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加味小柴胡汤对顺铂诱导的BRL细胞相关凋亡蛋白表达的影响
目的:探讨加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝BRL细胞凋亡蛋白表达的调控作用.方法:将培养的BRL细胞分为空白组、顺铂组、实验1组(加味小柴胡汤大剂量)、实验2组(小剂量)4组.采用MTT、TUNEL、DNA琼脂糖凝胶电泳、免疫组化、完整细胞蛋白质斑点印迹等方法,检测各组细胞存活率、凋亡率及细胞相关凋亡蛋白的变化.结果:顺铂组细胞凋亡率比空白组明显升高,Rb、p21、Caspase-3、Bax、wp53蛋白表达上调;存活率显著降低,Bcl-2、mp53表达下调;实验1组、2组凋亡率明显较顺铂组降低,存活率升高,其他各指标皆与顺铂组有明显差异,1组作用更明显.结论:加味小柴胡汤可使顺铂诱导的BRL细胞存活率升高,凋亡率降低,对顺铂诱导BRL细胞凋亡蛋白的异常表达有调控作用.
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加味小柴胡汤对顺铂诱导BRL细胞核转录因子和热休克蛋白70表达的影响
目的 观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝BRL细胞核转录因子-kB(NF-kB)、热休克蛋白70(HSP70)表达的影响.方法 将BRL细胞分为4组:空白组、顺铂组及加味小柴胡汤大、小剂量组.采用完整细胞蛋白质斑点印迹、免疫组织化学等方法,检测各组细胞NF-kB、HSP70变化.结果 顺铂组NF-kB表达明显较空白组升高,HSP70 表达降低,组间比较差异有统计学意义;加味小柴胡汤大、小剂量组NF-kB明显较顺铂组低,差异有统计学意义;加味小柴胡汤大、小剂量组HSP70表达均升高,但仅加味小柴胡汤大剂量组差异明显.结论 加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达,上调HSP70表达,此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡重要机理之一.
关键词： BRL细胞 顺铂 加味小柴胡汤 细胞核转录因子-kB 热休克蛋白70 -
胱硫醚γ-裂解酶产生的内源性硫化氢对脂多糖诱导大鼠肝细胞凋亡的调节作用
目的 探讨内源性胱硫醚γ-裂解酶(CSE)/硫化氢(H2S)体系在脂多糖(LPS)诱导的肝细胞凋亡中的调节作用.方法 培养大鼠正常肝细胞系BRL.实验随机分组为溶剂对照组、siRNA阴性对照组、CSE siRNA组、LPS组、CSE siRNA+LPS组.设立时间点为0h、4h、12h、24h;每组4个平行样.通过LPS孵育大鼠肝细胞系BRL不同时间,造成细胞损伤模型,以培养液上清中LDH活性反映细胞损伤程度.通过RT-PCR与Western blot检测CSE基因、蛋白表达,用去蛋白法检测H2S生成情况;应用RNAi干扰技术,成功转染CSE siRNA于肝细胞中,降低LPS引起的内源性H2S生成增多.通过荧光染色法检测BRL细胞线粒体膜电位(MMP)变化,通过Western blot检测胞浆细胞色素C蛋白表达变化,应用流式细胞术检测BRL细胞凋亡率变化情况.结果 LPS可显著提高CSE基因、蛋白的表达,并使H2S生成增多.同时也可使MMP降低并导致细胞凋亡率的增加.通过RNAi干扰技术,成功转染CSE siRNA于肝细胞系BRL中,降低LPS引起的内源性H2S生成增多.与LPS单独作用BRL细胞相比,LPS作用转染后BRL细胞可导致MMP在短时间点降低,而在长时间点出现逐渐增加趋势;相应的细胞凋亡率则出现相反的趋势.结论 在LPS诱导的细胞凋亡过程中,内源性CSE/H2S体系表现为早期抑制凋亡,晚期促进凋亡的特点.
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胱硫醚β-合酶/胱硫醚γ-裂解酶-硫化氢体系小干扰RNA对大鼠正常肝细胞株BRL凋亡的影响
目的：探讨内源性胱硫醚β-合酶（CBS）/胱硫醚γ-裂解酶（CSE）-硫化氢（H2S）体系在生理状态肝细胞凋亡中的作用及其机制。方法培养大鼠正常肝细胞株BRL。小干扰RNA（siRNA）序列筛选：设阴性siRNA序列转染组（对照组）、CBS siRNA序列转染组（CBS 1~3序列组）和CSE siRNA序列转染组（CSE 1~3序列组），转染24、48 h；siRNA转染后检测细胞凋亡：设阴性对照组、溶剂对照组、CBS siRNA组、CSE siRNA组、（CBS+CSE）siRNA组，作用时间为转染后0、4、8、12、24 h；凋亡机制探讨：设阴性对照组、CBS siRNA组、CSE siRNA组、（CBS+CSE）siRNA组，作用时间为转染后4、8、12、24 h；每组均4个平行样。RT-PCR、Western blot检测BRL细胞中CBS、CSE mRNA和蛋白的表达，siRNA基因静默CBS、CSE，去蛋白法检测H2S生成，Hoechst荧光染色、流式细胞术检测BRL细胞凋亡，荧光染色检测线粒体膜电位（MMP）变化，Western blot 检测胞浆内细胞色素 C（Cyt C）和激活型 caspase 3（cleaved-caspase 3）蛋白表达变化。结果 BRL细胞株存在CBS、CSE表达。CBS/CSE siRNA转染后，细胞内源性H2S生成降低，凋亡细胞数量和细胞凋亡率随时间延长而逐渐增加，BRL细胞上清乳酸脱氢酶（LDH）活性均未见明显变化，MMP下降，胞浆内Cyt C蛋白表达上调，cleaved-caspase3蛋白表达上调。结论抑制内源性H2S体系可引起生理状态肝细胞凋亡，机制可能部分涉及凋亡线粒体途径。
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分泌型rIL-10基因在正常大鼠肝细胞系BRL中的稳定表达
目的:建立稳定表达分泌型大鼠白细胞介素10(rIL-10)基因的正常大鼠肝细胞系(BRL细胞),为研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础.方法:通过RT-巢式PCR技术从大鼠外周血单核细胞(PBMC)中扩增出rIL-10全长基因,克隆入pcDNA3真核表达载体构建重组表达载体pcDNA3-rIL-10.鉴定正确后,用受体介导的脂质体转染试剂将pcDNA3-rIL-10转染BRL细胞,高浓度G418筛选,RT-PCR及ELISA法证实rIL-10在BRL细胞中的稳定表达.结果:构建的真核表达载体pcDNA3-rIL-10经质粒双酶切及测序鉴定证实载体构建的正确性.RT-PCR及ELISA法检测出经G418筛选的BRL细胞稳定表达IL-10.结论:成功构建分泌型pcDNA3-rIL-10真核表达质粒及筛选出稳定表达分泌型rIL-10的BRL细胞株,为进一步研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础.
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携带rIL-10基因的大鼠肝细胞及肝星状细胞对TGF-β1表达的影响
目的:观察携带大鼠白介素10(rIL-10)基因的正常大鼠肝细胞(BRL)及大鼠肝星状细胞(HSC-T6)是否可通过旁分泌作用或自分泌作用减少肝星状细胞分泌转化生长因子β1(TGF-β1),进一步探讨rIL-10抗纤维化的作用机制.方法:IL-10基因通过尾静脉高压注射干预猪血清诱导肝纤维化大鼠,造模结束时收集各实验组大鼠血浆;通过半乳糖受体介导的脂质体转染试剂及阳离子脂质体转染试剂将携带rIL-10基因的pCDNA3-rIL-10质粒与pCDNA3空质粒转染大鼠BRL细胞及HSC-T6细胞,收集转染后24及48小时细胞培养上清;另将携带pCDNA3-rIL-10质粒与pCDNA3空质粒的大鼠BRL细胞与HSC-T6细胞共培养,收集共培养24及48小时后细胞培养上清液;ELISA法检测各实验组细胞培养上清液中TGF-β1的表达.结果:rIL-10基因干预后的肝纤维化大鼠血浆中TGF-β1表达下降,携带rIL-10基因的BRL细胞及HSC-T6细胞可表达高浓度细胞因子rIL-10,HSC-T6分泌的rIL-10能减少自身表达TGF-β1水平,BRL细胞表达rIL-10通过旁分泌作用可抑制与之共培养HSC-T6上清中TGF-β1的表达.结论:rIL-10基因可通过旁分泌或自分泌作用抑制肝星状细胞分泌转化生长因子β1,进一步阐明rIL-10基因的抗纤维化作用机理.
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miR-34a在辐射损伤时对细胞周期的调控作用
目的:探讨60Coγ射线诱发大鼠肝脏BRL细胞辐射损伤时p53激活诱导的miR-34a改变对细胞周期的调控作用.方法 以大鼠BRL肝细胞为研究对象,予4 Gy60Coγ射线照射后,分别培养4、12、24、48 h.采用流式细胞技术检测各组BRL细胞周期的变化,实时定量PCR检测各组细胞中miR-34a mRNA和c-myc mRNA表达水平的变化,Western blot方法检测各组细胞中p53蛋白和Myc蛋白的表达.结果 60Co γ射线4 Gy照射后4h即出现G2期阻滞(P＜0.05),至照射后24h,G2期阻滞恢复；照射后12h起,S期细胞减少(P＜0.05),出现G1阻滞,48 h仍未恢复.照射后4hp53蛋白和miR-34a mRNA表达增加(P＜0.05),12 h均有下降(P＜0.05),24h和48 h已基本回至正常水平,而c-myc在照射后4h开始呈持续降低趋势,48 h有所恢复.结论 细胞在电离辐射引起DNA损伤后,早期即激活了p53蛋白,p53蛋白调节miR-34a表达,可能再经由miR-34a的靶基因c-myc介导,使细胞阻滞于G1和(或)G2期进行DNA修复.
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水溶性低分子量壳聚糖对辐射诱导正常肝细胞株BRL损伤的影响
目的 研究水溶性低分子量壳聚糖(WSC)对辐射照射后正常肝细胞株BRL损伤的影响.方法 体外培养的BRL细胞分为4 Gy照射组(A组)、4 Gy照射+WSC 1.56、12.50、25.00、50.00 μg/ml组(分别为B1、B2、B3、B4组)和对照组(C组).照射后24、48 h,采用Annexin V-FITC/PI双染法和Flou-3AM法分别检测BRL细胞凋亡和胞内钙离子荧光强度.克隆形成实验分析BRL细胞生存率的变化,以多靶单击数学模型拟合方程计算WSC对细胞的保护系数(PF)并评价其辐射防护效果.结果 与C组相比,A组细胞凋亡率、胞内钙离子荧光强度增加(P＜0.05),而WSC能明显逆转上述指标的变化(P＜0.05).细胞凋亡率和胞内钙离子浓度呈良好的线性关系(y=1.03x-7.47,R2=0.9994).克隆形成实验结果表明,WSC处理后的各组PF值均大于1.结论 WSC能抑制电离辐射诱导的细胞凋亡,可能与WSC抑制细胞内钙超载有关.
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戊二酰辅酶A脱氢酶基因沉默及高浓度赖氨酸对BRL肝细胞活性的影响
目的 探讨戊二酰辅酶A脱氢酶(GCDH)基因沉默和赖氨酸代谢物蓄积对肝细胞活性的影响.方法 将BRL肝细胞分为正常对照组、阴性对照组和GCDH沉默组.构建含靶向沉默GCDH基因的shRNA慢病毒载体,分别用该病毒和阴性对照病毒感染GCDH沉默组和阴性对照组BRL肝细胞.感染后细胞再用含5 mmol/L赖氨酸培养基培养.免疫荧光技术检测慢病毒感染效率;Western blot法检测GCDH蛋白表达水平;MTT法检测细胞活性,Hoechest 33342染色检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞凋亡的经典指标Caspase3水平.结果 构建的慢病毒可有效沉默肝细胞GCDH表达(P<0.01).MTT及Hoechest 33342染色检测各组间细胞活性及细胞凋亡比较差异无统计学意义(P>0.05).Caspase3蛋白表达在各组间比较差异亦无统计学意义(P>0.05).结论 GCDH基因沉默和赖氨酸代谢物蓄积对肝细胞无明显损伤作用.
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铜对大鼠肝细胞凋亡的影响以及姜黄素的保护作用
目的 探讨铜对大鼠肝细胞(BRL细胞)凋亡的诱导作用及其机制,研究姜黄素对BRL细胞铜损伤时的影响.方法 对硫酸铜(CuSO4)和姜黄素干预培养的BRL细胞,采用荧光探针DCFH-DA进行活性氧(ROS)测定,MTT法检测细胞活力,Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡.Western blot法检测磷酸化应激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)蛋白水平.结果 铜处理后6h BRL细胞ROS和凋亡率达到高峰,分别为711.70±68.33,(45.08±1.87)%,铜处理后24h JNK磷酸化率上升至(63.36±2.24)%,与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.01);姜黄素组ROS、凋亡百分率和JNK磷酸化率均较相应对照组下降(P＜0.01).结论 一定浓度的铜可以诱导BRL细胞的凋亡且与活性氧的产生有关;姜黄素对铜损伤BRL的保护作用与抗氧化和抑制磷酸化JNK的表达有关.
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N-acetylserotonin对H2O2诱导大鼠肝BRL细胞氧化损伤的保护作用
目的:探讨N-acetylserotonin (NAS)对H2O2诱导正常大鼠肝BRL细胞氧化损伤的保护作用.方法:选择正常大鼠肝细胞株BRL,采用H2O2诱导法制备BRL细胞氧化应激损伤模型,HE染色和台盼蓝染色观察细胞形态及细胞存活率的变化;比色法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化.结果:对照组BRL细胞贴壁生长良好,排列紧密,胞膜完整,细胞界限清晰.H2O2诱导后细胞膜皱缩,形态不规则,细胞界限模糊,贴壁能力下降,出现大片细胞缺失;细胞存活率下降;SOD活性降低,而MDA含量升高.NAS可明显改善H2O2 引起的细胞形态变化,使细胞存活率升高,增加SOD活性并降低MDA含量.结论:NAS可通过增强抗氧化系统的激活、减轻抗氧化系统受抑制的程度,发挥对H2O2诱导的BRL细胞氧化损伤的保护作用.
关键词： 氧化性应激 N-acetylserotonin BRL细胞 H2O2 细胞凋亡
