抑制效应,同时免疫组化显示PCNA标记指数随着药物浓度的增高其表达阳性率反而逐渐降低.②大黄素同时能够对T6细胞的细胞周期产生阻滞作用,随着浓度的增高,G0/G1期细胞比例逐渐上升.结论大黄素在体外对于HSC-T6的增殖具有明显的抑制作用,而这种作用可能是通过改变了T6细胞正常的细胞周期来实现的.
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软肝抗纤方对肝贮脂细胞Ⅰ型胶原 mRNA表达的影响
[目的]观察软肝抗纤方对肝贮脂细胞(HSC-T6)Ⅰ型胶原(Col-I)mRNA表达的影响.[方法]以软肝抗纤方灌胃大鼠制备的不同浓度含药血清,作用于HSC-T6细胞48 h,应用逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞Col-I mRNA表达的影响.[结果]软肝抗纤方不同浓度的含药血清(5%、10%、20%)与氯化钠组(0.9%)比较,对HSC、T6细胞Col-1 mRNA表达,各组差异均有统计学意义,其中5%,10%组可抑制HSC-T6细胞Col-ⅠmRNA表达水平.[结论]软肝抗纤方可抑制HSC-T6细胞Col-I mRNA表达水平,具有抗肝纤维化作用.
